Rekgen - KOSMID Kak Farid [PDF]

Citation preview

Jelaskan tentang cosmid vektor dalam rekayasa genetika ?



Rekayasa genetika adalah suatu teknik bioteknologi yang digunakan untuk mentransfer gen dari suatu organisme ke organisme lain untuk mendapatkan produk baru dengan cara membuat DNA Rekombinan. DNA Rekombinan adalah DNA yang urutannya telah direkombinasikan agar memiliki sifat- sifat atau fungsi yang kita inginkan sehingga organisme penerimanya mengekspresikan sifat atau melakukan fungsi yang kita inginkan. Misalnya, kita membuat DNA rekombinan yang memiliki fungsi membuat insulin. DNA ini kemudian kita masukan ke dalam bakteri dengan harapan bakteri tersebut dapat menghasilkan insulin. DNA rekombinan dilakukan melalui penyisipan gen dengan menggunakan vector/ “kendaraan pemindah”. Adapun teknik pembuatan DNA rekombinan adalah sebagai berikut: a. Teknik mengisolasi DNA; b. Teknik memotong DNA dengan menggunakan enzim retriksi endonuklease; c. Teknik menggabung/ menyambung DNA dengan menggunakan enzim ligase; d. Teknik memasukkan DNA kedalam sel hidup (vektor) e. Vektor berkembang dengan sisipan DNA yang direkayasa Dua komponen utama yang terlibat di dalam rekayasa genetika, yaitu vector dan enzim.



VEKTOR Vektor adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi DNA asing tersebut. Vektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot, khususnya E.coli, adalah plasmid, bakteriofag, cosmid dan fosmid. Sementara itu vektor YACs dan YEps dapat digunakan pada khamir. Plasmid Ti, baculovirus, SV40 dan retrovirus merupakan vektor-vektor yang dapat digunakan pada sel eukariot tingkat tinggi. Transfer vektor merupakan cara memasukan suatu gen ke sel baru dengan menggunakan pembawa (carrier) khusus yang memanfaatkan proses alami seperti pada transfer DNA oleh bakteri dan virus. Vektoryang digunakan adalah plasmid, bakteriofage dan cosmid (russel, 1992). Secara kimiawi vektor-vektor tersebut adalah molekul DNA. Sebagai vektor suatu molekul DNA harus memiliki sifat-sifat yang harus dimiliki DNA seperti di bawah ini : 



Molekul DNA mampu melekukan replikasi sendiri maupun replikasi segmen DNA yang diinsersikan bebas dari replikasi kromosom sel inang dengan cara membuahi suatu “ori”







Molekul DNA harus mengandung sejumlah tapak pemutusan enzim retrisi khusus yang bermanfaat untuk insersi segmen-segmen DNA.







Molekul



DNA



harus



membuhai



suatu



penenda



yang



dapat



dimanfaatkan. 



Molekul DNA harus mudah terbebas kembali ari sel inang.



Selain sifat-sifat itu ada pula sifat lain yang diharapkan : 



Berat molekul rendah







Adanya kemampuan untukmemberikan sifat fenotip yang dipilih dengan segera pada sel inang.



TRANSFER DNA Transfer molekul DNA rekombinan ke dalam sel merupakan tahap yang penting pada teknologi DNA rekombinan. Beberapa spesies bakteri yang sering digunakan dalam industri bioteknologi antara lain adalah Bacillus subtilis, Eschericia coli, Saccharomyces cerevisiae. (Radji, M., 2011) Proses transfer DNA rekombinan kedalam sel hospes tergantung pada jenis vektor yang digunakan. Beberapa cara transfer DNA adalah: 1. Transformasi Teknik ini digunakan apabila vektor yang dipakai adalah plasmid DNA. Dapat ditransformasikan kedalam sel inag dengan cara: a. Induksi kimia menggunakan perlakuan kejut panas kejut panas (heat shock) dengan CaCl2 pada suhu 42oC dalam waktu 90 detik. Adanya ion Ca2+ dapat menyebabkan perubahan permeabilitas dinding sel bakteri sehingga plasmid DNA rekombinan yang berada dalam biakan sel bakteri akan masuk kedalam sel bakteri yang dinding selnya lebih permeabel. b. Elektroporasi Permeabilitas



dinding



sel



bakteri



dapat



ditingkatkan



dengan



cara



menempatkan sel bakteri kedalam medan listrik yang kuat. DNA dan sel bakteri dimasukkan bersama-sama dalam kuvet khusus yang kemudian ditempatkan dibawah medan listrik (1,8 kv), dalam waktu yang sangat singkat sekitar 4-5 detik. Dibawah medan listrik ini dinding sel bakteri dipaksa terbuka dengan sendirinya, sehingga DNA dapat masuk kedalam sel bakteri kedalam lubang yang terbentuk tersebut. Teknik ini dapat menyebabkan sebagian besar sel bakteri mati, namun sel yang bertahan hidup akan menerima DNA. Dewasa ini elektroporasi sering digunakan untuk transfer DNA karena prosesnya lebih cepat. c. Konjugasi Proses ini umumnya terjadi secara alamiah diantras sel bakteri melalui pili bakteri. Pada transfer DNA melalui konjugasi diperlukan jenis plasmid khusus yang disebut dengan plasmid konjugatif. Apabila sel bakteri memiliki



plasmid tersebut (sel donor) bertemu dengan bakteri yang tidak memiliki plasmid (sel penerima), maka akan terjadi agregasi sel dari keduanya. Pada saat itu akan terjadi transfer plasmid dari sel donor ke dalam sel penerima. (Radji, M., 2011) Manipulasi terhadap plasmid konjugatif dapat dilakukan untuk membuat plasmid konjugatif membawa molekul DNA rekombinan yang dikehendaki sehingga dapat ditransfer kepada sel bakteri lain melalui kontak antar sel bakteri. Salah satu cara teknik konjugasi khusus yang berhasil



dilakukan



adalahh



teknik



konjugasi



menggunakan



bakteri



Agrobacterium tumefaciens yang mengandung plasmid konjugatif yang disebut dengan plasmid Ti (Tumor inducing). 2. Transfeksi Transfer DNA melalui proses ini apabila vektor yang digunakan adalh virus bakteriofag. DNA rekombinan yang akan ditransfer dikemas terlebih dahulu dalam kapsid bakteriofag, kemudian diinfeksikan kedalam sel penerima. Proses transfer DNA melalui transfeksi ini menyerupai proses infeksi oleh virus yang terjadi secara alamiah. Replikasi dan propagasi akan meningkatkan jumlah DNA rekombinan. 3. Mikroinjeksi Teknik ini digunakan untuk mentransfer DNA secara langsung kedalam sel menggunakan jarum suntik yang merukuran sangat kecil atau mikro. Umumnya teknik ini digunakan untuk mentransfer DNA kedalam sel hewan atau sel tanaman, karena sel tersebut berukuran relative lebih besar daripada sel bakteri. DNA rekombinan yang akan ditransfer diinjeksikan lengsung kedalam nucleus sel penerima. 4. Mikroprojektil Teknik ini umumnya digunakan untuk mentransfer DNA kedalam sel atau jaringan tanaman. Partikel DNA ditembakkan langsung dengan suatu alat penembak khusus langsung kedalam sel tanaman. Dewasa ini terdapat berbagai jenis alat penembak gen, salah satu jenisnya antara lain adalah pistol penembak gen.



COSMID Cosmid merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggunakan kos dari DNA lamdha dengan plasmid. Kemampuannya untuk membawa fragmen DNA sepanjang 32 hingga 47 kb menjadikan cosmid lebih menguntungkan daripada fag λ dan plasmid. Cosmid dapat dimasukkan ke dalam E. coli dengan cara transformasi dan diperlakukan seperti plasmid Cosmid dibangun di laboratorium memanfaatkan urut-urutan cos dan fag ƛ yang berguna untuk pemasukan/pegumpulan kromosom ke dalam kepala fag dan memanfaatkan pula urut-urutan (bagian tengah cosmid) untuk fungsi resistensi terhadap antibiotik serta replikasi. Cosmid dirakit dan plasmid dan fag ƛ, contoh plasmid yang digunakan Pbr322.



Concatamers dari molekul cosmid dihubungkan oleh masing-masing cos site, betindak sebagai substrat untuk pengepakan invitro karena cos site hanya urutan molekul DNA yang dibutuhkan untuk dikenal sebagai genom protein. Partikel fag yang mengandung DNA cosmid adalah sama seperti fag yang lainya, tetapi di dalam sel DNA cosmid tidak dapat disintesis menjadi partikel fag baru, bahkan bereplikasi sebagai plasmid. DNA rekombinan didapatkan lebih banyak dari koloni dibandingkan plak. Seperti pada vektor tipe lainya batas dari panjang DNA yang diklon ditentukan oleh jarak yang tersedia pada partikel λ fag. Sebuah cosmid dapat berukuran 8 kb atau kurang, jadi hingga ukuran 44 kb DNA baru dapat disisipkan sebelum pengepakan Phaga λ selesai. Cosmid merupakan modifikasi plasmid pembawa copy sekuen DNA (cos sequence) diperlukan untuk pengepakan DNA kedalam bakteriofage λ. DNA rekombinan pembawa kopi yang lengkap dari vektor cosmid akan bereplikasi didalam sel seperti hal nya plsamid dan pembawa sifat resistensi terhadap antibiotik yang dibawa oleh cosmid tersebut. Dengan demikian bakteri yang membawa cosmid rekombinan dapat diseleksi dengan menggunakan media yang mengandung antibiotik yang sesuai. Plasmid yang berukuran kecil (kira-kira 5.000 pasang basa) dan mengandung gen resistensi antibiotik digunakan sebagai bahan dasar pembuatan cosmid. Selanjutnya gen cos (berukuran sekitar 30 pasang basa) digabungkan ke dalam plasmid tersebut. Genom virus yang bisa masuk ke partikel virus adalah sekitar 50.000 pasang basa sedangkan cosmid berukuran 5030 pasang basa, sehingga agar cosmid dapat dimasukkan ke dalam partikel virus dibutuhkan sekitar 45.000 pasang basa yang harus ditambahkan pada cosmid. Dalam keadaan normal, cosmid berbentuk lingkaran seperti pada plasmid. Agar dapat disisipkan dengan gen klon, cosmid harus dibuat linear dengan cara pemotongan pada satu tempat tertentu. Kemudian gen klon yang berukuran 45.000 pasang basa digabungkan dengan cosmid yang linier tadi dengan bantuan enzim penggabung. Melalui reaksi kimia, rekombinan cosmid dimasukkan ke



dalam partikel virus. Selanjutnya, partikel virus yang berisi rekombinan cosmid ini akan diinfeksikan secara in-vitro pada sel bakteri Escherichia coli.



Gambar. Kloning dengan menggunakan vektor cosmid. (a) Selain AMPr, ORI, dan polylinker seperti vektor plasmid, vektor cosmid juga berisi situs COS. (b) Setelah vektor cosmid dibelah dengan enzim restriksi, mereka dikombinasikan dengan fragmen DNA. Perakitan dan langkah-langkah transformasi selanjutnya sama seperti kloning dengan bacteriophage (λ-fage).



Vektor Cosmid Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna dari situs l cos (dihilangkan pada vektor l)  Keunggulan:  Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)  Seleksi berdasar ukuran  Pengerjaan seperti plasmid  Kelemahan:  Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50 kbp)



Pada cloning dengan cosmid, fragmen DNA dengan ukuran 35-45 kb diisolasi dari gradient sukrosa dan diligasi dengan kondisi sehingga terbentuk seperti pada Gambar. Disini fragmen DNA kromosom diapit oleh molekul cosmid dan lokus cos yang diatur pada orientasi yang sama. Ketika konkatemer (rekombinan) ini sebagai substrat reaksi pembungkusan in vitro, lokus cos dipotong dan DNA yang terletak di antara cos terbungkus dalam partikel bakteriofag, DNA rekombinan linier diinjeksikan ke dalam sel, yang kemudian membentuk struktur sirkuler. Molekul sirkuler ini mengandung semua bagian cosmid, replikasi seperti plasmid dan membawa gen resistensi terhadap antibiotic tertentu. Bakteri yang membawa kosmid dapat diseleksi dengan menggunakan antibiotic. Proses pembungkusan dapat juga digunakan dengan mentransduksi kosmid rekombinan dari suatu bakteri lainnya. Biakan bakteri yang membawa kosmid rekombinan diinfeksi dengan galur bakteriofag  tertentu atau pertumbuhan bakteriofag  diindusi. Pada pertumbuhan bakteriofag berikutnya, lokus cos dari cosmid rekombinan bertindak sebagai substrat pembungkusan dan DNA cosmid masuk ke dalam partikel bakteriofag. Partikel transduksi ini dilepas dari sel dan dapat disimpan dalam jangka waktu yang sangat lama atau digunakan langsung



untuk menginfeksi galur bakteri lain. Pustaka DNA yang dibuat dengan cosmid dapat disimpan sebagai partikel bakteriofag. Kapasitas cloning cosmid merupakan fungsi dari (1) ukuran DNA yang dibungkus dalam partikel kepala bakteriofag , (2) ukuran vector itu sendiri. Partikel bakteriofag dapat menyimpan sebanyak 52 kb DNA dan kebanyakan cosmid berukuran sekitar 5 kb. Hal ini berarti rekombinan cosmid dapat membawa sampai 47 kb DNA kromosom dan dapat dipropagasi. Sedangkan ukuran terkecil bakteriofag yang dapat dibungkus adalah 38 kb, sehingga ukuran DNA kromosom yang dapat diklon pada sekitar 33 kb. Sebagai contoh, cosmid c2RB (Gambar) berukuran 6,8 kb; membawa dua lokus cos; gen resistensi terhadap ampisilin dan kanamisin; replikon ColE1; dan empat loki restrisi (BamHI, EcoRI, ClaI, HindIII) yang dapat digunakan untuk cloning. Konkatenasi vector dengan fragmen DNA kromosom pada waktu ligasi dapat ditekan dengan cara vector linier diinkubasi dengan fosfatase atau dengan modifikasi langkah cloning. Fragmen 1,7 kb yang membawa cos hilang pada waktu pembungkusan, sehingga vector ini dapat menerima fragmen DNA berukuran 33 kb sampai 46,5 kb. Fragmen 1,7 kb ini membawa gen kan cosmid rekombinan peka terhadap kanamisin, berarti telah terjadi konkatenasi vector pada waktu ligasi, maka kondisi ligasi harus diatur sedemikian sehingga jumlah koloni yang reesisten kanamisin sesedikit mungkin. Pustaka dibuat dengan c2RB ditunjukkan seperti gambar. Vektor dipotong dulu dengan SmaI, kemudian dengan enzim kedua, misalnya BamHI. Ini akan menghasilkan dua fragmen, masing-masing membawa cos dan membawa ujung kohesif dan ujung tumpul. DNA vector ini diligasi dengan fragmen DNA berukuran tertentu yang dipotong dengan Sau3A1 atau BamHI. Jika pada reaksi ligasi digunakan ATP dengan konsentrasi tinggi (5mM), hal ini akan menghambat ligasi ujung tumpul tetapi tidak berpengaruh terhadap ujung kohesif. Dna rekombinan ini dimasukkan ke dalam partikel bakteriofag  yang digunakan untuk menginfeksi E. coli recA.



DAFTAR PUSTAKA



Kurnia, A. 2011. Dasar Teknologi DNA Rekombinan. Departemen Farmasi, Universitas Indonesia, Depok, Indonesia. Mulandno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Edisi Kedua. IPB Press. Bogor. Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Kanisius. Yogyakarta.