Nur Afni Helia Dewi - 191810401002 - Acara 4 [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER ISOLASI DNA GENOM BAKTERI



Nama : Nur Afni Helia Dewi NIM : 191810401002



Laboratorium Bioteknologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember 2020



I.



Judul : Isolasi DNA Genom Bakteri.



II. Tujuan Praktikum : Mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA genom dan DNA plasmid pada bakteri.



III. Alat dan Bahan 3.1 Alat : 1. Shaker 2. Mikropipet 3. Eppendorf 4. Sentrifuge 5. Frezeer 6. Hot water bath 7. Vortex 8. Elektroforesis 9. UV transiluminator 10. Erlenmeyer



3.2 Bahan : 1. Biakan bakteri E.coli pada medium Nutrient Agar 2. Media Nutrient Broth 3. Larutan PBS 4. Akuades steril



IV. Skema Kerja Ditumbuhkan koloni tunggal E. coli



pada media NB



Diinkubasi pada Shaker 16 jam, suhu 30ºC



Diambil 1000 µl kultur cair, dimasukkan dalam eppendorf, disentrifus 5 menit, 4ºC, 13.000 rpm



Diambil pellet , dilakukan 3x pengulangan



Dicuci dengan larutan PBS 3x1.000 µl, disentrifus 5 menit, 4ºC, 10.000 rpm



Disimpan dalam Freezer suhu -20ºC, 24 jam



Dididihkan pellet beku



Dilarutkan



4 menit pada Hot water bath



50 µl akuades steril , diresuspensi dengan mikropipet, divortex



Disentrifus 5 menit, 4ºC, 10.000 rpm



Dipindahkan supernatan kedalam mikrotub baru



Dilihat melalui elektroforesis,



Divisualisasikan diatas UV transilluminator



Hasil



V. Pembahasan Praktikum kali ini dengan acara isolasi DNA genom pada bakteri preparasi akan membahas mengenai proses isolasi DNA bakteri serta fungsi dari setiap perlakuan. Bahan yang digunakan pada acara ini adalah biakan bakteri E. coli pada medium NA. medium NB dan larutan PBS. Alat yang gunakan yaitu Freezer, Hot water bath, mikropipet dan sentrifugasi. DNA dapat ditemukan pada organel nucleus, mitokondria dan kloroplas. Ketiga organel tersebut memiliki bentuk DNA yang berbeda-beda. Nukleus memiliki DNA berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat terhadap protein histon. DNA mitokondria dan kloroplas memiliki bentuk sirkular karena tidak berasosiasi terhadap protein histon. Dilihat dari organismenya DNA pada prokariot memiliki bentuk sirkular karena tidak ada protein histon sedangkan pada eukariot memiliki bentuk DNA linear karena terdapat histon (Sambrook and Maniatis, 1989). Isolasi DNA genom adalah tahap awal yang menentukan dalam studi molekuler dan genetika suatu spesies. Tahap tersebut dibutuhkan dengan preparasi sampel terlebih dahulu untuk memperoleh DNA dengan kualitas yang baik. Preparasi sampel akan digunakan dalam analisis molekuler atau manipulasi genetik. Isolasi atau pengambilan DNA terdapat beberapa tahapan yaitu penghancuran sel, penghilangan RNA serta protein, dan pemurnian serta pengendapan DNA (Sambrook and Maniatis, 1989). Penumbuhan koloni tunggal pada media NB untuk isolasi genom bakteri dilakukan dengan mengambil biakan bakteri E. coli pada medium NA. Langkah selanjutnya diinkubasi menggunakan Shaker selama 16 jam pada suhu ruang yang bertujuan agar kultur bakteri yang didapat banyak. Menurut Pujawati dan Nawfa (2016), penggunaan shaker incubator betujuan agar dapat memelihara atau menjaga bakteri pada jam tertentu serta menjaga kadar oksigen tetap ada didalam atau lingkungan media. Kultur cair yang sudah tumbuh diambil sebanyak 1000 µl menggunakan mikropipet. Menurut Nugroho dan Dwi (2018), Mikropipet memiliki fungsi dalam mengambil sampel atau cairan dengan volume kecil yaitu µl (microliter) dan digunakan dalam melakukan resuspensi. Pengambilan kultur



cair dengan mikropipet yang telah dilakukan kemudian akan disentrifus mengunakan sentrifugasi. Menurut Istianah et al (2018), Sentrifugasi digunakan untuk proses pemisahan dimana diberikan gaya sentrifugal dengan pergerakan cepat pada partikel padat (solid), sehingga partikel solid tersebut akan terpisah dengan cairan (liquid) secara perlahan pada sampel. Menurut Cappuccino dan Sherman (2002), Sentrifugasi bekerja berdasarkan massa jenisnya melalui proses pengendapan sehingga akan didapatkan 2 fasa yaitu fasa endapan (pellet) dan fasa ringan (supernatan). Perlakuan untuk pengambilan pellet dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan untuk memaksimalkan hasil pellet yang didapatkan. Langkah selanjutnya dengan menambahkan larutan PBS pada pellet sebanyak 3x1000 µl kemudian disentrifus kembali. Penambahan larutan PBS berperan dalam mempertahankan pH pada pellet serta membersihkan dari sisa medium sebelumnya. Menurut Amelia dkk (2013), Larutan Phosphate Buffered Saline (PBS) memiliki fungsi sebagai mengatur pH serta menjaga keseimbangan osmolaritas sel dengan cara menyediakan air dan ion organik penting. Penambahan larutan PBS setelah dilakukan kemudian dilakukan penyimpanan pada freezer dengan suhu -20ºC selama 24 jam dalam mengekstrasi DNA genom, hal ini dilakukan agar aktivitas sel tidak aktif. Langkah berikutnya dilakukan pemanasan pellet selamat 4 menit pada hot water bath dan kemudian dilarutkan dengan 50 µl akuades steril. Menurut Morrow et al (2017), Metode Freeze merupakan suatu operasi penurunan suhu atau temperature hingga berada dibawah titik beku dan metode Thawing merupakan proses dalam mengubah wujud bahan dari beku menjadi cair, sehingga metode Freeze dan Thawing merupakan salah satu metode pemecahan sel secara fisik dengan membuat sel menjadi heat shock sehingga sel akan mengalami pelisisan. Integritas genom dari proses Freeze dan Thawing menjadi perhatian karena dibutuhkan genom yang utuh dalam keberhasilan perkembangan embrio. Pelarutan dengan akuades yang telah dilakukan kemudian diresuspensi dengan mikropipet dan divortex. Menurut Hadieoetomo (1990), Vortex digunakan dalam proses homogenisasi atau menyeragamkan cairan dengan menggerakkan driveshaft dalam gerakan vertikal sehingga cairan teraduk sempurna. Suspensi



akan disentrifus kembali sehingga supernatant yang akan digunakan, supernatant diperlukan pemindahan kedalam mikrotube. Supernatant yang digunakan mengandung materi genetik dari bakteri. Keberadaan DNA genom dapat dilihat dengan alat elektroforesis dan akan divisualisasikan diatas UV transilluminator. Menurut Murtiyaningsih (2017), Pengukuran Kuantitas DNA pada hasil isolasi DNA dapat dilihat melalui spektrofotometer maupun elektroforesis yaitu dengan menambahkan 1 µl loading dye pada DNA genom (supernatant) kemudian dimasukkan kedalam sumuran gel agarose 1%. DNA lambda digunakan sebagai marker. Elektroforesis dilakukan dalam 40 menit dengan 85 volt dengan buffer TAE 1X sebagai running buffer. Langkah selanjutnya gel direndam dalam larutan Ethidium



Bromida.



Gel



sudah



dapat



divisualisasikan



pada



alat



UV



transilluminator dengan meletakkan gel diatas UV untuk melihat ada tidaknya pita DNA genom. Pengukuran kuantitas DNA digunakan untuk mengetahui banyak atau sedikit DNA yang terkandung dalam larutan. Penyerapan sinar UV oleh DNA dapat dicapai pada panjang gelombang 260 nm dan penyerapan protein pada panjang gelombang 280 nm. Gel agarose 1% digunakan untuk mengetahui ada tidaknya DNA, keutuhan DNA pada hasil isolasi serta tingkat kemurnian DNA dari kontaminan RNA. Penambahan loading dye digunakan sebagai pemberat serta pewarna karena mengandung gliserol dan bromphenol blue. Penambahan Ethidium Bromida akan menyisip diantara utas basa nitrogen (ikatan hydrogen) agar membantu memendarkan DNA pada saat dilihat dibawah sinar UV. Pendaran DNA akan terlihat seperti pita yang banyak yang berpindah dari kutub negative ke kutub positif (Brown, 2002).



VI. Kesimpulan Praktikum kali ini dengan acara isolasi DNA genom pada bakteri dapat ditarik kesimpulan bahwa dalam mengisolasi DNA genom bakteri menggunakan metode Freeze dan Thawing adalah salah satu metode pemecahan sel secara fisik dengan membuat sel menjadi heat shock. Prinsip heat shock yaitu sel akan



mengalami pelisisan secara tiba-tiba disebabkan perpindahan suhu yang sangat drastis dari suhu dibawah titik beku ke pemanasan. Acara isolasi DNA genom bakteri dilakukan penambahan larutan PBS dalam menjaga pH sel dan metode visualisasi



yang



transilluminator.



digunakan



menggunakan



alat



elektroforesis



dan



UV



DAFTAR PUSTAKA Amelia, Arie dkk. 2013. Motilitas dan Viabilitas Spermatozoa Itik Lokal (Anas platyrhynchos)



Setelah Penyimpanan Refrigerator



dalam Ekstender



Dikombinasi Berbagai Konsentrasi Krioprotektan Gliserol. Jurnal Biologi, (30) 1: 1-7. Brown, T.A. 2002. Genomes 2nd Ed. New York: BIOS Scientific Publishers Ltd. Cappuccino, J. G. dan N. Sherman. 2002. Microbiology: A Laboratory Manual. San Fransisco: Pearson adecation inc. Hadieoetomo, R. S. 1990. Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi. Jakarta: Gramedia. Istianah, N. A. et al. 2018. Teknologi Bioproses. Malang: UB Press. Morrow, S. et al. 2017. Effect Of Freezing And Activation On Membrane Quality And DNA Daage In Xenopus tropicalis And Xenopus laevis Spermatozoa. Journal Reproduction, Fertility and Development, (29) 8: 1556-1566. Murtiyaningsih, Hidayah. 2017. Isolasi DNA Genom Dan Identifikasi Kekerabatan Genetik Nanas Menggunakan RAPD (Random Amplified Polimorfic DNA). Jurnal Agritrop, (15) 1: 83-93. Nugroho, E. D. dan Dwi, A. A. 2018. Penuntun Bioteknologi. Yogyakarta: Deepublish. Pujawati, A. S. P. dan Nawfa, R. 2016. Studi Produksi Plastik PHA dengan Pengaruh Penggunaan Media Minimal Cair dan Glukosa oleh Ralstonia pickettii. Jurnal Sains dan Seni ITS, (5) 1: 6-9. Sambrook, J. E. F. and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Second Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.