Pedoman Penanganan Bahan Pemeriksaan Histopatologi [PDF]

Citation preview

PEDOMAN PENANGANAN BAHAN PEMERIKSAAN UNTUK HISTOPATOLOGI



Perhimpunan Dokter Spesialis Patologi Indonesia (IAPI)



PEDOMAN PENANGGANAN BAHAN UNTUK PEMERIKSAAN PATOLOGI DAN SITOLOGI Oleh Perhimpunan Dokter Spesialis Patologi Indonesia I.



PENDAHULUAN Diagnosis histopatologi dan sitologi, yang merupakan hasil interprestasi pemeriksaan histopatologi dan sitopatologi, sampai saat ini masih merupakan “baku emas” bagi diagnosis sebagian besar penyakit. Ketepatan diagnosis histopatologi dan sitopatologi bergantung kepada : 1. Penanganan dan pengolahan bahan pemeriksaan yang lebih baik sehingga dapat diinterprestasi serta dapat dikembangkanlebih lanjut untuk pemeriksaan molekuler dan genetik 2. Kompetensi Dokter Spesialis PA Penanganan bahan pemeriksaan yang baik dan benar merupakan tugas bersama antara Rumah Sakit, klinis dan Sentra Diagnostik Patologi Anatomik. Kompetensi Dokter Spesialis Patologi Anatomik menjadi kewenangan Kolegium Patologi Anatomik Mutu hasil proses jaringan sangat erat hubungannya dengan penanganan bahan pemeriksaan yang benar sejak awal jaringan/ sel dan cairan dipisahkan dari tubuh. Tahap ini dilakukan di kamar tindakan atau klinik, disebut sebagai penanganan pra – analtik. Pada tahap ini kegiatan utamanya ialah melakukan pencatatan data pasien dan reservasi jaringan/ sel pasca oprasi/ biopsi. Tahap selanjutnya, analtik, dilakukan setelah jaringan/ sel tiba di Sentra Diagnostik Patologi Anatomi yang juga terdiri atas pencatatan data bahan pemeriksaan dan pasien, yang selanjutnya diikuti oleh pengolahan bahan pemeriksaan. Rumah Sakit atau institusi yang membawahi fasilitas tindakan atau Sentra Diagnostik Patologi Anatomik juga memiliki tugas dan tanggung jawab mutu hasil pengolahan sediaan, karena berbagai jenis reagen dan peralatan yang disediakan oleh RS dan institusi yang seharusnya bermutu sesuai standar. Adalah hak pasien untuk mendapat hasil pengolahan jaringan yang baik dan kewajiban pasien untuk membayar biaya pengolahan jaringan tersebut. Pedoman ini dibuat sebagai pegangan penanganan bahan untuk pemeriksaan patologi dan sitopatologi serta menetapkan tugas dan tanggung jawab pad setiap tahap tindakan penanganan bahan pemeriksaan.



II.



HAKEKAT PENGOLAHAN BAHAN PEMERIKSAAN Diagnostik histopatologi dan sitopatologi pada dasarnya adalah penilaian terhadap gambar yang terdapat pada preperat histopatologi dan sitopatologi. Oleh karena itu, tujuan akhir pengolahan bahan pemeriksaan ialah agar gambar yang terjadi pada preperat benar – benar mencerminkan apa yang seharusnya tergambar pada bahan pemeriksaan. Jadi pengolahan bahan pemeriksaan yang baik ialah pengolahan yang tidak mengubah atau menghilangkan apa yang seharusnya ada pada bahan pemeriksaan. Bahan pemeriksaan yang diolah ialah bahan pemeriksaan yang berasal dari tubuh pasien yang masih hidup, sehingga ada kemungkinan terjadi perubahan, namun harus diupayakan agar perubahan yang terjadi sekecil mungkin, suhingga tidak mempengaruhi penilaian. Hal ini dapat tercapai melalui rangkaian kegiatan pengolahan yang secara empiris terbukti baik.



III.



PENANGANAN BAHAN PEMERIKSAAN PADA FASE PRA – ANALTIK Penanganan bahan pemeriksaan yang dilaksanakan ditempat pengambilan bahan pemeriksaan, dan menjadi TANGGUNG JAWAB PIHAK KLINIK. Tahap ini merupakantonggak pertama yang merupakan syaratagar hasil pemrosesan bahan pemeriksaan dan penanganan selanjutnya dapat berlangsung dengan baik. Tercakup dalam tahap ini adalah : A. Kelengkapan Identitas Pasien dan Keterangan Klinik Yang Relavan 1. Administrasi Pengisisan formulir pengantar tentang pasien yang mencakup data :  Identitas pasien : nama, umur, jenis kelamin, alamat, suku, agama, pekerjaan  Keterangan klinik : lokasi dan ukuran lesi, durasi, keluhan lain yang berhubungan, termasuk keterangan tentang penyakit atau pemeriksaan Patologi Anatomik terdahulu, dan penyakit yang mudah menular atau perlu penanganan khusus seperti AIDS, keterangan klinis khusus lainnya yang diperlukan (misal riwayat obstetri ginekologi)  Hasil pemeriksaan : diagnosis klinik serta pemeriksaan penunjang yang lain seperti : data laboratorium klinik, ataupun radiologi yang berkaitan  Status ekonomi : seperti asuransi, kelas rawat dll 2. Cara mendapatkan bahan Keterangan tentang cara memperoleh bahan pemeriksaan seperti operasi, insisi, eksisi, kerokan, sikatan, bilasan, apusan, fungsi biopsi aspirasi jarum halus (FNAB), nekrosis. (Otpsi merupakan pelayanan patologi tersendiri) 3. Lokasi bahan/ organ



Dikemukakan bila ada pengambilan bahan secara khusus dan perlu penanganan khusus seperti :  Jenis jaringan tertentu  Pemeriksaan radikalitas operasi  Batas sayatan dan tanda khusus (misal memberi benang atau gambar jaringan dengan keterannya) 4. Kondisi lesi Misalnya berupa bentuk, benjolan, ukuran, konsistensi, terfiksir atau tidak, warna dan tampilan jaringan saat operasi B. Penanganan Jaringan dan Cairan/ Apusan Pasca Biopsi/ Oprasi I. Penanganan Jaringan 1. Persiapan wadah yang besarnya sesuai dengan jaringan yang akan disimpan. Sebaiknya jarangan tidak dipaksakan dimasukkan dalam wadah yang lebih kecil dari ukuran jaringan, sehingga terjadi penekukan yang dapat merusak bentuk jaringan. 2. Isi wadah dengan formalin 10% bufer dengan volume minimal 5 kali volume jaringan 3. Masukkan sesegera mungkin jaringan segar ke dalam wadah formalin (kurang dari 30 menit) 4. Jika jaringan berukuran besar misalnya mastektomi lakukan irisan sejajar berjarak kira – kira 1 cm agar seluruh bagian jaringan terpapar formalin. Irisan harus sedemikian rupa sehingga masih dapat dengan mudah dilakukan rekontruksi oleh Spwsialis Patologi anatomik. 5. Beri label identitas pasien dan jenis jaringan yang diambil agar tidak tertukar, segera dikirim ke sentra Diagnostik Patologi Anatomik disertai formulir pengantar yang telah diisi lengkap. 6. Fiksasi Fiksasi merupakan langkah yang sangat penting dan harus dilaksanakan dengan sempurna menggunakan zak fisikator yang baik, karena sangat mempengaruhi langkah selanjutnya dalam pengolahan jaringan



Tujuan fiksasi adalah :  Mencegah terjadinya autolysis dan pengaruh bakteri  Mempertahankan bentuk dan isi jaringan mendekati keadaan sebelum difiksasi  Memungkinkan proses pengolahan jaringan selanjutnya berjalan dengan baik  Mempertahankan komponen – komponen jaringan atau sel, (mengusahakan agar sedikit mungkin molekul yang hilang pada proses selanjutnya) Pada pengolahan jaringan dapat dipastikan ada unsur – unsur jaringan yang hilang atau rusak. Fiksasi yang baik ialah yang memungkinkan unsur protein tetap ada atau berkurangnya minimal. Unsur lipid akan selalu hilang kecuali menggunakan teknik khusus (poton beku) Ada banyak zat yang bisa dipakai untuk fiksasi, tetapi secara empiris terbukti untuk pemeriksaan rutin (morfologi) dan immunohistokimia, zat formalin 10% dengan PH sekitar 7 adalah yang optimun. Untuk keperluan lain zat fiksasi yang baik antara lain : Misalnya : - alkohol 96% untuk sediaan apus - Ethanol/ methanol untuk asam nukleat Volume zat fiksasi juga harus diperhatikan, yang baik adalah 1 berbanding 5 sampai 10 untuk jaringan. Konsentrasi formalin berpengaruh pada kecepatan infiltrasinya. Konsentrasi tinggi, infiltrasinya cepat tetapi bagian jaringan yang sudah terfiksasi menjadi keras dan menghambat penetrasi selanjutnya Cara pembuatan zat fiksasi dengan formalin berdasar fosfat adalah sebagai berikut : Larutan formaldehade 40% ...................................................................... 100 cc Aquadest ................................................................................................... 900 cc Sodium dihidrogrn fosfat monohidrat ...................................................... 4.0 g Disodium hidrogen fosfat anhidrat........................................................... 6.5 g



Daya penetrasi zat fikasatif ditentukan oleh faktor waktu dan besaran konstante zat fiksatif : Rumus : d = k √t d : dalamnya penetrasi dalam mm k : konstante zat fiksatif, misalnya : formalin 10% = 0,78 glutaraldehyde = 0,25 acetic acid = 1,2 t : waktu dalam jam II.



IV.



Penanganan Cairan dan Apusan 1. Bahan apusan diapuskan pada gelas obyek, dan segera dimasukkan dalam cairan fiksasi alkohol 96% minimal selama 30 menit. Sesudah 30 menit gelas obyek dapat dikeringkan dan dikirim ke Sentra Diagnostik Patologi Anatomik. 2. Bahan cairan dapat dikirim sedera ke Sentra Diagnostik Patologi Anatomik tanpa fiksasi (sesegera mungkin) atau dimasukkan dalam cairan fiksasi alkohol 50% (volume 1 : 1) 3. Bahan apusan sitologi aspirasi dapat dibiarkan kering dalam suhu udara kamar (untuk pilasan Giemsa), kemudian dikirim ke Sentra Diagnostik Patologi Anatomik (dengan keterangan yang jelas). 4. Bahan sputum sebaiknya dikirim segera di dalam wadah tertutup tanpa fikasi.



PENANGANAN BAHAN PEMERIKSAAN PADA FASE ANALTIK Ruang lingkup TAHAP ANALTIK dimulai sejak spesimenditerima di Sentra Diagnostik Patologi Anatomik untuk dilakukan pengolahan bahan pemeriksaan sampai menjadi blok parafin dan sediaan siap dibaca Spesialis Patologi Anatomik. Tanggung jawab atas segala sesuatu yang berkaitan dengan mutu sediaan pada tahan ini adalah Spesialis Patologi Anatomik dan teknisi. Tahap ini dapat dibagi atas penerimaan spesimen, pemotongan dan pencatatan makroskopik, pengolahan secara manual atau dengan mesin serta pembuatan blok parafin, pengolahan hingga pembuatan blok parafin yang sesuai standar akan menghasilkan blok parafin yang siap/ layak untuk berbagai pulasan/ pemeriksaan rutin dan canggih (immunohistokimia, hibridsi in – situ, PCR, tissue microarry, dan lain – lain)



A. Tahap Penerimaan Spesimen Pada saat menerima spesimen, setelah petugas loket menyelesaikan kelengkapan administrasi berupa identitas pasien (nama lengkap, jenis kelamin, usia, jumlah spesimen) kemudian akan diserahkan kepada teknisi kamar potong. Teknisi kamar potong kembali memeriksa kesesuaian antara spesimen dengan keterangan dalam formulirpengantar. Kemudian teknisi memeriksa apakah fiksasi sudah benar. Jika belum benar maka harus segera melakukan perbaikan – perbaikan. Cara fiksasi yang benar adalah : 1. Fiksasi berupa larutan formalin 10% bufer fosfat. 2. Volume fiksatif minimal 5x volume spesimen. 3. Jaringan besar dibuat sayatan sejajar dengan pisai tajam berjarak 0,5 – 1 cm agar fiksatif merata pada seluruh bagian jaringan luar dan dalam. 4. Jaringan yang siap diproses adalah yang sudah terfikasi dengan sempurna (matang), yaitu yang sudah keras konsistennya dan tidak berwarna kemerahan lagi (putih atau coklat). B. Tahapan Pemotongan dan Pencatatan Makroskopik Pada prinsipnya, pemotongan dilakukan untuk mengambil bagian jaringan yang representatif. Potongan dilakukan dengan tebal maksimum tidak melebihi tebal kaset jaringan (Gambar 1), dan dimasukkan ke dalam kaset jaringan yang telah diberi nomor sesuai nomor formulir (Gambar 2) Banyak potongan yang akan diproses selanjutnya bergantung kepada jenis jaringan dan besarnya jaringan. Ada beberapa organ yang memerlukan jumlah potongan (sediaan) tertentu, misalnya : - Prostat : 3-6 potongan - Uterus : dibuat potongan dari serviks, endometrium, myometrium tumor dan bagian lain yang penting untuk diagnosis. - Usus : dibuat potongan-potongan untuk menentukan jenis kelainan, dalam infiltrasi, ujung ujung syatan, nodul limfoid dan bagian lain yang dianggap perlu. Gambar 1. Pemotongan Makriskopik



Setelah dimasukan ke dalam kaset dan ditutup, kaset dimasukan ke dalam wadah yang berisi formalin 10% bufer fosfat atau alkohol, karena kaset jaringan tersebut tidak boleh dibiarkan kering oleh udara. Dalam hal bahan yang terdiri atas jaringan tulang, diperlukan perlakuan tambahan dengan cara merendam tulang tersebut dalam cairan dekalsifikasi, misalnya HNO3, EDTA untuk menghilangkan kalsiumnya. Lama perendaman bergantung kepada jenis larutan dekalsifikasi. Jika ternyata jaringan belum sempurna fiksasinya, kaset jaringan dimasukan dalam wadah berisi formalin 10% bufer fosfat, namun jika sudah sempurna dimasukkan ke dalam wadah berisi alkohol 70% (Gambar 2).



Gambar 2. Fiksasi buffer formalin



Setelah seluruh kaset jaringan terkumpul, dapat dilanjutkan diproses dalam mesin atau secara manual. Dalam pengolahan, yang dilakukan adalah serangkaian prosedur untuk mengganti unsur air dan fiksatif dalam jaringan dengan parafin agar diperboleh penyatuan yang sempurna antara jaringan dengan parafin dalam satu blok. Jika penyatuan tidak sempurna maka akan diperoleh blok parafi yang tidak homogen dan akan mudah pecah dalam pemotongan atau proses selanjutnya. Penggantian dilakukan dengan cara menarik air diganti oleh alkohol. Kemudian dilanjutkan dengan xylol yaitu media perantara yang dapat larut dalam air dan parafin, sehingga alkohol digantikan oleh xylol. Setelah itu direndam (impregnasi/infiltrasi) dalam parafin cair, sehingga seluruh ruang jaringan yang semula berisi xylol diganti oleh parafin yang bertitik lebur paling tinggi 60oC. Pada saat jaringan di masukan ke dalam parafin cair, maka temperatur akan mempengaruhi jaringan. Temperatur tinggi akan menyebabkan jaringan menjadi keras, keriput dan rusak sehingga akan sulit di potong. Oleh karena itu sebaiknya di pakai parafin yang titik leburnya 58oCdan tempertur parafinnya tidak melebihi 60oC. Waktu yang diperlukan pada proses impregnasi ini bergantung kepada besarnya jaringan. Untuk jaringan besar (sebesar 1 kaset), diperlukan waktu sekurang-kurangnya 3 jam.



Pengolahan dengan mesin dapat dilakukan denga siklus pendek untuk jaringan (biopsi) atau siklus panjang untuk jaringan besar. Pada mesin biasanya wadah yang pertama dapat diisi formalin untuk menyempurnakan fiksasi yang belum sempurna Tahap DEHIDRASI



Tahap CLEARING



Tahap IMPREGNASI Gambar 3. Pemrosesan jaringan



Dehidrasi dilakukan dengan alkohol konsentrasi bertahap untuk menarik seluruh kandungan air dari sel dan jaringan dan TIDAK MENGGUNAKAN ACETON. Kemudian dilakukan “clearing” dalam larutan xylol, untuk menarik alkohol keluar dan memungkinkan parafin masuk ke dalam jaringan. Selanjutnya dilakukan “impregnasi”dalam parafin cair dan jaringan siap untuk dibuat blok parafin. Metode Prosesing Jaringan : 1. Peyempurnaan Fiksasi 2. Dehidrasi



3. Clearing 4. Impregnasi



: Formalin 10% : Alkohol 70% Alkohol 95% Alkohol 100% Alkohol 100% Alkohol 100% Alkohol 100% Alkohol 100&/xylol : Xylol Xylol : Parafin Parafin



0-3 jam ½ jam ½ jam ½ jam 1 jam 1 jam 1 jam ½ jam 1 jam 2 jam 2 ½ jam 4 jam



C. Pembuatan Blok Parafin Dalam pembutana blok parafin, sangat penting untuk diperhatikan orientasi jaringan dengan benar sehingga akan diperoleh potongan sediaan yang representatif. Perlu diperhatikan cara peletakan jaringan permukaan / mukosa (usus, endrometrium, buli, ureter, pembuluh darah besar dan lai lain), dinding kista, dan kulit agar dapat mempresentasikan seluruh lapisan yang ada secara utuh. Melakukan “embedding” jaringan kerokan juga harus diyakini bahwa seluruh keping jaringan berada dipermukaan sehingga akan muncul secara utuh dalam pemotongan dengan mikrotom. Jangan lupa memeriksa apakah nomor pada blok parafin masih jelas sebelum dipotong.



Gambar 3. Embedding



Gamabar 4. Pemotongan dengan Mikrotom



Sebelum dilakukan pemotongan blok paraffin didinginkan pada lempeng pendingin/ es batu/ lemari es. Pemotongan menggunakan mikrotom dilakukan dengan pisau yang tajam/disposible.



Gambar 5. Pita Potongan Tipis Blok Paraffin di Floatin Bath



Pita parafin dimekarkan dengan cara yang beragam, antara lain dengan menggunakan penangas air atau ditempelkan langsung pada kaca benda yang telah dibasahi air kemduian diletakkan pada lempeng penghangat dengan suhu 60 drjt C.



Gambar 6. Rehidrasi diperlukan karena pewarnaan yang dipakai adalah berbasis air.



Gambar 7. Ringkasan langkah pewarnaan.



Rujukan 1.



Allen DC. Histopathology Reporting Guidlines for Surgical Cancer. London : Springer ; 2000 Hopwood D. Fixation and Fixiatives. In : Bancroft JD, Gamble M. (eds). Theory and Practice of Histologicaltechniques. 5th Ed. Edinburgh; Churchill Livingstone; 2002. P 63 – 84 Anderson G, Bancroft J. Tissue Processing and Microtomy In : Bancroft JD, Gamble M. (eds). Theory and Practice of Histologicaltechniques. 5 th Ed. Edinburgh; Churchill Livingstone; 2002. P 85 - 109 Horbin RW. Theory of Staining and its Practocal Implications In : Gamble M. (eds). Theory and Practice of Histologicaltechniques. 5 th Ed. Edinburgh; Churchill Livingstone; 2002. P 109 - 23 Gamble M, Wilson I. The Hematoxylins and Eosin. In : Gamble M. (eds). Theory and Practice of Histologicaltechniques. 5th Ed. Edinburgh; Churchill Livingstone; 2002. P 125 - 38 American Society of Clinical Oncology (ASCO) ; ASCO Patient guide HER2 Testing for breast cancer. Jornal of Clinical oncology; 2007 January 1



2. 3. 4. 5. 6.



METODE PROSESING MANUAL/ JALAN TANGAN 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.



FORMALIN.................................................................................................... ALKOHOL I .................................................................................................... ALHOHOL II .................................................................................................. ALKOHOL III .................................................................................................. ALKOHOL IV.................................................................................................. XYLOL I ......................................................................................................... XYLOL II ....................................................................................................... XYLOL III ...................................................................................................... PARAFIN ...................................................................................................... PARAFIN .......................................................................................................



Dengan pemanasan 45 C, lama tiap tahap cukup 5’ (Bancroft) REAGEN YANG DIPAKAI    



Formalin 37% Alkohol 96% Xylol Lilin Histoplast



20 Menit 20 Menit 20 Menit 20 Menit 20 Menit 20 Menit 20 Menit 20 Menit 30 Menit 30 Menit



1. PENGAMBILAN SPESIMEN JARINGAN



2. IRISAN JARINGAN UNTUK FIKSASI



3. PROSES FIKSASI



4. PROSES DEHIDRASI, CLEARING, & INFILTRASI PARAFIN



5. PEMBUATAN BLOK PARAFIN (EMBEDDED BLOCK)



Jika blok parafin diolah sesuia standar, maka siap untuk pemeriksaan lanjutan IHK, FISH dan lain lain. Pengiriman jaringan untuk IHK/FISH dapat berupa : a. Jaringan basah dengan Formalin 10% buffer atau b. Blok Parafin disertai sediaan HE



What is The Optimal Testing Algorithm for the Assessment of HER2 Status ? Breast cancer specimen (Invasive component)



HER2 testing by validated IHC assay for HER2 protein expression



Positive for HER2 protein expression IHC 3+ (defined as uniform intense membrane staining of > 30% of invasive cells



Equivocal for HER2 protein exprssion IHC 2+



Negative for HER2 protein exprssion IHC 0 or 1+



Test with validate assay for HER2 amplivication



Positive for HER2 gane amplification



Equivocal HER2 gene amplification (Patient with HER2/ CEP17 ratio = 2.0 where eligible for the adjuvant trastuzumab trials)



Negative for HER2 gane amplification



Breast cancer specimen (Invasive component)



HER2 testing by validated FISH assay for HER2 gene amplification



Positive for HER2 gene amplification (FISH ratio > 2.2 or HER2 gene copy > 6.0)



Equivocal for HER2 gene amplification (FISH ratio > 1.82.2 or HER2 gene copy 4.6-6.0*)



Negative for HER2 gene amplification (FISH ratio > 1.8 or HER2 gene copy < 4.0)



Count additional cells for FISH or retest, or test withHER2IHC



Equivocal HER2 gene amplification result (Patient with HER2/ CEP17 ratio = 2.0 were eligible for the adjuvant trastuzumab trials)