Makalah Seminar Literatur Selfiyantirevisi1 [PDF]

Citation preview

EVALUASI AKTIVITAS ENZIMATIK INULINASE KOMERSIAL DARI Aspergillus niger YANG DI IMOBILISASI DENGAN POLIURETAN



SEMINAR LITERATUR



OLEH :



SELFI YANTI SAFITRI NIM.1203113473



JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS RIAU PEKANBARU 2015



LEMBARAN PENGESAHAN



Nama Mahasiswa



: Selfi Yanti Safitri



NIM



: 1203113473



Jurusan



: KIMIA



Fakultas



: MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM



Judul Seminar Literatur



: EVALUASI AKTIVITAS ENZIMATIK INULINASE KOMERSIAL DARI Aspergillus niger YANG DI IMOBILISASI DENGAN POLIURETAN



Pekanbaru, November 2015 Mengetahui,



Menyetujui,



Ketua Jurusan Kimia



Pembimbing Seminar Literatur,



FMIPA UR,



Dra. Itnawita, M.Si NIP.19610505 198803 2 001



Prof.Dr.Saryono, M.Si NIP.19620611 198903 1 005



KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena atas berkat dan rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan makalah seminar literatur yang berjudul “Evaluasi Aktivitas Enzimatik Inulinase Komersial dari Aspergillus niger Yang di Imobilisasi Dengan Poliuretan”. Tujuan penulisan makalah ini adalah untuk mempelajari dan membahas penelitian yang telah dilakukan oleh Silva dkk. (2013) tentang Evaluation of enzymatic activity of commercial inulinase from Aspergillus niger immobilized in polyurethane foam. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada bapak Prof. Dr. Saryon, M.Si selaku dosen pembimbing yang telah meluangkan waktunya untuk memberikan bimbingan dan arahan kepada penulis sehingga makalah seminar literatur ini dapat diselesaikan dengan baik. Penulis berharap semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi kita semua dalam pengembangan ilmu pengetahuan di masa depan. Akhir kata penulis mengucapkan terima kasih kepada seluruh pihak yang telah membantu dalam penyelesaian makalah ini. Pekanbaru, November 2015



Selfi Yanti Safitri NIM: 1203113473



EVALUASI AKTIVITAS ENZIMATIK INULINASE KOMERSIAL DARI Aspergillus niger YANG DI IMOBILISASI DENGAN POLIURETAN



SELFI YANTI SAFITRI NIM. 1203113473 Ringkasan Tujuan penelitian ini adalah untuk mengevaluasi stabilitas inulinase komersial dari Aspergillus niger yang telah diimobilisasi dengan menggunakan poliuretan. Penentuan aktivitas enzim menggunakan reaksi hidrolisis sukrosa maupun inulin pada suhu 50°C dan pH 5,5. Enzim yang telah digunakan sebanyak 29 kali selama 59 hari berhasil dievaluasi. Imobilisasi inulinase pada poliuretan dapat mempertahankan aktivitas awal sebanyak 49.7 % dan 49.4% untuk hidrolisis inulin dan sukrosa dimana enzim inulinase telah digunakan selama 1008 jam dan 24 kali digunakan. Pada penelitian ini, imobilisasi enzim dilakukan bersamaan dengan pembentukan busa poliuretan. Kata kunci : Inulinase, Aspergillus niger, imobilisasi, poliuretan, aktivitas enzim



DAFTAR ISI LEMBARAN PENGESAHAN



ABSTRAK DAFTAR ISI DAFTAR GAMBAR DAFTAR TABEL BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang 1.2 Perumusan Masalah 1.3 Tujuan Penulisan BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Inulinase 2.2 Imobilisasi Enzim 2.2.1 Metode imobilisasi enzim 2.2.1.1 Adsorpsi Fisika 2.2.1.2 Metode Penjebakan Enzim 2.2.1.3 Metode Ikatan Silang 2.2.1.4 Metode Ikatan Kovalen 2.2.2 Matriks Imobilisasi Enzim BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat yang digunakan 3.1.2 Bahan yang digunakan 3.2 Prosedur Penelitian 3.2.1 Imobilisasi Inulinase 3.2.2 Aktivitas Inulinase 3.2.3 Karakterisasi Struktur Katalis BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN BAB V KESIMPULAN DAFTAR PUSTAKA DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1. Reaksi enzim bebas dan enzim yang diimobilisasi Gambar 2.2. Tiga teknik umum imobilisasi enzim Gambar 2.3. Metode ikatan silang Gambar 3.1 Prosedur penelitian imobilisasi enzim inulinase Gambar 4.1 Aktivitas residual untuk pemanfaatan kembali inulinase Gambar 4.2 kandungan protein dan aktivitas spesifik inulinase



DAFTAR TABEL Tabel 2.1 Klasifikasi matriks imobilisasi enzim Tabel 4.1 Variasi temperatur reaksi sebagai fungsi volume monomer



BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar belakang Inulase adalah enzim yang berpotensi untuk memproduksi High Fructose Syrups (HFS) melalui reaksi hidrolisis enzimatik inulin, menghasilkan rendemen 95% (Missau dkk, 2014). Enzim Inulinase (R-fruktosidase) bekerja dengan memotong satuan fruktosa dari inulin pada posisi terminal 0-2,1 dan digolongkan sebagai 2,1-8-D-fruktofruktanohidrolase (EC 3.2.1.7). Kemampuan ini berperan dalam menghidrolsis inulin dari



umbi dahlia untuk memperoleh fruktosa atau fruktooligosakarida (FOS) sebagai serat inulin baik SDF (Solouble Dietary Fiber/serat larut air) maupun sebagai IDF (Insoluble Dietary Fiber/serat tak larut air) untuk anti kolesterol (Susilowati, 2013). Enzim inulinase yang bebas perlu dilakukan imobilisasi. Imobilisasi enzim meningkatkan sifat katalitik enzim, memungkinkan pemakaian enzim secara berulang dan terus-menerus sehingga ekonomis untuk diaplikasikan pada industri (Missau dkk, 2014). Enzim terimobilisasi dapat dengan mudah dipisahkan dari campuran reaksi. Ada berbagai macam metode imobilisasi enzim yaitu menggunakan proses adsorpsi, ikatan kovalen, ikatan silang, enkapsulasi dan penjebakan di dalam matriks (bahan pendukung). Diantara bahan pendukung, poliuretan adalah matriks polimer yang sangat baik untuk imobilisasi enzim inulinase karena stabilitas kimia dan mekaniknya (Skowronek dkk, 2011). Selain itu, menurut Silva dkk (2013) poliuretan merupakan bahan pendukung yang resisten terhadap pelarut organik dan secara biokimia karakteristiknya adalah inert. Berdasarkan aspek-aspek tersebut dan kurangnya literatur mengenai imobilisasi enzim yang menggunakan poliuretan sebagai matriks Silva,dkk (2013) melakukan evaluasi aktivitas enzimatik inulinase yang diimobilisasi pada poliuretan menggunakan enzim inulinase komersial dari Aspergillus niger. 1.2 Tujuan Penulisan Tujuan penulisan makalah ini adalah untuk mempelajari dan mengetahui penelitian yang telah dilakukan oleh Silva, dkk (2013) mengenai evaluasi aktivitas enzimatik inulinase yang diimobilisasi pada poliuretan menggunakan enzim inulinase komersial dari Aspergillus niger.



BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Inulinase Inulinase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis inulin, cadangan polisakarida pada tumbuhan menjadi fruktosa dan fruktooligosakarida yang banyak digunakan sebagai makanan tambahan (Laoklom, 2012). Inulinase diklasifikasikan menjadi endo-inulinase dan ekso-inulinase tergantung caranya menghidrolisis inulin. Endo-inulinase (2,1-β-D-fructan fruktanohidrolase; EC 3.2.1.7) menghidrolisis ikatan molekul inulin dari bagian dalam menghasilkan oligosakarida. Ekso-inulinase (β-Dfructohidrolase-; EC 3.2.1.80), memecah unit fruktosa terminal dari ujung yang tidak



mereduksi, enzim ini juga dapat menghidrolisis molekul sukrosa dan rafinosa (Sirisansaneeyakul, 2007). Inulinase mengkatalisis reaksi hidrolisis inulin dapat diproduksi oleh beberapa mikroorganisme, seperti Kluyveromyces, Aspergillus, Staphylococcus, Xanthomonas, dan Pseudomonas. Jamur seperti Kluyveromyces fragilis, K. marxianus, Candida kefyr, Debaryomyces cantarelli, and fungi, Penicillium, dan spesies Aspergillus adalah mikroorganisme yang umumnya dapat memproduksi inulinase (Dilipkumar, dkk. 2013). Inulinase digunakan untuk memproduksi sirup fruktosa, fruktooligosakarida, etanol, dan inulooligasakarida, yang banyak digunakan dibidang farmasi dan industri pangan (Narayanan, dkk. 2013). Menurut El-Naggar,dkk. (2014) sirup fruktosa memiliki pengaruh yang menguntungkan bagi pasien diabetes, meningkatkan absorbsi besi pada anak-anak, memiliki rasa manis yang tinggi sehingga dapat digunakan untuk diet bagi orang obesitas, merangsang absorbsi kalsium pada wanita menopaus, merangsang pertumbuhan bifidobakteria dalam usus halus dan usus besar, mencegah kanker usus. 2.2 Imobilisasi Enzim Istilah “enzim amobil” mengacu kepada enzim yang secara fisik dibatasi atau terlokalisir pada suatu matriks atau bahan pendukung (support) sehingga enzim dapat digunakan secara kontinyu (Mohammad, 2015). Umumnya istilah imobilisasi enzim mengacu pada enzim yang dibatasi pergerakannya, memperlambat pergerakannya, dan membuat ia tidak mampu untuk bergerak (Elnashar, 2010). Amobilisasi adalah proses pengendalian pergerakan dan pertumbuhan secara total atau sebagian pada enzim, sel, atau organel (Bintang, 2010). Enzim yang mahal kurang disukai dibidang industri dalam keadaan enzim bebas karena sulit untuk dipisahkan dari produk (Gambar 2.1 (a)). Sehingga, akan berkurang setelah digunakan satu kali. Ada alternatif lain yaitu melakukan imobilisasi enzim pada support padatan (Gambar 2.2 (b)) sehingga enzim tersebut mudah dipisahkan dari produk melalui filtrasi sederhana (Elnashar, 2010). Imobilisasi Enzim telah terbukti sangat berguna, karena telah memungkinkan enzim untuk dapat dengan mudah digunakan beberapa kali pada reaksi yang sama dengan waktu paruh yang panjang. Imobilisasi juga mencegah kontaminasi substrat dengan enzim/protein sehingga menurunkan biaya pemurnian enzim (Spahn dan Minteer, 2008).



Gambar 2.1. Reaksi enzim bebas dan enzim yang diimobilisasi. (a) reaksi enzim bebas dengan substrat dan pembentukan produk, yang harus dipisahkan melalui dialisis; (b) reaksi enzim yang diimobilisasi dengan substrat dan pembentukan produk, yang dapat dipisahkan melalui filtrasi sederhana (Elnashar, 2010).



2.2.1 Metode Imobilisasi Enzim Metode amobilisasi yang ideal harus mudah pengerjaannya dan tidak merusak substansi yang mengalami amobilisasi. Faktor-faktor seperti suhu, perubahan pH, dan bahan penyangga selama proses amobilisasi harus ditetapkan kondisi optimumnya. Bahan penyangga yang digunakan bersifat inert dan teraktivasi (Bintang, 2010). Pada dasarnya metode imobilisasi enzim bisa dibagi menjadi dua, yaitu metode fisika dan kimia. Metode fisika dikarakterisasikan dengan ikatan yang lemah seperti ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik, gaya van der Waals, ikatan ion dari enzim dengan bahan penyangga. Pada metode kimia, pembentukan ikatan kimia melalui ikatan kovalen oleh eter, thio-eter, amida atau ikatan karbamat antara enzim dengan support yang terlibat. Ada empat teknik imobilisasi enzim yang disebut dengan adsorpsi, penjebakan (entrapment), ikatan kovalen (covalent bonding) dan ikatan silang (cross lingking). (Gambar 2.2). Namun, tidak ada satu metodepun untuk semua molekul (Mohamad, 2015).



Gambar 2.2. Tiga teknik umum imobilisasi enzim. (A) adsorpsi fisika, (B) penjebakan dan (C) ikatan kovalen/ikatan-silang (Mohamad, 2015).



2.2.1.1 Adsorpsi fisika Imobilisasi melalui adsorpsi merupakan metode yang paling sederhana dan melibatkan interaksi permukaan antara enzim dengan support secara reversibel (Elnashar, 2010). Adsorpsi dapat terjadi melalui gaya lemah yang tidak spesifik, seperti ikatan van der Waals, interaksi hidrofobik dan ikatan hidrogen, dimana ikatan ionik enzim diikat oleh garam. Metode adsorpsi ini terdiri dari mencampurkan komponen biologis dengan bahan support pada kondisi pH dan kekuatan ionik yang sesuai, lalu diinkubasi pada waktu tertentu, kemudian diikuti dengan pengumpulan material yang telah diimobilisasi. Penggunaan imobilisasi pertama kali di industri yang menggunakan metode adsorpsi



adalah asam amino asilase pada DEAE-selulosa (Mohamad, 2015). Kelebihan imobilisasi enzim menggunakan metode adsorpsi fisika adalah : (a) reversibilitas; (b) sederhana; (c) memiliki aktivitas yang tinggi karena tidak ada modifikasi kimia; (d) mudah dan cepat; (e) tidak terjadi perubahan kimia baik pada enzim maupun support. Sedangkan kekurangan imobilisasi enzim menggunakan metode adsorpsi fisika adalah: (a) enzim yang diimobilisasi melalui adsorpsi cenderung mudah lepas pada support karena ikatan antara enzim dengan support relatif lemah yang bisa di desorpsi



akibat kekuatan ionik yang tinggi, pH, dan lain-lain. (b) produk terkontaminasi; (c) ikatan yang tidak spesifik (Elnashar, 2010). 2.2.1.2 Metode Penjebakan Enzim Penjebakan enzim dapat didefinisikan sebagai metode imobilisasi enzim irreversibel dimana enzim terjebak didalam kisi matriks maupun dalam membran polimer yang memungkinkan substrat dan produk melewatinya tetapi mempertahankan enzim. metode penjebakan enzim dapat meningkatkan stabilitas mekanik dan mengurangi kerusakan enzim, enzim tidak berinteraksi dengan polimer secara kimia sehingga kerusakan enzim dapat dicegah (Mohamad, 2015). Prinsip metode penjebakan adalah inklusi sel atau enzim di dalam jaringan rigid yang berfungsi untuk mencegah sel atau enzim berdifusi keluar medium, namun substrat masih tetap masuk ke dalam butiran gel (beads). Matriks berupa polisakarida (seperti agar, alginat, karagenan, dan selulosa), protein (kolagen dan gelatin), dan sintetik (poliakrilamida). Matriks alginat, karagenan, dan poliakrilamida paling banyak digunakan pada teknik amobilisasi sel maupun enzim. alginat adalah heteropolisakarida linear dari asam D-manuronat dan L-guluronat, biasanya berasal dari alga cokelat yang secara luas digunakan sebagai bahan pengental, penstabil, gel, dan film (Bintang, 2010). Penjebakan sel atau enzim biasanya menggunakan alginat, karena alginat tidak larut air, pengerjaannya mudah, dan tidak berbahaya. Campuran sel atau enzim dengan natrium alginat diteteskan ke dalam larutan yang mengandung kation multivalen menjadi kalsium alginat. Alginat akan mengalami pemadatan oleh adanya ion kalsium, tetapi tidak menyebabkan perubahan suhu, pH, dan tekanan osmosis yang drastis. Sel atau enzim teramobilisasi di dalam presipitasi kalsium alginat dalam bentuk beads. Namun, kalsium alginat secara kimia tidak stabil sehingga perlu ditentukan kondisi amobilisasi yang dapat meningkatkan kestabilan kimia beads tanpa membatasi transfer masa (Bintang, 2010). 2.2.1.3 Metode Ikatan silang Ikatan silang merupakan metode imobilisasi enzim irreversibel yang tidak memerlukan bahan pendukung untuk mencegah enzim yang lepas pada larutan substrat. Metode ini disebut juga imobilisasi bebas support dimana enzim bertindak sebagai support untuk dirinya dan sebenarnya enzim murni diperoleh dengan mengeliminasi kelebihan dan kekurangan berikatan dengan support (Mohamad, 2015). Amobilisasi yang menggunakan teknik pengikatan silang dilakukan dengan menggunakan dua atau lebih pereaksi. Bahan yang digunakan adalah polietilen glikol (PEG) dan glutaraldehid, dimana polietilen glikol sebagai agen presipitasi dan glutaraldehid sebagai pembentuk ikatan silang (Bintang, 2010).



Gambar 2.3. Metode ikatan silang (Elnashar, 2010). 2.2.1.4 Metode ikatan kovalen Amobilisasi dengan pengikatan kovalen adalah pembuatan ikatan antara gugus fungsi enzim seperti –OH, -SH, -NH2, dan –COOH atau sel mikroba dengan bahan penyangga anorganik untuk membentuk ikatan kovalen yang stabil. Pembentukan ikatan kovalen ini akibat dilapisi oleh glutaraldehid. Glutaraldehid digunakan untuk membangun protokol antara gugus fungsi enzim dan bahan penyangga (Bintang, 2010). 2.2.2 Matriks imobilisasi enzim Karakteristik matriks merupakan hal yang sangat penting untuk menentukan keefektifan sistem imobilisasi enzim. Pemilihan matriks dapat mempengaruhi proses imobilisasi karena sifat enzim maupun bahan pendukung kedua-duanya akan ditentukan oleh sifat preparasi enzim yang telah diberi bahan pendukung. Sifat ideal support dapat dijelaskan melalui hidrofilisitasnya, sifat inert terhadap enzim, biokompatibilitas, tahan terhadap mikroba, tahan terhadap tekanan dan tidak memerlukan biaya yang tinggi (Mohamad, 2015). Support dapat diklasifikasikan menjadi dua yaitu support organik dan anorganik berdasarkan komposisi kimianya, dan bisa dibagi lagi menjadi polimer alami dan sintetis (Tabel 2.1). Support yang paling banyak digunakan adalah karboksimetilselulosa, pati, kolagen, sefarosa termodifikasi, resin penukar ion, arang aktif, silika, lempung, aluminium oksida, titanium, hidroksiapatit, dan beberapa polimer tertentu (Mohammad, 2015). Dalam menggunakan bahan pendukung untuk imobilisasi molekul-molekul aktif seperti enzim, beberapa sifat dasar harus dimiliki oleh bahan pendukung tersebut, seperti matriks berasal dari sumber komersial, matriks memiliki gugus fungsi yang mudah diturunkan, matriks tersebut mempunyai stabilitas kimia dan mekanik yang baik, memiliki kapasitas untuk molekul target, dan mudah digunakan (Elnashar, 2010).



Tabel 2.1 Klasifikasi matriks imobilisasi enzim (Elsanashar, 2010). Organik Polimer alami Selulosa Dekstran Pati Agar dan agarosa Alginat Karageenan Protein Kolagen Gelatin Albumin Feritin Polimer sintetik Polistiren Poliakrilat dan polimetakrilat Poliakrilamid Hidroksialkil metakrilat Polimer vinil Polimer maleat anhidrida Polietilenglikol Polimer aldehid



Anorganik Mineral Lempung attapulgit Bentonit Kieselgur Batu apung Pasir



Bahan modifikasi Kaca tak berpori Kaca yang dikontrol porinya Logam oksida Katalis alumina Silika Besi oksida



BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Alat dan Bahan Penulisan ini berdasarkan penelitian Silva, dkk (2013) tentang evaluasi aktivitas enzimatik inulinase dari Aspergillus niger komersial yang diimobilisasi pada poliuretan dengan tata kerja seperti yang diterangkan dibawah ini. 3.1.1 Alat yang digunakan Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah labu 500 mL, batang pengaduk, 3.1.2 Bahan yang digunakan Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah Enzim inulinase komersial dari Aspergillus niger (Fruktozim, ekso-inulinase EC 3.2.1.80 dan endo-inulinase EC 3.2.1.7) yang bersumber dari Sigma-Aldrich, poliuretan, poliol polieter, toluen, diisosianat, larutan sukrosa, dan buffer natrium asetat. 3.2 Metode Penelitian Pada penelitian ini, ada beberapa tahap penelitian yang dilakukan oleh peneliti antara lain yaitu : 1. Imobilisasi enzim inulinase komersial dari Aspergillus niger dengan menggunakan polimer poliuretan.



2. Penentuan aktivitas enzim inulinase yang telah diimobilisasi dengan menggunakan polimer poliuretan melalui metode 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS). 3. Karakterisasi struktur katalis. 3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Imobilisasi Inulinase Reaksi sintesis poliuretan menggunakan volume monomer poliol polieter dan toluen diisosianat yang berbeda (1, 3, 5, dan 50 mL) dengan perbandingan poliol polieter:toluen diisosianat 1:1 (v/v). Reaksi polimerisasi dilakukan pada labu 500 mL. Monomer-monomer tersebut dipindahkan dengan menggunakan plastic syringe. Setelah penambahan monomer-monomer, sistem dihomogenkan dengan menggunakan batang pengaduk selama 2 menit, dan biarkan reaksi berlangsung. Kemudian, tahap polimerisasi dilakukan selama 5 menit dan dibiarkan semalam agar pemadatan terbentuk. Selama polimerisasi, temperatur sistem dicatat. Tahap imobilisasi dilakukan dengan menggunakan volume enzim yang mengandung ekstrak glikolat 10%. Untuk imobiliasasi, enzim yang mengandung ekstrak glikolat ditambahkan pada monomer poliol polieter dan dihomogenkan. Selanjutnya, ditambahkan isosianat sehingga reaksi polimerisasi poliuretan dapat dimulai. Gambar 3.1 memperlihatkan ilustrasi prosedur imobilisasi enzim inulinase. Gambar 3.1 Prosedur penelitian imobilisasi enzim inulinase



Setelah tahap polimerisasi, poliuretan yang mengandung enzim dipisahkan untuk penentuan aktivitas enzim inulinase. Cataloguing dilakukan untuk menguji kehomogenitas dari distribusi enzim pada polimer. Penelitian ini juga melibatkan uji stabilitas dari enzim yang telah diimobilisasi karena adanya pertimbangan bahwa enzim ini telah berulangkali digunakan. Katalis yang diimobilisasi telah digunakan berulang kali sebanyak 29 kali dalam waktu 59 hari.



3.3.2



Aktivitas Inulinase Sebanyak 0.5 gram enzim diinkubasi dengan 4.5 mL larutan sukrosa 2% dalam



bufer natrium asetat (0,1 mol/L pH 5,5) pada suhu 50°C. Gula pereduksi kemudian ditentukan dengan menggunakan metode 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS). Satu unit aktivitas inulinase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menghidrolisis 1 µmol sukrosa per menit pada kondisi tertentu (sukrosa sebagai substrat). Hasilnya, aktivitas inulinase dinyatakan per gram padatan kering (U/mgds). 3.3.3



Karakterisasi Struktur Katalis Sampel katalis dianalisis dalam kaitannya dengan struktur melalui adsorpsi



nitrogen pada 77 K menggunakan instrumen Quantachrome Autosorb-1 seri 2200e. Sebelum analisis, sampel diperlakukan dibawah vakum pada 373 K untuk pengeringan dan kemudian dialirkan gas cair N2. Rata-rata daerah dangkal spesifik ditentukan dengan metode BET sedangkan rata-rata diameter pori diperoleh dengan menggunakan metode BJH (Barret, Joynere, Halenda).



BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Mengingat kedua reaksi polimerisasi poliuretan berlangsung dengan pembebasan panas dan kenyataan bahwa ini mungkin parameter penting mengenai aktivitas enzim, awalnya telah dievaluasi hubungan antara volume monomer isosianat dan poliol dengan panas yang dibebaskan selama reaksi polimerisasi dan rasio volume monomer konstan yaitu 1: 1. Dalam tahap 5 reaksi polimerisasi yang dilakukan dengan menggunakan volume monomer 1, 3, 5, 10 dan 50 mL. Hubungan antara volume monomer dan suhu reaksi disajikan pada Tabel 4.1. Tabel 4.1 Variasi temperatur reaksi sebagai fungsi volume monomer No. 1



Isosianat (mL) 1



Poliol (mL) 1



Temperatur (°C) 42



2



3



3



57



3



5



5



57



4



10



10



77



5



50



50



85



Seperti dapat dilihat dari tTabel ini, menunjukkan hubungan langsung antara kenaikan suhu reaksi dengan volume monomer yang bekerja untuk reaksi polimerisasi poliuretan. Peningkatan suhu diamati pada suhu 42-, 57, 77, dan 85°C ketika volume monomer meningkat dari 1 sampai 50 mL. Mengingat bahwa enzim yang akan diimobilisasi dalam studi ini memiliki stabilitas termal sampai kira-kira 70 ◦C (data tidak ditampilkan), volume monomer dari 5 mL (run 3, suhu reaksi 57 ◦C) dipilih untuk imobilisasi eksperimen, yang dalam batasan stabilitas termal enzim, lebih tepatnya, dekat dengan suhu optimum untuk enzim ini (50 ◦C).



Dalam konteks ini, tahapan imobilisasi dilakukan dengan 1 mL ekstrak glikolat yang mengandung enzim 10% dari volume total, sebelumnya diencerkan dalam 5 ml monomer poliol. Setelah penentuan kondisi eksperimental terbaik untuk imobilisasi inulinase, analisis enzim yang diimobilisasi pada



poliuretan yang dilakukan,



menggunakan sukrosa dan inulin sebagai substrat. Aktivitas awal enzim diperoleh 300 dan 225 U / g, masing-masing, untuk sukrosa dan inulin. Data yang diperoleh pada langkah ini disajikan dalam Gambar 4.1.



Gambar 4.1 Aktivitas residual untuk pemanfaatan kembali inulinase yang diimobilisasi dengan poliuretan menggunakan sukrosa (a) dan inulin (b) sebagai substrat.



Pemeriksaan angka ini memungkinkan kita untuk memverifikasi bahwa sampai hari ke-20 aktivitas residu stabil untuk kedua substrat. Pada hari ke-40 itu terlihat bahwa aktivitas ini adalah 50% dari nilai aktivitas awal. Melalui plot Michaelis-Menten mungkinkan untuk menentukan waktu paruh enzim di kedua substrat sukrosa 28 hari (693 jam) dan inulin 48 hari (1155 jam). Nilai km untuk sukrosa dan inulin adalah 34,2 M dan 211,6 M dan nilai Vmax masing-masing yaitu 17,1 mol L min-1 dan 8,4 mol L min-1, masing-masing. Astolfi et dkk (2011) mengevaluasi parameter kinetik ekstrak kasar enzim bebas inulinase dari Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 dan memperoleh nilai Km untuk sukrosa dan inulinase dari 2,94 mM dan 8,71 mM, masing-masing, dan nilai Vmax yaitu 0,053 mol L min-1 dan 0,017 mol L min-1.



Ettalibi dan Baratti (2001) telah mengimobilisasi enzim inulinase dari Aspergillus ficuum dan memperoleh nilai Km sebesar 0,060 M dan Vmax 192U g-1 dengan menggunakan sukrosa sebagai substrat. Nguyen et al. (2011) mengevaluasi parameter kinetik Km dan Vmax dari enzim inulinase bebas yang diimobilisasi menggunakan kitin sebagai bahan penyangga (support), diperoleh nilai 2,04% (b / v) dan 80,88 U / mg, dan 2,19% (b / v) dan 291,58 U / g, masing-masing, menggunakan sukrosa sebagai substrat.



Stabilitas enzim yang telah diimobilisasi adalah parameter yang sangat penting dan menentukan kemungkinan enzim dapat diaplikasikan dalam skala besar untuk mengurangi biaya operasi untuk tujuan praktis. Gülay dan Sanli-Mohamed (2012) mempelajari imobilisasi rekombinan thermoalkalophilic esterase dari Geobacillus sp. dengan Caalginat, dan setelah tiga siklus berikutnya lebih dari 80% dari aktivitas enzim dengan silikat berlapis alginat dapat dipertahankan stabilitasnya. Danisman dkk. (2004) melakukan imobilisasi enzim invertase dengan metode ikatan kovalen pada membran pHEMA-GMA, dan dapat diamati aktivitasnya dapat dipertahankan 78% dari aktivitas awal setelah 35 hari penyimpanan dan Akgol dkk. (2001) aktivitas dapat dipertahankan sebanyak 62% setelah 28 hari untuk invertase yang diimobilisasi pada PVAL mikrosfer pada 4 ◦C, sedangkan enzim bebas menurut kedua penelitan ini enzim tersebut kehilangan semua aktivitasnya. Cadena dkk. (2010) melakukan imobilisasi enzim invertase dengan menggunakan PU dan diperoleh bahwa enzim dapat digunakan lebih dari 2 bulan tanpa hilangnya aktivitas yang besar (68,5% aktivitas dapat dipertahankan) dan dipertahankan 12,6% setelah lima kali penggunaan. Dalam sebuah penelitian yang dilakukan oleh Quezada dkk. (2009) menggunakan PU + iso-propanol sebagai co-substrat untuk imobilisasi Monascus kaoliang CBS 302,78, penulis membuktikan bahwa setelah 17 kali penggunaan enzim, enzim dapat dipertahankan 60% aktivitas katalitiknya. Memperhatikan bahwa sifat kimia PU cukup kompleks, tergantung pada perbedaan konstituen diisosianat dan dyol atau poliol, poliuretan yang dihasilkan mungkin sangat berbeda, masing-masing dengan kelebihan dan kekurangannya. Isosianat dapat bereaksi dengan berbagai gugus kimia, dan sifat yang dihasilkan dari polimer akan bervariasi sesuai



dengan rute reaksi. PU mungkin memiliki struktur yang sangat beragam tergantung pada jenis isosianat dan jenis komponen hidrogen reaktif yang ada dalam perumusan. Adanya berbagai gugus di sepanjang urethane yang saling terkait akan mengontrol sifat polimer yang dihasilkan. Memperluas ikatan silang dapat bervariasi dan akan tercermin dalam sifat akhir dari PU, mulai dari rantai linear elastomer yang fleksibel, kaku, dan berat polimer(Bruins, 1969). Karena sifat kimia dari sampel PU yang digunakan dalam penelitian ini tidak diketahui, begitu juga sifat kimia dari PU yang digunakan dalam referensi ini, sehingga tidak mungkin bagi kita untuk membuat perbandingan hasil yang lebih lengkap. Sesuai dengan penelitian Guncheva dkk. (2011) lipase dari Candida rugosa telah diamobilisasi pada PU dan diterapkan dalam esterifikasi asam palmitat dengan setil alkohol. Penulis mengamati bahwa aktivitas biokatalis dapat dipertahankan 80% dari aktivitas aslinya setelah lima belas kali penggunaan. Sel Bacillus sp. diamobilisasi dalam alginat dan PU menunjukkan tingginya degradasi phthalate dibandingkan dengan sel bebas dan dapat digunakan secara berulang lebih dari 12 dan 24 kali, masing-masing (Patil et al., 2006). Seperti data yang ditunjukkan pada Gambar 4.2 kandungan protein disajikan pengurangan sebagai kegiatan residual menurun, yang berarti bahwa setelah siklus 20 reuse kekuatan katalitik enzim berkurang. Menurut Fang et al. (1995), yang biogranules mikro adalah sangat tergantung pada kinetika degradasi substrat. Para penulis ini mengamati bahwa biogranules mengembangkan struktur berlapis ketika langkah degradasi awal adalah jauh lebih cepat daripada berikutnya tangga. Biogranules mengobati pati sebagai satu-satunya substrat disajikan didefinisikan dengan baik mikro tiga lapis (Fang dan Kwong, 1994). Pada penelitian Song et al. (2010), Kluyveromyces lactis β-Galaktosidase yang dibuat perlakuan dengan laktosa untuk mencegah berkurangnya aktivitas selama proses imobilisasi, dan glutaraldehid digunakan sebagai pereaksi untuk mengimobilisasi βgalaktosidase pada permukaan gel silika, menunjukkan penggunaan berulang lebih baik daripada amobilisasi non-pretreatment b-galaktosidase, dengan 63,9% dari aktivitas aslinya masih dipertahankan setelah 10 kali pemakaian. Secara umum, hasil imobilisasi secara kovalen dapat menurunkan aktivitas enzim yang dihasilkan dari transformasi gugus fungsi (misalnya, gugus amino yang bereaksi



dengan gugus



fungsi



aldehida yang



ada



reagen ikatan



silang



dengan gugus



isosianat) atau



dari



perubahan



struktural oleh



lampiran



multipoint.



Dalam sebuah



garis



yang



besar



didalam atau



diusulkan



oleh



et al. (2000),



isosianat yang



bisa bereaksi



dengan



komponen



enzim



mengandung



gugus amino



maupun



hidroksil



selama



polimerisasi,



yang pertama



menjadi jauh



lebih



menuju



reaktif



isosianat.



Bakker



yang



Gambar 4.2 kandungan protein dan aktivitas spesifik inulinase yang diimobilisasi pada poliuretan dengan substrat (a) inulin (b)sukrosa Proses ini berjalan terus-menerus sampai semua gugus isosianat habis bereraksi. Akibatnya, CO2 yang dihasilkan mengisi matriks polimer seperti PU. Karena gugus amina dan gugus hidroksil sudah berada di permukaan enzim, katalis diikat silang oleh isosianat pada pre-polimer. Akibatnya, enzim yang diimobilisasi secara kovalen mengandung bahan biokatalitik dapat diperoleh dalam bentuk ikatan silang. Manfaat dari pengujian ini adalah bahwa proses ini lebih cepat dan aktivitas yang lebih tinggi dapat dipertahankan (Ozdemir, 2009).



Sehubungan dengan karakterisasi struktural pada bahan pendukung sebelum dan sesudah imobilisasi, menghasilkan volume total pori enzim sebelum imobilisasi adalah 0.002 mL/g dan setelah imobilisasi sebesar 0.007 mL/g. Sedangkan luas permukaan sebelum imobilisasi adalah sebesar 0.56 m2/g dan setelah imobilisasi 3.77 m2/g. Hasil ini menunjukkan bahwa enzim yang telah diimobilisasi dan dilakukan modifikasi struktur bahan pendukung dapat meningkatkan stabilitas enzim.



BAB V KESIMPULAN Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Silva, dkk tahun 2013 dapat diambil kesimpulan bahwa tahap penting dalam proses imobilisasi enzim memungkinkan enzim dapat digunakan kembali. Efektivitas proses imobilisasi tergantung pada bahan pendukung yang digunakan. Keuntungan dari imobilisasi ini adalah proses cepat dan diperoleh tingginya aktivitas enzim yang dapat dipertahankan. Inulinase yang telah diimobilisasi pada poliuretan mempertahankan aktivitas inulinase 49,7% untuk sukrosa dan 49,4% untuk inulin dari aktivitas awal selama 1008 jam dan setelah penggunaan 24 kali.



DAFTAR PUSTAKA Astolfi, V., Joris, J., Verlindo, R., Oliveira, J.V., Maugeri, F., Mazutti, M.A., de Oliveira, D., Treicheil, H. 2011. Operation of a fixed-bed bioreactor in batch and fed-batch modes for production of inulinase by solid-state fermentation. Biochem. Eng. J. 5859, 39-49. Bintang, M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga. El-Naggar, N.E., Metwally, E.A., El-Tanash, A.B., Sherief, A.A. 2014. Screening of Inulinolytic Potentialities of some Fungi Isolated from Egyptian Soil. Biotechnology. 13(4):152-158.



Elnashar, M., M. 2010. Review Article : Immobilized Molecules Using Biomaterials and Nanotechnology. Journal of Biomaterials and Nanotechnology. 1:61-77. Ettalibi, M., Baratti, J.G. 2001. Sucrose hydrolysis by thermostable immobilized inulinases from Aspergillus ficuum. Enzyme Microb. Technol. 28, 596-601. Gulay, S., Sanli-Mohamed, G. 2012. Immobilization of thermoalkalophilic recombinant esterase enzyme by entrapment in silicate coated Ca-alginate



beads and its



hydrolytic properties. Int.J.Biol.Macromol. 50, 545-551. Laowklom, N., Chantanaphan, R., Pinphanichakarn, P. 2012. Production, Purification and Characterization of Inulinase from a Newly Isolated Streptomyces sp. CP01. Natural Resources. (3): 137-144. Missau, J., Scheid, A.J., Foletto, E.L., Jahn, S.L., Mazutti, M.A., Kuhn, R.C. 2014. Immobilization of commercial inulinase on alginate-chitosan beads. Sustainable Chemical Process. 2:13. Mohammad, N.R. Marzuki N.H.C., Buang, N.A., Huyop, F., Wahab, R.A. 2015. An overview of technologies for immobilization of enzymes and surface analysis techniques for immobilized enzymes. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 29(2):205-220. Narayanan, M., Srinivasan, B., Gayathiri,A., Ayyadurai, A., Mani, A. 2013. Studies on the Optimization and Characterization for the Biosynthesis of Inulinase under Solid state Fermentation. International Journal od ChemTech Research. 5(1):376-384. Nguyen, Q.D., Rezessy-Szabo, J.M., Gzukorb, B., Hoschke, A. 2011. Continuous Production of oligofructose syrup from Jerusalem artichoke juice by immobilized endo-inulinase. Process Biochem. 46, 298-303. Silva, M.F., Rigo, D., Mossi, V., Dallago, R.M. Henrick, P., Kuhn, G.O., Rosa, C.D., Oliveira, D., Oliveira, J.V., Treichel, H. 2013. Evaluation of enzymatic activity of commercial inulinase from Aspergillus niger immobilized in polyutethane foam. Food and Bioproducts Processing. 54-59. Spahn, C., Minteer, S.D. 2008. Enzyme Immobilization in Biotechnology. Recent Patents on Engineering. (2):195-200.



Skowronek, M., Fiedurek, J., Trytek, M. 2011. Inulinase Production by Aspergillus niger Micellium Immobilized on Polyurethane Foam in a Bioreactor with Alternative Oxygenation. International Journal of Biotechnology Applications. 3(2): 80-88. Susilowati, A. 2013. Alternatif Enzim Inulinase dari Kapang Endofit Hasil Isolasi Kulit Umbi Dahlia Merah (Dahlia spp) Lokal dan Aplikasinya sebagai Sumber Enzim Inulinase untuk Perolehan Serat Inulin.