Review Video Animasi Youtube [PDF]

Citation preview

Review Video Animasi Youtube Cara Penggunaan Alat dan Tahapan “Polymerase Chain Reaction (PCR)” Dari hasil video yang saya amati bersama dengan rekan-rekan kelompok, beberapa hal dapat saya rangkum mengenai penggunaan alat dan tahapan dari Polymerase Chain Reaction atau yang biasa kita kenal dengan sebutan PCR. PCR merupakan suatu teknik biologi molekuler yang digunakan untuk memperbanyak sekuens DNA spesifik hingga jutaan kali semula. Terdapat tiga tahapan dalam siklus PCR, yaitu: 1. Denaturasi atau penguraian untai ganda DNA 2. Annealing atau pelekakatan primer 3. Polimerisasi atau pemanjangan pasangan DNA komplementer Bahan baku dalam reaksi PCR yaitu reaction mixture. Reaction mixture merupakan suatu campuran yang mengandung zat-zat pendukung berlangsungnya reaksi. PCR dilakukan dengan bantuan mesin thermal cycler yang dapat mengubah suhu sesuai dengan waktu dan urutan yang ditentukan. Hasil dari teknik PCR ialah jumlah untai DNA yang jumlahnya terus bertambah pada tiap siklus sebanyak 2n, dengan n merupakan nomer siklus. DNA hasil amplifikasi dengan PCR tidak dapat dilihat secara kasat mata, tetapi dapat diidentifikasi dengan teknik elektroforesis. Dalam animasi yang berdurasi sekitar 7 menit, dijelaskan bahwa pertama terdapat komponen-komponen reaction mixture, yaitu DNA template, primer, DNA polimerase, buffer/penyangga, dan dNTPS. Pertama, DNA template. Fungsi DNA template di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. DNA template ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asalkan di dalam DNA template tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju. Kedua, primer. Primer yaitu suatu polimer asam nukleat pendek (oligonukleotida) yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat, dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates), buffer PCR, dan enzim DNA polymerase. Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Ketiga, DNA polimerase. Polimerase DNA merupakan enzim yang stabil dalam pemanasan. Umumnya digunakan enzim Taq DNA polimerase (Taq = Thermus aquaticus). Keempat, buffer / dapar. Fungsi buffer yaitu untuk menjaga keseimbangan pH medium. Umumnya buffer PCR mengandung senyawa MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polymerase.



Kelima, dNTPS. dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat),



dTTP



(deoksitimidin



trifosfat),



dCTP



(deoksisitidin



trifosfat)



dan



dGTP



(deoksiguanosin trifosfat). dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA template. Siklus PCR meliputi tiga tahap yaitu denaturasi, annealing, dan elongasi. Pertama, denaturasi. Jika larutan DNA dipanaskan, maka energi termal akan memecahkan ikatan hidrogen dan ikatan lain yang menentukan kestabilan heliks ganda, akibatnya kedua untai akan memisah atau mengalami denaturasi. Molekul DNA heliks tunggal dari proses denaturasi cukup stabil. Jika suhu diturunkan, molekul tersebut biasanya tidak mengalami renaturasi menjadi molekul DNA heliks ganda asal tetapi membentuk pola kusut, namun untai yang saling komplemen dapat mengalami renaturasi secara perlahan-lahan. Sifat ini menjadi dasar teknik hibridisasi asam nukleat. Kedua, annealing. Merupakan proses penempelan primer. Tahap annealing primer merupakan tahap yang penting dalam PCR karena jika terdapat sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. Faktor yang mempengaruhi tahap ini antara lain suhu annealing dan primer. Annealing umumnya berlangsung pada suhu 54 oC. Ketiga, elongasi. Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polimerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA cetakan, dan nukleotida. Jika dilakukan pengulangan terhadap ketiga tahapan tersebut, maka untai DNA yang baru dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan, dan pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA yang baru. Pengulangan proses PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru secara eksponensial.