Titrasi Formal Asam Amino [PDF]

Citation preview

TITRASI FORMAL ASAM AMINO I.



II.



Tujuan 1. Menghidrolisis protein dengan enzim protease 2. Membuat kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu dan kurva mg nitrogen asam amino terhadap waktu titrasi formal asam amino Dasar Teori Protein adalah senyawa organik kompleks yang memiliki bobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hydrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Suatu molekul protein disusun oleh sejumlah asam amino tertentu dengan susunan yang sudah tertentu pula dan bersifat turunan (Aisjah Girindra dalam Tika, 2010). Asam amino merupakan ion dipolar yang pada umumnya mempunyai dua atau lebih pKa. Asam amino yang menyusun suatu protein tertentu, kadar asam aminonya tidak sama. Protein jika dihidrolisis akan menghasilkan asam amino bebas. Asam amino tidak larut di dalam eter karena merupakan senyawa dipolar dan dalam air menunjukkan struktur kutub ganda (Zwitter ion) yaitu: H R



C NH 2



H COOH



R



C



COO -



NH 3+



Gambar 1. Struktur dipolar asam amino Dari gambar tersebut, gugus amino diprotonasi dan hadir sebagai ion ammonium, sedangkan gugus karboksil kehilangan protonnya dan hadir sebagai anion karboksilat. Struktur ini konsisten dengan sifat asam amino yang seperti garam, yang memiliki titik leleh agak tinggi. Asam amino bersifat amfoterik artinya berperilaku sebagai asam dan mendonasikan proton pada basa kuat atau dapat juga berperilaku sebagai basa dan menerima proton dari asam kuat. Prilaku ini dinyatakan dalam kesetimbangan berikut untuk asam amino dengan gugus amino dan satu gugus karboksil:



H R



C



H



H COOH



NH 3+



OHH+



R



C



COO -



OHH+



R



NH 3+



asam amino pada pH rendah



Bentuk ion dipolar



C



COO -



NH 2



asam amino pada pH tinggi



Gambar 2. Kesetimbangan asam amino pada berbagai pH Bila suatu protein dihidrolisis, akan didapatkan asam aminonya. Hidrolisis protein dapat dilakukan dengan menggunakan enzim protease dari tripsin. Protein jika dihidrolisis akan menghasilkan asam amino bebas. Asam amino bebas ini bila direaksikan dengan formaldehid berlebih akan membentuk derivate metilol. Reaksi ini menyebabkan asam amino bebas bentuk isoelektrik kehilangan satu proton dari gugus NH3+ (Tika, 2010). NH3+CHRCOO- ↔ H2NCHRCOO- + H+ H2NCHRCOO- + 2HCHO ↔ (HOCH2)2NCHRCOO+ H yang dilepaskan pada reaksi ini dapat dititrasi langsung dengan NaOH sampai dengan pH 8,0 (titik akhir indicator ekuivalen). Titrasi asam amino atau campuran asam amino dalam keberadaan formaldehid disebut dengan titrasi formal asam amino. Titrasi ini merupakan metode analisis untuk mengikuti pembentukan asam amino bebas yang dihasilkan pada proses hidrolisis protein oleh enzim proteotik (Tika, 2010). Pada percobaan ini dibuat kurva titrasi dari asam amino yang diperoleh dari hasil hidrolisis protein dengan menggunakan enzim protease. Selama hidrolisis suatu protein, sejumlah gugus karboksil dan gugus amino bertambah terus. Penentuan secara kuantitatif salah stau gugus akan dapat memberikan indikasi untuk mengetahui derajat hidrolisis protein. Menurut teori zwiiterion, kalau suatu asam amino dalam larutan dititrasi dengan basa, berarti ion hydrogen dari ammonium yang dititrasi. Gugus ammonium dari asam amino yang bersifat buffer pada daerah pH tinggi atau di atas pH 11, sehingga tidak mungkin dititrasi sampai titik akhir. Hal yang sama juga terjadi pada gugus karboksil yang bersifat buffer pada pH rendah sehingga tidak mungkin juga dititrasi dengan basa (Tika, 2010).



Untuk mengatasi hal tersebut, maka formaldehid ditambahkan ke dalam larutan asam amino agar bereaksi dengan gugus amino yang tidak bermuatan sehingga memungkinkan gugus ammonium membuffer pada daerah pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir secara kuantitatif menggunakan indicator (Tika, 2010). Reaksi yang terjadi selama titrasi formal asam amino adalah : H R



C



H



O COO-



+



C H



NH 3 +



R



C



COOH



H



N



CH 2 OH



H



O C H



H



H R



C



COOH



HOH2 C



N



CH 2 OH



dimethilol



H



H



R



C



COOH



HOH 2C



N



CH 2OH



+ NaOH



R



C



COO -Na+



HOH 2C



N



CH 2OH



+ H2O



Gambar 3. Reaksi selama Proses Titrasi Formal Asam Amino



Penambahan formalin ke dalam larutan asam amino akan membentuk dimetilol. Dengan terbentuknya dimetilol berarti gugus amino dari protein sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi titik akhit titrasi sehingga titik akhir titrasi dapat ditentukan dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolptalein (Tika, 2010). Pada praktikum ini digunakan reagen gelatin yang merupakan produk alami yang diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen. Gelatin merupakan protein yang larut dan bersifat gelling agent (bahan pembuat gel). Sumber bahan baku gelatin dapat berasal dari tulang dan kulit dari sapi atau babi. Gelatin terdiri dari glisin dengan komposisi besar, protein dan 4-hidroksi residu. Struktur gelatin adalah sebagai berikut :



O N H



H C



C



O H N



H2 C



C



O NH



CH 3



C



O H N



H C



C



O H N



H2 C



C



O H N



H C



CH2



CH2



CH2



CH2



NH



C



C



NH



C



OH N



HC O



O-



OH



NH CH2 C NH



NH2 +



O



O C



Gambar 4. Struktur Gelatin



III.



Alat dan Bahan 1. Alat – alat No 1 2 3 4 5 6 7 8



Nama Alat Gelas Kimia Buret Statif dan Klem Erlenmeyer Inkubator Air Gelas Ukur Labu Ukur Termometer



Ukuran 100 dan 500 mL 50 mL 100 mL 50 dan 10 mL 100 dan 500 mL 100oC



Jumlah 4 buah 1 buah 1 set 3 buah 1 buah 2 buah 2 buah 1 buah



Konsentrasi 5% 0,2 M dan 0,02 M 0,1 M 1% 40 % 1% -



Jumlah 100 mL 200 mL 50 mL 10 mL 100 mL 15 mL 300 mL



2. Bahan- Bahan No 1 2 3 4 5 6 7 IV.



Nama Bahan Larutan gelatin Larutan NaOH Larutan HCl Larutan fenol ftalein Larutan Formaldehid Larutan tripsin Aquades



Tabel Hasil Pengamatan No 1



Prosedur Kerja Disiapkan 100 mL larutan gelatin



Hasil Pengamatan - Gelatin berupa serbuk berwarna putih kekuningan - NaOH adalah larutan bening tak berwarna



2



3



4



5



6



7



8



9



10 11



12



- Indikator fenolftalein berwarna putih keruh - Larutan gelatin berwarna kuning kecoklatan Sebanyak 110 tetes larutan NaOH ditambahkan sampai terbentuk larutan berwarna merah muda



Ditambahkan ke dalamnya 1 mL fenol ftalein dan larutan NaOH 0,2 M tetes demi tetes sampai larutan berubah warnanya menjadi merah muda Sebanyak 0,1 M HCl Sebanyak 175 tetes larutan HCl ditambahkan ditambahkan tetes demi tetes ke dalam larutan sampai warna larutan kembali sampai teoat warna merah bening kekuningan dengan pH sebesar 8,11 muda hilang (pH= 8,0 ) Larutan gelatin yang telah Larutan direndam dalam incubator air pada dinetralisir direndam dalam suhu 38oC incubator air pada suhu 38oC Pada Tabung lain, sebanyak 25 - Tripsin adalah serbuk berwarna putih mL larutan tripsin ditambahkan - Larutan tripsin berwarna putih keruh 3 tetes fenolftalein dan tetes - Setelah diteteskan 53 tetes NaOH larutan menjadi berwarna merah muda demi tetes larutan NaOH 0,2 M sampai warnanya berubah menjadi merah muda Larutan HCl 0,1 M diteteskan Larutan ditambahkan 85 tetes HCl sehingga sampai warna merah muda warna merah mudanya hilang dengan pH hilang (pH= 8,00) sebesar 8,02 Campuran tersebut diinkubasi Larutan direndam dalam incubator air pada dalam incubator air pada suhu suhu 38oC 38o C selama beberapa menit Larutan tripsin ditambahkan ke Setelah kedua larutan tersebut dicampur , dalam larutan gelatin, dan larutan menjadi berwarna kuning keruh diaduk perlahan Setelah tercampur merata, Diambil campuran sebanyak 10 mL diambil 10 mL campuran dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 100 mL (control /waktu “0” menit ) Dididihkan (untuk merusak Campuran dididihkan selam 3 menit dan warna enzim) selanjutnya didinginkan tetap kuning keruh Sebanyak 15 mL formalin Setelah campuran ditambahkan formalin dan netral dan 3 tetes fenolftalein indikator pp warna larutan tetap kuning keruh ditambahkan ke dalam campuran tersebut Pada interval waktu Setelah dititrasi dengan NaOH 0,02 M warna 15,30,45,60,90 dan 120 menit larutan menjadi merah muda. Adapun Volume



dari waktu ke nol dilakukan hal yang sama seperti pada kontrol. Pada masing- masing reaksi diatas, dilakukan titrasi dengan 0,02 M larutan NaOH sampai titik akhir warna merah muda



V.



NaOH yang diperlukan



No 1 2 3 4 5 6 7



Waktu (menit) Kontrol (0) 15 30 45 60 90 120



Volume NaOH (mL) 14,2 16,6 17,3 18,5 21,0 22,0 23,3



Analisis Data dan Pembahasan



ANALISIS DATA 1. Kurva titrasi asam amino yang dinyatakan dengan hubungan volume NaOH terhadap waktu Berdasarkan hasil praktikum diperoleh data hasil titrasi asam amino dengan menggunakan NaOH sebagai titran yaitu sebagai berikut. Tabel 1. Hasil titrasi asam amino dengan menggunakan NaOH sebagai titran Waktu (menit)



Volume (mL)



0 14,2 15 16,6 30 17,3 45 18,5 60 21,00 90 22,00 120 23,3 Berdasarkan data di atas, maka dapat dibuat kurva titrasi hubungan volume NaOH terhadap waktu sebagai berikut.



Kurva Titrasi Hubungan Volume NaOH Terhadap Waktu 35 30 Hubungan volume NaOH terhadap waktu 25 f(x) = 0.07x + 15.15 20 R² = 0.94 Volume NaOH (mL) 15 10 Linear (Hubungan volume NaOH terhadap waktu) 5 0 0



20



40



60



80



100



120



140



Waktu (menit)



Gambar 1. Kurva Hubungan Volume NaOH terhadap Waktu Berdasarkan kurva tersebut diatas, maka dapat dihitung derajat hidrolisis dari enzim tripsin terhadap larutan gelatin melalui perhitungan sebagai berikut. Derajat h idrolisis=



∆V NaOH ∆t



???? 2. Penentuan Jumlah Mg Asam Amino pada Tiap Volume NaOH saat Titrasi Dengan mengasumsikan 1 mL NaOH ekivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, maka dapat dihitung jumlah mg asam amino pada tiap volume NaOH saat titrasi. Adapun perhitungannya yaitu sebagai berikut. Pada waktu t = 0 Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 14,2 mL Mol NaOH = 14,2 mL x 0,02 M = 0,284 mmol 1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,284 mmol NaOH ekuivalen dengan:



0,1 mmol 1,4 mg = 0,284 mmol x mg x=



0,284 mmol× 1,4 mg =3,976 mg nitrogenasam amino 0,1 mmol



Pada waktu t = 15 Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 16.6 mL Mol NaOH = 16,6 mL x 0,02 M = 0,332 mmol 1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,332 mmol NaOH ekuivalen dengan: 0,1mmol 1,4 mg = 0,332mmol x mg x=



0,332mmol ×1,4 mg =4,648 mg nitrogenasam amino 0,1mmol



Pada waktu t = 30 Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 17,3 mL Mol NaOH = 8,6 mL x 0,02 M = 0,346 mmol 1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,346 mmol NaOH ekuivalen dengan: 0,1mmol 1,4 mg = 0,346 mmol x mg x=



0,346 mmol× 1,4 mg =4,844 mgnitrogen asamamino 0,1 mmol



Pada waktu t = 45 Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 18,5 mL Mol NaOH = 8,6 mL x 0,02 M = 0,37 mmol 1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,37 mmol NaOH ekuivalen dengan:



0,1mmol 1,4 mg = 0,37 mmol x mg x=



0,37 mmol× 1,4 mg =5,18 mgnitrogen asam amino 0,1 mmol



Pada waktu t = 60 Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 8,95 mL Mol NaOH = 8,95 mL x 0,02 M = 0,42mmol 1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,42 mmol NaOH ekuivalen dengan: 0,1mmol 1,4 mg = 0,42mmol x mg x=



0,42mmol ×1,4 mg =5,88 mg nitrogen asamamino 0,1 mmol



Pada waktu t = 90 Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 22 mL Mol NaOH = 22 mL x 0,02 M = 0,44 mmol 1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,44 mmol NaOH ekuivalen dengan: 0,1 mmol 1,4 mg = 0,44 mmol x mg x=



0,44 mmol ×1,4 mg =6,16 mg nitrogenasam amino 0,1 mmol



Pada waktu t = 120 Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 23,3 mL Mol NaOH = 23,3 mL x 0,02 M = 0,466 mmol 1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,466 mmol NaOH ekuivalen dengan:



0,1mmol 1,4 mg = 0,466 mmol x mg x=



0,466 mmol× 1,4 mg =6,524 mg nitrogenasam amino 0,1 mmol



Tabel 2. mg Nitrogen asam amino yang diperoleh dari hasil titrasi Waktu (menit)



Volume (mL)



mg



Nitrogen



asam amino 0 14,2 3,976 15 16,6 4,648 30 17,3 4,844 45 18,5 5,18 60 21,00 5,88 90 22,00 6,16 120 23,3 6,524 Berdasarkan data diatas, maka dapat dibuat kurva hubungan antara mg nitrogen asam amino terhadap waktu yaitu sebagai berikut. (kurva blm) Gambar 2. Kurva hubungan waktu terhadap mg Nitrogen asam amino



HASIL DAN PEMBAHASAN Dalam percobaan ini, dilakukan titrasi formal asam amino. Titrasi formal asam amino merupakan titrasi asam amino atau campuran asam amino dalam keberadaan formaldehida. Asam amino yang digunakan merupakan hasil degradasi dari gelatin (polipeptida) yang didegradasi menggunakan enzim protease yaitu tripsin. Adapun prinsip dari percobaan ini mengikuti kenyataan bahwa suatu protein mengikuti teori zwitter ion, dimana suatu asam amino walaupun memiliki dua sisi aktif (gugus –COOH dan gugus amina –NH 2), sehingga dapat dititrasi menggunakan asam dan basa. Namun kenyataannya, gugus ammonium dari asam amino merupakan buffer pada pH tinggi (di atas pH 11) sehingga tidak mungkin untuk mentitrasinya pada titik akhir suatu indikator. Hal ini mengingat dimana suatu indikator pada umumnya memiliki trayek pH sedapat mungkin mendekati pH 7 karena titrasi asam basa merupakan suatu reaksi penetralan. Dalam percobaan ini, reagen yang digunakan adalah larutan gelatin. Gelatin merupakan polipeptida (protein) yang larut dalam air, hal ini terbukti dengan mudah larutnya gelatin ketika ditambahkan ke dalam aquades. Gelatin merupakan gelting agent (bahan pembuat gel), sehingga perlu diinkubasi pada suhu 38 oC. Bila suhu inkubasi diatas 38oC, maka kemungkinan akan terbentuk gel yang akan mempengaruhi proses degradasi untuk menghasilkan asam amino.



Sebelum dilakukan proses titrasi dalam percobaan ini terlebih dahulu dilakukan proses pembuatan larutan gelatin dengan cara melarutkan 5 gram padatan gelatin ke dalam 100 mL aquades. Setelah dilarutkan dan diaduk terbentuk larutan gelatin yang berwarna kuning. Larutan gelatin ini kemudian ditambahkan indikator fenolftalein sebanyak 1 mL dan ditambahkan larutan NaOH 0,2 M tetes demi tetes sehingga larutan gelatin berwarna merah muda. Adapun tujuan penambahan NaOH adalah agar larutan bersifat sedikit basa. Larutan yang berwarna merah ini kemudian ditambahkan larutan HCl 0,1 M tetes demi tetes. Penambahan larutan HCl menyebabkan warna larutan kembali berwarna kuning. Penambahan larutan HCl bertujuan agar pH menjadi 8 dimana pada pH ini enzim tripsin akan mampu bekerja secara optimal. Dalam percobaan ini diperoleh pH setelah penambahan HCl yaitu 8,02. Hal yang sama juga dilakukan terhadap enzim tripsin, dimana dilakukan penambahan fenolftalein dan NaOH kedalam 25 mL larutan tripsin sehingga warna menjadi merah muda. Kemudian larutan ini ditambahkan larutan HCl 0,1 M tetes demi tetes hingga warna merah muda akibat penambahan fenolftalein dan NaOH ini hilang. Hal ini dilakukan agar kondisi enzim tripsin sama dengan kondisi gelatin sehingga saat direaksikan akan terjadi reaksi yang sempurna. Setelah itu, larutan gelatin dan tripsin ini diinkubasi dengan inkubator air pada suhu 38 oC, dimana suhu ini dijaga supaya tidak melebihi suhu 38 oC karena dapat menyebabkan enzim rusak yang ditandai dengan pembentukan gel yang sangat mempengaruhi proses degradasi menghasilkan asam amino. Setelah diinkubasi selama beberapa menit, kedua larutan ini kemudian dicampur. Dari pencampuran ini terbentuk larutan berwarna kuning kecoklatan. Tujuan pencamuran ini adalah untuk mengdegradasi larutan gelatin dengan menggunakan enzim tripsin. Tripsin merupakan enzim proteolitik yang hanya terdiri dari suatu rantai polipeptida. Enzim ini akan mendegradasi gelatin menghasilkan asam amino penyusunnya. Sebanyak 10 mL dari larutan ini diambil dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan dilakukan pendidihan terhadap larutan ini dengan tujuan untuk merusak enzim. Kemudian dilakukan pendinginan terhadap larutan. Setelah dingin, larutan ditambahkan 15 mL larutan formaldehid dan 3 tetes fenolftalein. Warna larutan setelah ditambahkan formaldehid dan fenolftalein yaitu tetap berwarna kuning keruh. Larutan ini kemudian dititrasi dengan larutan NaOH 0,02 M. Titrasi dihentikan ketika larutan ini berubah warna menjadi merah muda. Adapun penambahan formaldehid sebelum titrasi berfungsi agar gugus karbonilnya bereaksi dengan asam amino yang tidak bermuatan sehingga memungkinkan gugus amonium bereaksi dengan NaOH dan membuffer pada pH yang lebih rendah serta dapat dititrasi pada titik akhir secara kuantitatif menggunakan suatu indikator. Reaksi yang terjadi pada titrasi dengan menggunakan formalin merupakan reaksi pembentukan dimetilol. Larutan protein yang telah dinetralkan dengan basa (NaOH), ditambahkan formalin sehingga membentuk dimetilol. Dengan terbentuknya dimetilol ini, berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi yang terjadi antara gugus asam (karboksil) dengan basa (NaOH) sehingga titik akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolftalein. Bila titik akhir titrasi diperoleh tepat, maka akan terjadi perubahan warna larutan dari bening menjadi merah muda. Reaksi yang terjadi dalam proses ini adalah sebagai berikut : H R



C NH2



H COOH



NaOH



R



C NH3+



COO -



H R



H



O COO- +



C NH3+



C H



R



C



COOH



H



N



CH2OH



H O C H



H



H R



C



COOH



HOH2C



N



CH2OH



dimethilol



H



H



R



C



COOH + NaOH



HOH2C



N



CH2OH



R



C



COO-Na+ + H 2O



HOH2C



N



CH2OH



Berdasarkan Kurva hubungan volume NaOH terhadap waktu di atas, dapat diketahui bahwa semakin lama larutan didiamkan, maka semakin banyak volume NaOH yang digunakan untuk proses titrasi. Hal ini terjadi karena selama proses hidrolisis gelatin oleh tripsin menghasilkan sejumlah asam amino yang konsentrasinya bertambah seiring dengan bertambahnya interaksi antara larutan gelatin dengan larutan tripsin. Enzim tripsin yang semakin lama menghidrolisis gelatin menyebabkan gugus karboksil dan gugus amino yang dihasilkan semakin banyak. Dengan bertambahnya gugus ini, maka jumlah NaOH yang digunakan pada saat titrasi juga bertambah. Secara kuantitatif dari kurva yang diperoleh, maka dapat dihitung derajat hidrolisis dari enzim tripsin terhadap larutan gelatin. Berdasarkan hasil analisis data besar derajat hidrolisis dari enzim tripsin terhadap larutan gelatin adalah 0,0122 . Selanjutnya dari kurva hubungan waktu terhadap mg Nitrogen asam amino di atas, terlihat bahwa semakin lama waktu yang digunakan larutan gelatin untuk bereaksi dengan enzim



pankreatin maka semakin banyak pula mg nitrogen asam amino yang dihasilkan. Terdapat hubungan yang searah antara waktu kontak dengan mg nitrogen asam amino. Hal ini terjadi karena selama proses hidrolisis gelatin (protein) oleh enzim pankreatin menghasilkan sejumlah gugus karboksil dan gugus amino yang bertambah sehingga nitrogen yang terdapat pada dimethilol juga ikut bertambah. SIMPULAN Berdasarkan pembahasan di atas, maka diperoleh beberapa kesimpulan antara lain : 1 2



Protein dapat dihidrolisis dengan enzim protease dan melalui titrasi formal asam amino. Kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu dan kurva mg nitrogen asam amino terhadap waktu pada titrasi formal asam amino berbanding lurus dimana semakin lama larutan didiamkan, maka semakin banyak volume NaOH yang diperlukan untuk mentitrasi larutan asam amino tersebut maka semakin banyak pula mg nitrogen dari asam amino yang dihasilkan.