Book Reading Prosesing Jaringan [PDF]

Citation preview

`



PROSESING JARINGAN Lena T. Spencer & John D. Bancroft



PENGANTAR Setelah pengangkatan sampel jaringan dari pasien, maka dilakukan serangkaian proses untuk memastikan preparat mikroskop yang dihasilkan berkualitas diagnostik. Jaringan terpapar oleh serangkaian reagen yang berguna untuk memfiksasi, dehidrasi, clear, dan infiltrasi serta diakhiri dengan embedding pada medium yang mendukung jaringan. Kualitas dari pengawetan komponen jaringan ditentukan oleh pemilihan reagen dan waktu paparan terhadap setiap reagen dalam prosesing jaringan. Setiap langkah dalam prosesing jaringan adalah penting mulai dari cara mendapatkan spesimen dan pemilihan sampel, menentukan protokol dan reagen yang sesuai untuk digunakan dalam proses pengecatan dan diagnosis akhir. Memproduksi preparat berkualitas bukanlah suatu kebetulan, melainkan membutuhkan keterampilan yang berkembang seiring dengan latihan dan pengalaman. Dengan berkembangnya teknologi dan instrumentasi, peran dari laboratorium histologi pada perawatan pasien akan semakin diperlukan. Pelabelan jaringan Nomor atau kode identifikasi yang unik diberikan pada sampel jaringan yang diproses di laboratorium. Nomor ini bisa diberikan secara elektronik atau secara manual dan harus menyertai spesimen sepanjang proses laboratorium, termasuk dokumentasi pada laporan patologi. Teknologi terbaru, telah membuat bar code dan sistem pengenalan karakter tersedia pada setiap laboratorium. Sistem Prelabelling otomatis yang secara permanen tercetak pada kaset jaringan dan preparat begitu pula dengan pena/pensil kimia resisten, dan label, digunakan secara rutin di laboratorium patologi. Tanpa memandang sistem pelabelan apakah otomatis atau manual, peraturan dan prosedur yang sesuai harus ditetapkan untuk memastikan



1



`



identifikasi positif pada blok jaringan dan preparat selama prosesing, diagnosis, dan pengisian. Penyelesaian fiksasi sebelum prosesing Fiksasi adalah langkah yang paling penting pada prosesing sampel jaringan. Bila fiksasi tidak komplit sebelum prosesing, maka stasiun pada prosesor harus diatur untuk tujuan tersebut. Bila fiksasi jaringan tidak adekuat, maka penambahan cairan dehidrasi bisa menyelesaikan proses selanjutnya dengan kemungkinan dapat menghambat pewarnaan karakteristik dari jaringan. Ukuran dan tipe spesimen pada kaset jaringan menentukan waktu yang diperlukan untuk fiksasi komplit dan pengolahan. Jaringan harus dilakukan diseksi dengan ketebalan 3-4 mm mengikuti aturan yakni berukuran seperti koin kecil. Yang perlu diperhatikan adalah untuk tidak mengisi kaset terlalu penuh pada diseksi gross. Bila memungkinkan, jaringan yang lebih besar atau lebih kecil harus dipisahkan dan diproses menggunakan jadwal yang berbeda. Penanganan pasca fiksasi Teknik fiksasi khusus bisa membutuhkan beberapa langkah tambahan sebelum prosesing jaringan dimulai. Fiksatif asam pikrit membentuk pikrat larut-air sehingga kaset perlu dicelupkan langsung pada alkohol 70% untuk diproses. Fiksatif alkohol seperti larutan Carnoy harus dicelupkan pada alkohol 100%. Untuk membantu visualisasi dari fragmen kecil jaringan selama embedding, maka beberapa tetes eosin 1% dapat ditambahkan kepada kontainer spesimen 30 menit sebelum prosesing. Pewarnaan merah muda pada jaringan akan tetap bertahan selama prosesing tetapi dapat terhapus selama pewarnaan. PRINSIP PROSESING JARINGAN Prosesing jaringan dirancang untuk menghilangkan semua cairan yang dapat diekstraksi dari jaringan, menggantikannya dengan media pendukung yang



2



`



menyediakan kepadatan yang sesuai sehingga dapat dilakukan pemotongan jaringan tanpa menyebabkan kerusakan atau distorsi. Langkah-langkah dalam pengolahan jaringan adalah sebagai berikut: 



Dehidrasi: mengeluarkan air dan fiksatif dari jaringan







Clearing: mengeluarkan cairan dehidrasi,



membuat komponen



jaringan reseptif untuk media infiltratif 



Infiltrasi: mengisi jaringan dengan media pendukung







Embedding: meletakkan sampel jaringan pada media pendukung dan memadatkannya



Faktor-faktor yang mempengaruhi laju prosesing Ketika jaringan dicelupkan ke dalam cairan, terjadi pertukaran antara cairan di dalam jaringan dan di sekitar cairan. Beberapa faktor yang mempengaruhi laju dimana pertukaran terjadi akan dibicarakan di bawah ini. Agitasi Laju pertukaran cairan tergantung pada permukaan jaringan yang terpapar yang mengalami kontak dengan reagen prosesing. Agitasi meningkatkan aliran cairan segar di sekitar jaringan. Prosesor otomatis menggabungkan osilator vertikal atau osilator berputar atau menekan pemindahan dan penggantian cairan dalam interval waktu sesuai mekanisme untuk agitasi. Agitasi yang efisien bisa mengurangi waktu pengolahan sampai 30%. Panas Panas dapat meningkatkan laju penetrasi dan pertukaran cairan. Hal ini harus digunakan



secara



berkala



untuk



mengurangi



kemungkinan



pengerutan,



pengerasan, dan rapuhnya jaringan., Temperatur terbatas sampai 45º C dapat digunakan secara efektif.



Temperatur yang lebih tinggi bisa mempengaruhi



pengecatan imunohistokimia berikutnya.



3



`



Viskositas Viskositas adalah properti dari resistensi aliran cairan. Semakin kecil ukuran molekul cairan maka semakin cepat laju penetrasi (viskositas rendah). Sebaliknya apabila molekul cairan lebih besar, laju pertukaran cairan lebih lambat (viskositas tinggi). Kebanyakan cairan yang digunakan dalam prosesing, dehidrasi, dan clearents, memiliki viskositas yang sama, dengan pengecualian minyak cendana. Media embedding memiliki viskositas yang bervariasi. Parafin memiliki viskositas yang lebih rendah pada tahap cairan, sehingga meningkatkaan kecepatan impregnasi. Vakum Dengan menggunakan tekanan untuk meningkatkan laju infiltrasi maka waktu yang diperlukan untuk menyelesaikan setiap langkah pada prosesing sampel jaringan akan berkurang. Vakum akan memindahkan reagen dari jaringan hanya jika reagen tersebut lebih mudah menguap dibandingkan reagen yang menggantikannya.



Vakum yang digunakan pada prosesor otomatis harus



menggunakan Hg (merkuri) tidak melebihi dari 15 inci untuk mencegah kerusakan dan kebusukan jaringan. Vakum dapat membantu pemindahan udara yang terperangkap di dalam pori-pori jaringan. Waktu pemadatan impregnasi, jaringan lemak dapat dikurangi dengan menambahkan vakum selama prosesing. FIKSASI Mengawetkan sel dan komponen jaringan dengan perubahan bentuk yang minimal adalah langkah yang sangat penting dalam prosesing sampel jaringan dan akan didiskusikan lebih lanjut dalam bab 4. Fiksasi menstabilkan protein, membuat sel dan komponennya resisten terhadap autolisis dengan cara menginaktifkan enzim lisosom, dan mengubah penerimaan sel untuk proses lebih lanjut. Fiksasi harus selesai sebelum tahap lebih lanjut dilakukan.



4



`



DEHIDRASI Langkah pertama dari prosesing adalah pengeluaran molekul air yang tidak terikat dan cairan fiksatif dari komponen jaringan. Banyak agen dehidrasi adalah hidrofilik (penyuka air), memiliki grup polar yang berinteraksi dengan molekul air dalam jaringan. Reagen yang lain mempengaruhi dehidrasi dengan cara dilusi berulang dari cairan pada jaringan. Dehidrasi harus dilakukan secara perlahan. Bila konsentrasi gradien antara cairan di dalam dan di luar jaringan berlebihan, maka terjadi difusi melalui membran sel selama pertukaran cairan, sehingga meningkatkan kemungkinan kerusakan sel. Untuk alasan ini maka spesimen selalu diproses dengan menggunakan reagen yang konsentrasinya meningkat secara bertahap. Dehidrasi yang berlebihan bisa menyebabkan jaringan menjadi keras, rapuh, dan mengkerut. Dehidrasi yang tidak komplit akan menghambat penetrasi reagen clearing ke dalam jaringan sehingga spesimen akan menjadi lembut dan non-reseptif terhadap infiltrasi. Ada beberapa agen dehidrasi: ethanol, ethanol aseton, methanol, isopropyl, glycol, dan alkohol terdenaturasi. Bila pilihannya adalah ethanol, maka jaringan pertama kali dicelupkan pada ethanol 70% dalam air, diikuti dengan 95% dan larutan 100%. Untuk jaringan yang sangat halus maka dianjurkan untuk memulai dari ethanol 30%. Cairan dehidrasi Ethanol C2H5OH Larutan ini merupakan larutan yang jernih, tidak berwarna dan mudah terbakar. Ethanol juga hidrofilik, bercampur dengan air dan larutan organik lainnya, kerja cepat, dan dapat diandalkan. Ethanol dikenakan pajak, diatur oleh pemerintah, dan memerlukan catatan penyimpanan yang cermat. Konsentrasi ethanol yang bertahap digunakan untuk dehidrasi. Ethanol menghasilkan total dehidrasi sehingga merupakan reagen pilihan untuk prosesing spesimen mikroskop elektron.



5



`



Spiritus metilasi industri (alkohol terdenaturasi) Larutan ini memiliki tampilan fisik yang sama dengan ethanol. Alkohol terdenaturasi terdiri dari ethanol, dengan penambahan dari methanol (sekitar 1%, isopropyl alcohol, atau kombinasi dari alkohol. Untuk tujuan prosesing jaringan, pemakaian larutan ini menggunakan aturan yang sama dengan ethanol. Methanol Larutan ini jernih, tidak berwarna dan mudah terbakar dan sangat toksik, bercampur dengan air, ethanol, dan kebanyakan larutan organik. Larutan ini dapat digunakan sebagai pengganti ethanol. Propan-2-ol, isopropyl alcohol CH3CHOHCH3 Isopropyl alcohol dapat bercampur dengan air, ethanol, dan kebanyakan larutan organik. Larutan ini sering digunakan pada prosesing jaringan dengan menggunakan microwave. Isopropyl alcohol tidak menyebabkan pengerasan berlebihan atau pengerutan jaringan. Butyl alcohol (butanol) Larutan ini biasanya digunakan untuk histologi tanaman dan hewan, merupakan dehidran yang bekerja lambat dengan sedikit pengerutan dan pengerasan jaringan. Aseton CH3COCH3 Aseton merupakan cairan yang jernih, tidak berwarna, dan mudah terbakar, bercampur dengan air, ethanol, dan kebanyakan larutan organik. Memiliki kerja cepat dengan penetrasi yang buruk dan menyebabkan kerapuhan jaringan bila digunakan lebih lama. Aseton mengeluarkan lipid dari jaringan selama pengolahan.



6



`



Bahan-bahan tambahan untuk dehydrating agents Ketika ditambahkan pada dehydrating agents, fenol berperan untuk melunakkan jaringan yang keras seperti tendon, kuku, jaringan fibrus padat, dan massa keratin. Larutan 4% ditambahkan pada setiap ethanol 95%. Alternatif lain, jaringan bisa dicelupkan pada campuran gliserol-alkohol. Larutan universal Larutan universal menimbulkan dehidrasi dan menjernihkan selama prosesing jaringan. Dioxane, tertiary butanol, dan tetrahydrofuran digolongkan sebagai larutan universal. Larutan-larutan ini tidak dianjurkan untuk memproses jaringan yang lunak karena memiliki bagian yang mengeraskan ( Carson 1977; Sheehan & Hrapchak 1980). CLEARING Clearing agents bekerja sebagai intermedier antara dehidrasi dan larutan infiltrasi. Larutan ini harus berikatan dengan kedua larutan. Kebanyakan clearents adalah hidrokarbon dengan refraktif serupa dengan protein. Ketika dehydrating agents telah seluruhnya diganti dengan larutan ini maka jaringan memiliki penampakan yang transparan, sehingga mereka disebut



sebagai ‘clearing agent’. Kriteria



untuk memilih clearing agent yang sesuai adalah sebagai berikut: 



Cepat mengeluarkan dehydrating agent







Mudah dikeluarkan dari lelehan parafin







Kerusakan jaringan minimal







Kemampuan mudah terbakar







Toksisitas







Biaya



Kebanyakan clearing agents merupakan cairan mudah terbakar, sehingga di dalam penggunaannya harus diberikan peringatan. Titik didih dari clearing agents memberikan indikasi kecepatan penggantian oleh lelehan parafin. Cairan dengan



7



`



titik didih rendah secara umum lebih siap untuk digantikan. Viskositas mempengaruhi kecepatan penetrasi dari clearing agents. Paparan yang lama terhadap clearing agents menyebabkan jaringan menjadi mudah rapuh. Waktu di dalam penggunaan clearing agents harus diawasi untuk memastikan blok jaringan padat lebih jernih dan kecil., lebih rapuh, blok jaringan tidak rusak (Carson 1977; Sheehan & Hrapchak 1980; Luna 1992). Biaya juga harus diperhitungkan terutama bila berhubungan dengan pembuangan reagen. Karena kebanyakan clearing agents merupakan hidrokarbon aromatik atau alifatik hidrokarbon rantai pendek, maka masalah lingkungan harus menjadi perhatian. Sebagian besar institusi memiliki kebijakan dalam hal penyimpanan, pembuangan, dan keamanan untuk semua bahan mudah terbakar di laboratorium. Clearing agents yang sesuai untuk penggunaan rutin Xylene Cairan ini mudah terbakar, tidak berwarna dengan karakteristik petroleum atau bau aromatik, bercampur dengan kebanyakan larutan organik dan parafin. Sesuai untuk blok dengan ketebalan