Asam Klorogenat [PDF]

Citation preview

ANALISIS ASAM KLOROGENAT DENGAN HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY) (Laporan Praktikum Analisis Hasil Pertanian)



Oleh



Faris Naufal 1514051055 Kelompok VI



JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS LAMPUNG 2017



I.



PENDAHULUAN



1.1. Latar Belakang



Kopi merupakan salah satu dari delapan komoditas utama perkebunan di Indonesia yang memiliki luas areal yang cukup besar serta menjadi komoditas ekspor yang sangat menjanjikan (Yashin et al., 2013; Maridelana et al., 2014). Sulistyowati (2002) dan Lin (2010) menyatakan bahwa pengolahan kopi yang kurang baik menimbulkan kerusakan citarasa seperti munculnya rasa asam, basi dan bau busuk. Pengolahan biji kopi dilakukan dengan cara (1) pengolahan kering, (2) pengolahan semi basah, dan (3) pengolahan basah (Ruku et al., 2006; Prastowo et al., 2010; Lin, 2010). Pada umumnya petani melakukan proses pengolahan dengan cara kering yaitu panen buah masak, sortasi buah, pengeringan, pengupasan kulit, sortasi, pengeringan kembali, dan pengemasan (Natawidjaya, 2012). Tahapan proses pengolahan kopi menentukan mutu biji kopi dan kopi bubuk yang dihasilkan (Siswoputranto, 1992). Kopi bubuk diperoleh melalui penyangraian dan penggilingan, dalam proses pengolahan kopi bubuk terdapat senyawa kimia setelah disangrai. Menurut Mulato (2001), kopi mengandung berbagai jenis senyawa, antara lain kafein, asam klorogenat, trigonelin, karbohidrat, lemak, asam amino, asam organik, aroma volatil, dan mineral. Menurut Mursu et al. (2005) kopi mengandung beberapa komponen fenolik selain tokoferol yang menunjukkan kapasitas antioksidan seperti asam klorogenat yang merupakan ester dari beberapa asam sinamat dengan asam quinat, dan asam kafeat, asam ferulat serta asam p-kaumarat yang terdapat dalam bentuk bebas. Antioksidan terbagi atas tiga golongan yaitu golongan fenol, golongan amin dan golongan amino fenol (Ketaren, 1986). Antioksidan golongan



fenol memegang peranan penting dalam makanan. Salah satu contoh antioksidan golongan fenol adalah asam klorogenat. Asam klorogenat merupakan komponen fenol utama dalam kopi dan kopi merupakan salah satu tanaman yang mengandung asam klorogenat dalam konsentrasi yang tinggi (Farah et al., 2005). Menurut Jiang et al. (2001), asam klorogenat mempunyai aktivitas antibakteri, antiviral, dan antikanker dan menurut Belitz and Grosch (1999), kandungan kimia terbesar kopi sebagai antioksidan adalah asam klorogenat yang mempunyai titik leleh pada 208°C dan terdapat dalam kopi sebesar 4,5-11,1%. Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mendeteksi komponen fenolik dalam bahan pangan dengan metode HPLC. Komponen fenolik merupakan senyawa aromatik, oleh karena itu, senyawa tersebut akan memberikan penyerapan yang baik pada panjang gelombang sinar UV. Asam klorogenat merupakan bagian dari senyawa fenolik. Panjang gelombang yang digunakan untuk menentukan komponen asam klorogenat yaitu 290 nm (Singh et al., 2008). Keuntungan utama dari HPLC adalah kemampuannya untuk menangkap komponen dengan stabilitas panas yang terbatas ataupun yang bersifat volatil. HPLC merupakan metode yang sangat sensitif, tepat, selektif, dan memiliki tingkat otomatisasi yang tinggi, sehingga lebih sederhana dalam pengoperasiannya. Oleh karena itu, praktikum ini dilakukan untuk menganalisis kandungan asam klorogenat dalam kopi bubuk dengan menggunakan metode HPLC.



1.2. Tujuan



Tujuan dari praktikum ini adalah sebagai berikut: 1. Mengetahui prosedur preparasi sampel kopi bubuk yang baik dan benar untuk analisis asam klorogenat. 2. Mengidentifikasi senyawa asam klorogenat dalam kopi bubuk dengan metode HPLC.



II.



METODOLOGI PERCOBAAN



2.1. Waktu dan Tempat



Praktikum ini dilaksanakan pada hari Jumat tanggal 29 September 2017 pukul 09.30 sampai dengan 11.30 WIB di Laboratorium Penjaminan dan Pengujian Mutu Hasil Pertanian, Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung.



2.2. Alat dan Bahan



Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah HPLC, timbangan analitik, pengaduk, corong, kertas saring whatman no.1, penangas air, gelas erlenmeyer 100 ml, gelas ukur 100 ml, labu ukur 50 ml, dan pipet volumetrik. Sedangkan, bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah kopi bubuk, aquades, larutan standar asam klorogenat, dan metanol.



2.3. Diagram Alir



Prosedur kerja yang dilakukan dalam praktikum disajikan pada Gambar 1 sebagai berikut. Kopi Bubuk



Ditimbang sebanyak 1 gram



Dimasukkan kedalam erlenmeyer 100 mL



Dilarutkan dengan metanol dan air 75 mL (1:1)



Dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100°C selama 15 menit dan didinginkan pada suhu kamar



Disaring dengan kertas saring Whatman No.1 ke dalam labu ukur 50 mL



Ditambahkan aquades hingga tera



Diambil 10 ml filtrat ke dalam labu ukur 50 mL



Ditambahkan aquades sampai tera dan diambil sebanyak 20 mL



Hasil siap dianalisis dengan alat HPLC Gambar 1. Diagram alir preparasi sampel untuk analisis asam klorogenat



III.



HASIL DAN PEMBAHASAN



3.1. Pembahasan



Asam klorogenat merupakan komponen fenol utama dalam kopi dan kopi merupakan salah satu tanaman yang mengandung asam klorogenat dalam konsentrasi yang tinggi (Farah et al., 2005). Menurut Clifford (1999), asam klorogenat merupakan metabolit sekunder terbesar pada biji kopi dan secara umum asam klorogenat dibentuk dari asam kafeat dan asam quinat.



Hasil



penelitian Daglia et al. (2000), menunjukkan bahwa kopi robusta lebih memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibanding arabika. Jumlah asam klorogenat mencapai 90% dari total fenol yang terdapat pada kopi. Beberapa efek positif asam klorogenat terhadap kesehatan antara lain mencegah genotoksisitas monokloramin pada mukosa lambung (Shibata et al., 2010), menjaga kesehatan hati dan kandung empedu, mengurangi resiko DM II (Van Dam dan Hu, 2003), mengurangi resiko gout (Choi dan Curhan, 2007), menghambat resiko jantung koroner, menurunkan berat badan, mempunyai aktivitas antibakteri, antiviral dan antikanker (Jiang et al., 2001). Analisis asam klorogenat dilakukan dengan menggunakan metode Naegele (2012). Persiapan larutan induk dilakukan dengan menimbang standar asam klorogenat 5 mg yang dilarutkan dengan akuades ke dalam labu ukur 50 mL dan ditepatkan sampai tera. Selanjutnya persiapan larutan standar yaitu 20 mg/L, 10 mg/L, 1 mg/L,2,5 mg/L, 1,25 mg/L, dan 0,625 mg/L. Persiapan larutan uji yaitu ditimbang 1 g contoh kopi bubuk ke dalam erlenmeyer 100 mL, dilarutkan dengan metanol dan air 75 mL (1:1). Dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100°C selama 15 menit, kemudian didinginkan pada suhu kamar. Selanjutnya saring



dengan kertas saring Whatman No.1 ke dalam labu ukur 50 mL dan ditambakan aquades hingga tera. Dipipet 10 mL filtrat ke dalam labu ukur 50 mL, ditambahkan aquades sampai tera dan diambil sebanyak 20 mL. Persiapan fase gerak (mobile phase) dilakukan dengan memperhatikan pelarut yang digunakan sebagai fase gerak (mobile phase) untuk pemeriksaan kadar asam klorogenat dengan alat HPLC adalah 70% aquadest dan 30% metanol (gradient grade for liquid chromatography). Diencerkan dengan 900 ml air dipipet ke 1000 ml termos volumetrik. Standar dan sampel diinjek ke dalam HPLC. Kondisi HPLC: Kolom, fase Reverse - ODS, 250x4,6 mm, tingkat 1 ml/menit, detektor, fotodioda array yang ditetapkan pada 278 nm, tekanan 150 KHF/cm2, fase gerak air, asam asetat, metanol (799, 1 dan 200 ml) dan volume sampel 20 ml. Kurva kalibrasi daerah puncak dengan konsentrasi standar diplot.



Sampel dihitung menggunakan persamaan regresi



garis terbaik. Kadar asam klorogenat sampel diperoleh dari perbandingan kromatografi standar dengan kromatografi sampel yang diperoleh. Cara isolasi dan pemurnian senyawa asam klorogenat yaitu buah kopi robusta sebanyak 500 gram dikeringkan secara alami digiling dan dimaserasi dengan 2 L metanol (MeOH) selama 3x24 jam, disaring dan dievaporasi pada suhu ± 40ºC. Ekstrak MeOH (68,49g) dipartisi dengan 3x350 ml n-heksana-H2O menghasilkan ekstrak nheksana (12,66g). Fraksi air dipartisi dengan 3x350 ml etil asetat (EtOAc) dihasilkan ekstrak EtOAc (6,40g) dan fraksi H2O (40,25g). Masingmasing fraksi dianalisis dengan KLT (Kromatografi Lapis Tipis) fase normal silika dan ODS (Octadecylsily) silika gel dibandingkan dengan standar.n-heksanaEtOAC (3:2), n-heksan-aseton (3:2) dan (4:1), kloroform-metanol (4:1), dan metanol-H2O (7:3). Plat disemprot dengan pereaksi asam sulfat 10% dalam etanol. Fraksi H2O (1,70g) dimurnikan dengan kromatografi kolom ODS (MeOH-H2O 10% stepwise) diperoleh 11 fraksi dengan fraksi 2, 3 dan 4 (1.2143g) mengandung senyawa asam klorogenat. mengandung senyawa asam klorogenat. Dimurnikan kembali dengan kromatografi kolom ODS (MeOH-H2O 5% stepwise) diperoleh 23 fraksi dengan fraksi 3 mengandung senyawa asam klorogenat. Dimurnikan kembali dengan kromatografi kolom sistem pelarut isokratis sehingga



didapatkan senyawa murni yaitu asam klorogenat. Isolat murni yang diperoleh diuji aktivitas antioksidannya dengan metode DPPH (Yen dan Cen, 1995), sampel dilarutkan dalam metanol (konsentrasi 10-1000 ppm), direaksikan dengan 0,2 mM DPPH, diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang, kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 515 nm. Aktivitas antioksidan dihitung sebagai persentase inhibisi terhadap DPPH (persentase scavenging effect), yaitu % inhibisi = [1-(absorban sampel/absorban blanko)] x 100%. Nilai IC50 adalah konsentrasi sampel yang diperlukan untuk memberikan % inhibisi sebesar 50%. Kromatografi cairan kinerja tinggi atau dalam bahasa inggrisnya dikenal dengan sebutan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan salah satu teknik pemisahan campuran secara modern. Teknik HPLC ini merupakan salah satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/area standar. Pada prakteknya, pembandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar. Oleh karena itu, pembandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi. Keuntungan HPLC dibandingkan kromatografi gas diantaranya, HPLC dapat menganalisis cuplikan yang labil (mudah terurai) karena HPLC dilakukan pada suhu kamar, HPLC tidak terbatas pada senyawa organik saja tetapi HPLC dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa anorganik, HPLC dapat menganalisis cuplikan yang mempunyai berat molekul tinggi atau titik didihnya sangat tinggi seperti polimer (Tim Kimia Analitik Instrumen, 2009). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. HPLC mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran. HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain farmasi, lingkungan dan industri-industri pangan. Kegunaan umum HPLC adalah



untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities) dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (non volatil). HPLC paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asamasam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain (Hendayana, 2006). Pada percobaan ini dalam proses ekstraksi, pelarut yang digunakan adalah metanol karena metanol memilki sifat kepolaran yang sama dengan asam klorogenat, yaitu keduanya bersifat polar. Karena prinsip kerja dari ekstraksi yaitu menggunakan pelarut yang siatnya sesuai dengan zat yang akan diekstraksi, sehingga metanol dan asam klorogenat bisa saling melarutkan. Pelarut metanol digunakan karena merupakan pelarut yang tidak beracun, bersifat netral, tidak mudah ditumbuhi jamur, absorbsi simplisia baik ke dalam jaringan simplisia, serta merupakan pelarut universal yang dapat menyari senyawa polar maupun nonpolar karena kemampuannya dalam meningkatkan permeabilitas dinding sel dan panas untuk pemekatan lebih kecil sehingga dapat menghindari kerusakan senyawa yang terkandung. Proses pemanasan pada ekstraksi asam klorogenat akan menyebabkan asam klorogenat yang terkestrak juga semakin banyak serta pemanasan diperlukan untuk memisahkan pelarut dengan asam klorogenat yang terekstrak dalam sampel dengan cara penguapan pelarut, bila ditinjau dari titik didih metanol yang rendah sehigga metanol lebih mudah menguap. Penurunan kadar asam klorogenat disebabkan karena pemanasan yang berlangsung lama akan menyebabkan senyawa-senyawa polifenol khususnya asam klorogenat terdekomposisi. Senyawa asam klorogenat akan mengalami oksidasi dan menghasilkan radikal dan membentuk dimer (Belitz and Grosch, 1999).



IV.



KESIMPULAN



Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan dapat ditarik beberapa kesimpulan sebagai berikut: 1. Asam klorogenat merupakan komponen fenol utama dalam kopi dan secara umum asam klorogenat dibentuk dari asam kafeat dan asam quinat yang memiliki efek positif asam klorogenat terhadap kesehatan. 2. Teknik HPLC merupakan salah satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/area standar. 3. Keuntungan HPLC dibandingkan kromatografi gas diantaranya HPLC dapat menganalisis cuplikan yang labil (mudah terurai), HPLC tidak terbatas pada senyawa organik saja tetapi HPLC dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa anorganik, HPLC dapat menganalisis cuplikan yang mempunyai berat molekul tinggi atau titik didihnya sangat tinggi seperti polimer. 4. Penambahan pelarut metanol digunakan untuk mengekstraksi asam klorogenat dalam kopi bubuk, karena metanol memilki sifat kepolaran yang sama dengan asam klorogenat sehingga keduanya dapat saling melarutkan. 5. Proses pemanasan pada ekstraksi asam klorogenat akan menyebabkan asam klorogenat yang terkestrak semakin banyak serta pemanasan diperlukan untuk memisahkan pelarut dengan asam klorogenat yang terekstrak dalam sampel dengan cara penguapan pelarut.



DAFTAR PUSTAKA



Belitz, H.D., dan W. Grosch. 1999. Food Chemistry. Springer. Berlin. 992 pages. Clifford, M.N. 1999. Chlorogenic Acids and Other Cinnamates Nature, Occurrence and Dietary Burden. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79. 362-372. Daglia, M., A. Papetti, C.Gregotti, F. Berte, dan G. Gazzani. 2000. In Vitro Antioxidant and Ex Vivo Protective Activities of Green and Roasted. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48. 1449-1454. Farah A., T. D. Paulis, L. C. Trugo, P. R. Martin. 2005. Effect of Roasting on The Formation of Chlorogenic Acid Lactones in Coffee. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53(5):1505-1513. Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforensis Modern. Remaja Rosdakarya. Bandung. Jiang, Y., K. Satoh, and S. Watanabe. 2001. Inhibition of Chlorogenic Acid Induced Cytotoxicity By CoCl2. Anticancer Res. 2:3349-3353. Ketaren, S. 1986. Pengantar Teknologi Minyak dan Lemak Pangan. Cetakan Pertama. UI Press. Jakarta. Hal. 485-487.



Maridelana, V.P., Hariyati, Y., Kuntadi, E.B. 2014. Fungsi Keuntungan Usaha Tani Kopi Rakyat Di Desa Belantih Kecamatan Kintamani Kabupaten Bangli. Berkala Ilmiah Pertanian. 1(3):47-52.



Mulato, S., S. Widyotomo, dan Lestari, H. 2001. Pelarutan Kafein Biji Kopi Robusta dengan Kolom Tetap Menggunakan Pelarut Air. Pelita Perkebunan. Vol.17(2):97-109. Mursu, J., S. Vautilanen., T. Nurmi., G. Alfthan., J.K. Firtanen., T.H. Rissanen., P. Happonen., K. Nyyssonen., J. Kaikkonen., R. Salonen and J.K. Salonen. 2005. The Effects of Coffee Consumption on Lipid Peroxidation and Plasma Total Homocysteine Concentrations a Clinical Trial Free Radical Biology and Medicine. Hal.15-17. Naegele, E. 2012. Determination of Chlorogenic Acid in Coffee Products According to Din 10767. Agilent Technologies, Inc. Waldbronn. Germany. Hal 3-7. Natawidjaya, H. 2012. Pedoman Teknis Penanganan Pascapanen Kopi. Direktorat



Pascapanen



dan



Pembinaan



Usaha.



Direktorat



Jenderal



Perkebunan. Kementrian Perkebunan. Hal.13-15. Prastowo, B., E. Karmawati, Rubiyo, Siswanto, C. Indrawanto, dan S. J. Munarso. 2010. Budidaya dan Pascapanen Kopi. Pusat Penelitian dan Pengembangan Perkebunan. Bogor. Hal.11-12. Ruku, S., S. Muttakin, dan Syamsiar. 2006. Penanganan Pasca Panen Kopi. Buletin Teknologi dan Informasi Pertanian. 5:47-57. Shibata, H., Y. Sakamoto, M. Oka, dan Y. Kono. 2010. Natural Antioxidant, Chlorogenic



Acid,



Protects



Againtst



DNA



Breakage



Caused



by



Monochloramine. Departement of Life Science and Biotechnology. Faculty of Life and Environmental Science. Shimane University. Japan. Pg. 30-32. Singh, R., Maithani, M., Saraf, S.K., Saraf, S., and Gupta, R.C. 2008. Simultaneous Estimation of Ciprofloxacin Hydrochloride, Ofloxacin, Tinidazole, and Ornidazole by Reverse Phase-High Performace Liquid Chromatography. Eurasian J Anal Chem. 4(2):161-167.



Siswoputranto, P.S. 1992. Kopi Internasional dan Indonesia. Kanisius. Yogyakarta. Hal.11-18. Sulistyowati. 2002. Faktor-Faktor yang Berpengaruh terhadap Citarasa Seduhan Kopi. Materi Pelatihan Uji Citarasa Kopi. Pusat Penelitian Kopi dan Kakao. Jember. 17.138–148. Tim Kimia Analitik Instrumen. 2009. Penuntun Praktikum Kimia Analitik Instrumen (KI 512). Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI. Bandung. Van Dam, R. M., dan F.B. Hu. 2003. Coffee Consumption and Risk of Type 2 Diabetes: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Assosiation. 294. 97-104. Yashin, A., Yashin, Y., Wang, J.Y., Nemzer, B. 2013. Antioxidant and Antiradical Activity of Coffee. Antioxidants. 2:230-245. Yen, G.C. dan H.Y. Chen. 1995. Antioxidant Activity of Various Tea Extracts in Relation to Their Antimutagenicity. J. Agric. Food. Chem. Hlm.27-32.



LAMPIRAN



FOTO PRAKTIKUM



Gambar 2. Sampel kopi bubuk



Gambar 3. Penimbangan sampel kopi bubuk 1 gram



Gambar 4. Pelarutan dengan metanol dan air (1:1)



Gambar 5. Hasil campuran



Gambar 6. Pemanasan selama 15 menit



Gambar 7. Penyaringan sampel



Gambar 8. Filtrat hasil penyaringan



Gambar 9. Filtrat 10 mL + aquades



Gambar 10. Pengambilan filtrat 20 mL