HISTOPATOLOGI [PDF]

Citation preview

TEKNIK PEMBUATAN SEDIAAN (PREPARAT )UNTUK PEMERIKSAAN SITOLOGI DAN PEMERIKSAAN HITILOGI DI LABORATORIUM PATOLOGI ANATOMI Patologi



Anatomi



Adalah



spesialis



medis



yang



melakukan



diagnosis



penyakit



berdasarkan pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, molekul atas organ, jaringan, dan sel. Yang melakukan diagnosis penyakit berdasarkan patologi anatomi adalah Spesialis patologi anatomi



Spesialis patologi anatomi



mendiagnosis



penyakit



seseorang



berdasar



pemeriksaan



laboratorium. Ada beberapa teknik pemeriksaan di laboratorium patologi anatomi diantaranya pemeriksaan Histologi (morfologi jaringan) atau Sitologi (Morfologi sel). Pada pemeriksaan lab analis kesehatan(teknisi laboratorium) bertugas membuat sediaan/preparat jaringan atau sel yang didapat dari si pasien. Sediaan harus dibuat sebaik mungkin agar spesialis dapat melakukan diagnosis yang akurat. Disini akan diuraikan secara singkat teknik pembuatan sediaan pemeriksaan sitologi dan pemeriksaan histologidilaboratorium Patologi Anatomi. A. Sediaan untuk Pemeriksaan Sitologi Pada pemeriksaan sitologi yang diperiksa morfologi sel-sel cairan tubuh. Sediaan atau disebut duga preparatdibuat berupa apusan pada objek glass yang diwarani dengan pewarnaan tertentu. 1. Sediaan/preparat dengan pewarnaan metode Giemza Tujuan : Terutama yang diperiksa adalah detail dari morfologi untuk memeriksa intisel, untuk melihat apakah sel tersebut sel normal, sel noeplasma jinak atau ganas. Sampel : Aspirasi Jarum Halus (AJH), Endapan cairan yang telah disentrifuge Bahan : - Larutan pewarna giemza - Larutan Phosfat buffer (ph 6,8) - Methanol Prosedur kerja : 1) Sediaan apus telah benar-benar kering di udara



2) Fiksasi dengan methanol minimal 5 menit 3) Cuci dengan aquadest, biarkan kering di udara 4) Tetesi dengan pewarna Giemsa dengan perbandingan (GZ : Bufer phosfat = 1:4) 5) Cuci dengan aquadest, kering diudara 6) Tutup EZ Mount 2. Sediaan/preparat dengan pewarnaan metode Papaniculo Metode ini umumya digunakan untuk pewarnaan Papsmear (tapi terkadang ada juga selain papsmear diwarnai dengan metode ini). Papsmear digunakan untuk mendignosis Kanker serviks. Melihat ada tidaknya sel ganas Sampel : apusan daerah peralihan endoserviks. Bahan: -Haematoksilin mayer -EA (Eosin alkohol) 65/EA 36 - Alkohol 95% dan Alkohol absolut Untuk EA 65 isinya: Eosine Y, Phospotung stic acid, light green, alk. Absolute Prosedur Kerja : 1) Sedian apusan difiksasi dengan alcohol 95% 15 menit2) Air mengalir sampai bebas alkohol 5 menit (rak preparat diletakan di wadah yang di beri air mengalir) 3) Mayer haematoksilin 3-5 menit 4) Air Mengalir 15 menit 5) –Alkohol 95% 10 kali celup -Alkohol 95% 10 kali celup



6) EA 3-5 menit 7) –Alkohol 95% 5 kali celup -Alkoho 95% 5 kali celup - Alkohol absolute 5 kali celup 8) Keringkan diudara 9) Xylol/clearing 10) Tutup dengan EZ mount



Foto : peralatan pengecatan Hal-hal yang harus diperhatikan untuk pembuatan sediaan/preparat papsmear: - Pengambilan sampel harus mendapat sel-sel endoserviks sel-sel metaplasia dan sel-sel skuamosa (komponen daerah peralihan), harus harus sedikit mungkin mengandung darah. - Sediaan harus segera difiksasi dengan alkohol 95%. Preparat yang kering belum difiksasi akan menyebabkan sel-sel rusak. Apabila tempat pengecatan jauh,setelah difiksasi keringkan dan masukkan kewadah yang dapat menjaga keamanan sediaan. - Jika menggunakna hairspray tidak boleh terlalu dekat, karena akan menghapus atau tidak terfiksasi dengan baik. *Kesalahan pada kriteria yang diatas bisa menyebabkan negatif palsu. *Kesalahan pada pewarnaan dan screening dapat menyebabkan positif palsu.



Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan sediaan sitologi dan fiksasinya: 1. Objek glass harus benar-benar bersih, terus beri nomor sesuai data biar tidak tertukar, 2. ¾ luas kaca objek memanjang, kita apus merata,tidak terlalu tebal dan terlalu tipis 3. Segera fiksasi sesuai dengan pewarnaan yang akan digunakan 4. Untuk cairan, disentrifuge dahulu dan kemudian diambil untuk diproses 5. Untuk bahan sputum diambil bagian berwarna dan kental untuk dibuat pulasan. Bagian yang lain bisa gunakan sebagai sel blog. B. Sediaan untuk Pemeriksaan Histologi 1. Tahap periksaan dimulai dari penerimaan sampel di tata usaha. Petugas penerima harus mengecek kembali sampel tidak boleh asal terima. - Jaringan atau organ yang diterima harus dalam keadaan terfiksasi dengan formalin buffer 10%(perbandingan jaringan dan cairan fiksasi, 1:9 ) dan ditutup rapat. * Buffer formalin 10% : 1. formaldehid 40% H.CHO = 100 ml 2. Sodium Phospat monobasic NaH2PO4.H2O = 4 gram 3. Sodium Phopat dibasic Na2HPO4 = 6.5 gram 4. Aquadest = 900 ml - Identitas pasien harus dilengkapi seperti, nama, umur, jenis kelamin, alamat, pekerjaan,riwayat penyakit, Dibagian yang ingin diperiksa. - Jenis sampel sampel harus di Cross check, apa sama jenis sampel yang ditulis dengan yang diterima - Dan harus di tanya bagai mana menyampaian hasil pemeriksaan, Jika pasien ingin mengambil sampel sendiri harus ada surat pengantar. - Nama dan alamat dokter pengirim sampel harus ada, Dokter pengirim harus diingatkan jika ada yang tidak sesuai kriteria.



2. 2 Pemeriksaan Makroskopis



Pemeriksaan makaroskopis dilakukan oleh dokter tugas analis kesehatan/teknisi laboratorium mendampingi dokter, melakukan pencatatan hasil pemeriksaan dokter. Pada tahap ini dokter juga akan memotong jaringan yang dicurigai



3. Foto : Jaringan yang sudah dipotong Processing Jaringan Untuk prosessing jaringan memakai alat tissue prosessor automatic yang bekerja ± 18,5 jam(bisa diubah sesuai kebutuhan). Tahapan prosessing jaringan yaitu, Fiksasi, Dehidrasi, clearing, dan infiltrasi paraffin.



Foto : Tissue Automatics Prosessor Tahapan kerja pada Tissue Automatics Prosessor



1) Fiksasi Botol 1. Buffer Formalin 10% 2 jam



2) Dehidrasi Botol 2. Alkohol 70% 1,5 jam Botol 3. Alkohol 80% 1,5 jam Botol 4. Alkohol 95% 1,5 jam Botol 5. Alkoho absolute I 1,5 jam Botol 6. Alkoho absolute II 1,5 jam Botol 7. Alkoho absolute III 1,5 jam



3) Clearing Botol 8. Xylol I 1 Jam Botol 9. Xylol II 1,5 Jam



Botol 10. Xylol III 1,5 Jam



4) Infiltrasi paraffin Botol 11. Paraffin cair I 1,5 jam Botol 12. Paraffin cair II 2 jam Jumlah 18,5 jam



Fiksasi Tujuan : Untuk mempertahankan struktur sel sehingga menjadi stabil secara fisik dan kimiawi dan mencegah terjadi dialysis atau pembengkakan pada rupture. Rumus yang digunakan untuk memonitor fiksasi baik atau buruk diuji dengan rumus: d = k √t d = ketebalan jaringan (mm) t = waktu yang dibutuhkan/tersedia k = ketetapan daya fiksir dari atas dan bawah (2 X ketetapan masing-masing fiksasi) Ketetapan fiksasi formalin 10% = 0.78 Dehidrasi Tujuan : untuk menghilangkan/menarik air dalam jaringan dengan cara mulai konsentrasi terendah sampai konsentrasi tinggi. Clearing Tujuan : Menarik keluar kadar alcohol yang berada dalam jaringan, memberi warna yang bening pada jaringan dan juga sebagai perantara mesuknya kedalam paraffin. Zat yang sering dipakai Xylol, tapi bisa juga dipakai : benzol, benzene, toluol,dll. Untuk jaringan otak dan limfonoid lebih baik menggunakan koloform. Infiltrasi paraffin Tujuan : Mengisi rongga atau pori-pori yang ada pada jaringan setelah setelah ditinggal cairan sebelumnya(xylol). Jumlah waktu : 18,5 Jam



4. . Pengeblokkan Tujuan : Agar mudah dipotong menggunakan mikrotom untuk mendapatkan irisan jaringan yang sangat tipis (sesuai yang diharapkan).



Foto : Cetakan Cara Kerja : 1) Hangatkan paraffin cair, pinset, dan penutup cetakan 2) Parafin cair dituangkan kedalam cetakan 3) Jaringan dari prosessing dimasukan kedalam cetakan yang telah disi paraffin cair, tekan jaringan agar semakin menempel di dasar cetakan. 4) Tutup cetakan diambil, letakkan diatas cetakan dan di tekan.Pasang etiket di pinggir. 5) Biarkan sampai membeku 6) Setelah beku, keluarkan dari cetakan. Rapikan sisi-sisi blog. Ganti etiket dengan yang permanen



Foto : cetakan yang telah diisi jaringan dan paraffin



Foto : Blok jaringan



Foto : Blok jaringan



5. Pemotongan dengan Mikrotom



Foto : Mikrotom



Foto : Mikrotom dengan blok jaringan



1) Sebelum pemotongan Masukan kedalam plastik yang diisi air dan letakkan di freezer ±15 menit atau diberi batu es. 2) Blok dijepit pada mikrotom kemudian dipotong dengan pisau mikroto. Kemiringan : ±300 , Tebal blok paraffin ±2-5mikron. 3) Hasil pemotongan (berupa pita/irisan tipis yang saling bersambung) dimasukkan kedalam waterbath yang diisi air yang sudah dihangatkan 50 0 C, kemudian diambil dengan kaca objek (Meletakkan potongan di waterbath tidak boleh terbalik).



Foto : Waterbath Cttn : Pisau dan waterbath bisa diberi alcohol 50% untuk menurunkan tegangan permukaan yang membantu merentangkan pita. Objek glass jangan diolesi albumin gliserin karena biasanya albumin bila diinkubasi akan mengeras.menjaga agat jangan lepas saat pengecatan 6. Inkubasi Tujuan : Menguapkan air yang terbawa oleh hasil potongan hingga jaringan menempel lebih kuat. Cara kerja : inkubasi preparat di atas hot plate dengan suhu±500 C(dibawah titik cair paraffin) selama 15 menit  Sebaiknya dialasi dengan kertas merang.



 Untuk pengecatan imunnohistokima inkubasi 390C selama 1 malam 7. Pengecatan Umumnya dalam pengecatan histopatologi digunakan cat Hetatoxylin-Eosin (HE) disamping cat khusus (PAS, gomori, ZN, Malory, dll) dan cat yang lebih khusus yaitu immunohistokimia (ER, PR, CD20, LMP, dll)



Foto : Peralatan pengecatan Proses pengecatan : 1) Deparafinisasi Preparat masuk ke Xylol I, II, dan III masing-masing 3 menit Setelah itu dilap pinggir jaringan dengan kain kasa. 2) Rehidrasi Preparat masuk ke alcohol 100%, 95%, 80%, 70% masing-masing 2 menit 3) Preparat masuk ke air mengalir 3 menit (air mengali ditampung dalam wadah ) Sebelumnya celup kedalam dua mangkok air 3 celup 4) Pengecatan Inti 7 menit



Preparat masuk ke dalam Meyer hematoksilin 5) Preparat masuk ke air mengalir 3 menit (air mengali ditampung dalam wadah ) Sebelumnya celup kedalam dua mangkok air 3 celup 6) Counter Stain Preparat masuk ke larutan eosin 7 celup 7) Preparat Masuk ke air wadah I, II, dan III 3 celup 8) Dehidrasi Preparat masuk ke dalam alcohol 70 %, 80%, 95%,100% 3 celup Setelah itu Dilap dengan kain kasa sekitar jaringan dan tunggu sampai kering 9) Clearing Preparat masuk Ke Xylol I, dan II masing-masing 2 menit 10) Mounting 11) Preparat diberi 1 tetes entelan dan ditutup objek glass



Foto : Peralatan pengecatan



Foto : Preparat/sediaan histologi Ket : Deparafinisasi Tujuanya : Berfungsi melarutkan/melepaskan paraffin yang melekat pada preparat. Rehidrasi Berfungsi menghilangkan xylol yang terbawa oleh preparat dan memasukan air kedalam jaringan Air mengalir Melepaskan sisa cat atau cairan yang terbawa sebelumnya Meyer Hematoksilin Memberikan warna biru pada inti sel Eosin Memberi warna merah pada sitoplasma, jaringan ikat,dll Dehidrasi Melepaskan aira yang terbawa preparat



Clearing Melepastan alcohol yang terbawa oleh preparat dan memberi warna bening pada preparat Mounting Memberi warna cerah dan sebagai pelindung dan pengawet jaringan dari mikroba dan bakteri.



Teknik Pembuatan Sediaan Histologi:



1) Pengambilan Bahan



Mengambil bahan dari tubuh hewan yang masih hidup atau selembat-lambatnya 4 jam post-mortem, untuk menghindari terjadinya pencernaan oleh enzim (autolisis) atau bakteri. 2) Fiksasi



Untuk mencegah terjadinya post mortem, mengeraskan jaringan supaya mudah dipotong. Bahan untuk larutan fiksasi adalah formalin 10%, mercuri bichloride, kalium bichloride, osmic acid, pieric acid, acetic acid, ethyl alcohol, larutan buoin dan lainnya.



3) Dehidrasi



Bertujuan untuk menarik air dari jaringan dan diganti dengan alkohol. Caranya jaringan dimasukkan ke dalam alkohol dengan konsentrasi meningkat yaitu dari 70% sampai alkohol absolut



4) Penjernihan (Clearing)



Bertujuan agar jaringan menjadi transparan. Menggunakan xylol, toliol, chloroform, benzene, cedar oil.



5) Pengeblokan (Embedding)



Bertujuan untuk menginfiltrasi parafin ke dalam jaringan. Caranya memasukkan potongan jaringan dan parafin dalam oven agar parafin mencair kemudian dilakukan pencetakan.



6) Pemotongan (Sectioning)



Blok parafin yang sudah siap dipotong menjadi tipis yang disebut ribbon menggunakan mikrotom setebal 3-10 mikron. Masukkan ke water bath agar mencegah terjadinya artefak lipatan dan mencairkan parafin yang terpotong dalam jaringan. Kemudan jaringan diletakkan dalam obyek glass.



7) Pengecatan (Staining)



Bertujuan untuk memberikan kontras alamiah yang sudah ada dan untuk menonjolkan sel, jaringan dan bahan eksentrik yang hendak diteliti. Pada umumnya bahan cat larut dalam air, maka parafin yang tersisa harus dibersihkan dengan xylol, kemudian alkohol dengan konsentrasi menurun (dari alkohol absolut ke alkohol



70%) bertujuan kembali



memasukkan



air



ke



dalam



jaringan



8) Penutupan sediaan (mounting)



Setelah dicat maka kelebihan cat dibersihkan dengan air atau alkohol kemudian diberikan balsam Canada satu tetes, ditutup dengan cover glass.