Pemeriksaan Penanda Limfosit Metode Immunophenotyping [PDF]

Citation preview

Kepada Yth : Rencana Baca : Waktu/Tempat :



Tutorial Imunologi



PEMERIKSAAN PENANDA LIMFOSIT DENGAN METODE IMMUNOPHENOTYPING Eko Putri Rahajeng, Asvin Nurulita, Uleng Bahrun Program Studi Ilmua Patologi Klinik FK UNHAS / RSUP dr. Wahidin Sudirohusodo Makassar



I.



PENDAHULUAN Semua sel yang berfungsi dalam respon imun diketahui berasal dari sel



induk pluripoten yang kemudian berdiferensiasi melalui dua jalur, yaitu jalur limfoid yang akan berperan dalam pembentukan limfosit dan jalur mieloid yang akan berperan dalam pembentukan sel-sel fagosit. Sel-sel imunologi yang utama adalah limfosit T dan limfosit B, keduanya dapat dibedakan dari fungsi yang berbeda dan kemampuan dalam mengekspresikan antigen permukaan yang khas untuk masing-masing jenis sel sehingga ada keterkaitan antara antigen permukaan dengan stadium diferensiasi (clusters of differentiation antigen/ cluster designation = CD).1 Cluster of differentiation (CD) adalah molekul permukaan sel yang bertindak sebagai reseptor atau ligan dan dapat diidentifikasi dengan antibodi monoklonal spesifik untuk epitop tunggal antigen (molekul) yang terekspresi pada permukaan sel. Penemuan antibodi monoklonal pada tahun 1980-an membuat masing-masing subset limfosit dapat dibedakan satu dari yang lain karena mengekspresikan petanda permukaan (Cluster of differentiation) yang berbeda, sehingga jumlah setiap sub populasi limfosit dapat diketahui dengan menentukan proporsi petanda permukaan yang diekspresikan oleh masing-masing sub populasi.1,2 Cluster of differentiation 45 (CD45) adalah protein tyrosine phosphatase yang terdapat pada permukaan semua jenis leukosit (sel limfoid maupun mieloid), Sehingga disebut leucocyte common antigen, tetapi ekspresinya pada setiap sel berbeda-beda, dengan ekspresi terbesar pada limfosit. CD45 diketahui merupakan molekul yang mengendalikan rangkaian sinyal intraselular dan memegang peranan penting pada reseptor sel T. Sel B mengekspresikan CD45 dengan berat



Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping



1



molekul yang paling besar, sedangan timosit mengekspresikan CD45 dengan berat molekul terendah. Ekspresi isoform CD45 juga tergantung pada aktifitas dan stadium diferensiasi. Limfosit T naive mengekspresikan Isoform CD45RA, sedangkan limfosit sel T memori mengekspresikan CD45RO. CD45 berperan dalam proses aktivasi limfosit melalui stimulasi aktivitas kinase p56lck.1,3 Cluster of differentiation dapat digunakan untuk mengidentifikasi populasi sel melalui proses yang dikenal sebagai immunophenotyping, yaitu teknik mengidentifikasi antigen sel melalui interaksi antara antibodi monoklonal (telah dilekatkan fluorokrom) yang spesifik terhadap antigen di membran atau sitoplasma (intra selular) dari sel tertentu. Teknik yang digunakan untuk imunophenotyping biasanya berupa flow cytometry. Flow cytometry merupakan teknologi yang secara bersamaan mengukur dan kemudian menganalisis karakteristik fisik suatu partikel (biasanya sel) saat mengalir dalam cairan melalui seberkas cahaya, karakteristik partikel yang dianalisis berdasarkan ukuran sel, struktur intrasel atau granul dan fluoresens.2,4,5 Perkembangan teknologi mutakhir telah memungkinkan identifikasi sel dengan menggunakan alat otomatis yang disebut flowcytometer dan cell sorting. Prinsip flow cytometry dan cell sorting (flourescence activated cell sorter, FASC) adalah, mengabungkan kemampuan alat untuk mengidentifikasi karakteristik setiap permukaan sel dengan kemampuan memisahkan sel-sel yang berada dalam suatu suspensi menurut karakteristik masing-masing secara otomatis. Selain itu FASC juga dapat mengukur densitas antigen yang diekspresikan. 1,4 Pada pemeriksaan CD45 menggunakan flow cytometry dapat melihat ekspresi antigen pada permukaan seluruh sel leukosit dengan tingkat intensitas fluoresensi yang berbeda, tetapi CD45 tidak terekspresi pada eritroid atau sel nonhematologi. Limfosit dapat dengan mudah diidentifikasi dengan intensitas pewarnaan CD45 yang lebih tinggi dari pada monosit dan granulosit. Perbedaan dalam intensitas fluoresensi antara sel dan side scatter properties sehingga CD45 dapat menjadi gating parameter untuk mengidentifikasi leukosit dari linage yang berbeda dan derajat maturasi sel (Gambar 1). 5



Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping



2



Gambar 1: Plot CD45 berdasarkan lineage dan maturasi sel leukosit (Sumber : Leach M, Drummond M, Doig A. Practical Flow Cytometry in Haematology Diagnosis.2013)5



Pada tutorial ini akan diuraikan tentang pemeriksaan sel CD45 menggunakan metode FACS dengan alat Becton Dickinson FACScanto II. Reagen BD FASC BD Multitest CD3/CD8/CD45/CD4 digunakan untuk invitro diagnostik



dalam



mengidentifikasi



sel



yang



mengekspresikan



antigen



CD3/CD8/CD45/CD4.



II. TUJUAN Tujuan dari tes ini yaitu untuk mengidentifikasi sel yang mengekspresikan antigen CD3/CD8/CD45/CD4 dengan metode imunofenotyping menggunakan alat Becton Dickinson FACScanto II.



III. METODE A. PRA ANALITIK6 1). Persiapan



pasien



:



Pasien



tidak



sedang



menggunakan



obat



imunosupresan. 2). Persiapan sampel : 1. Sampel yang digunakan adalah darah perifer dengan antikoagulan ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA).



Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping



3



2. Darah yang mengandung antikoagulan disimpan pada suhu kamar (20°C – 25°C) dilakukan staining dalam 48 jam setelah pengambilan dan kemudian dianalisis dalam 24 jam setelah pewarnaan. 3) Alat dan bahan : 1. Alat : a. BD Facscanto II b. Tabung BD Trucount c. Tabung vakutainer EDTA d. Mikropipet & tip e. Vortex



a



b Gambar 2. Alat yang dibutuhkan (Sumber : Dokumen Pribadi)



2. Bahan : a. Reagen yang trersedia dalam kit6 Komposisi reagen dalam kit : BD Multitest CD3/CD8/CD45/CD4 disediakan dalam 1 mL buffer salin dengan 0.1% sodium azide. BD Multitest mengandung Antibodi CD3 berlabel FITC, clone SK7; antibodi CD8 berlabel PE, clone SK1; abtibodi CD45 berlabel PerCP, clone 2D1 (HLe-1); and antibodi CD4 berlabel APC, clone SK3. Antibodi CD3, CD8, CD45, and CD4 terdiri dari mouse IgG1 heavy chains and kappa light chains.



Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping



4



Nilai konsentrasi antibodi dalam tabel di bawah ini: Reagen



Konsentrasi



CD3 FITC



2.3



CD8 PE



1.75



CD45 PerCP



7.50



CD4 APC



0.92



b. Reagen yang tidak tersedia dalam kit : 1.



Reagen lysing solution (100 mL buffer yang mengandung formaldehida