TEHNIK HISTOKIMIA Presentation D3 [PDF]

Citation preview

TEKNIK HISTOKIMIA EKO MULYO HUSODO.SKM ANNY SETIJO RAHAJU, dr. SpPA(K)



A



Prinsip Dasar Histokimia



Histokimia : menggabungkan metode histologi dengan kimia/biokimia, untuk mengungkapkan komposisi biokimia dari sel dan jaringan di luar distribusi asam-basa  ditunjukkan oleh metode pewarnaan standar (HE), tanpa mengganggu distribusi normal dari bahan kimia.



Aplikasi



Mengidentifikasi, mengukur, dan melokalisasi zat kimia ,ekspresi gen biologi, struktur organel spesifik, Jenis sel Memperjelas sel dan struktur jaringan dan morfologi.



Tujuan 1. Penyajian Distribusi Kimia normal 2. Penyajian Komposisi Kimia normal 3. Spesifisitas Reaksi 4. Pendeteksian dari Produk Reaksi: Produk reaksi harus berwarna atau hamburan elektron, sehingga dengan mudah dapat divisualisasikan dengan mikroskop cahaya atau mikroskop elektron 5.Tdk dpt dari Produk Reaksi: Produk reaksi harus tidak larut, sehingga tetap di dekat substansi .



Special Stain (Histokimia) yang umum :  Periodic Acid Schiff ( PAS )  Diastase sebelum PAS



 Gomori’s / Retikulin  Masson Trichrom



 Wade Fite  dll



 Prinsip :



Karbohidrat + Periodic Acid  Di aldehide Di aldehide + Schiff  Chromophone (Struktur cincin Quinoid)



Tujuan  Untuk mengetahui adanya glikogen pada jaringan atau subtrat.



Catatan : 1.Glikogen merupakan polisakarida yg tersebar pada manusia dan hewan (bisa tersimpan pd blok parafin)



2. Glikogen terdiri dari molekul –molekul glukosa membentuk suatu rantai yang panjang, sifatnya labil mudah berubah menjadi glukosa ,gula ini setelah jaringan mati/rusak mudah larut dalam air. 3. Untuk pemeriksaan PAS ,spesimen harus segera dilakukan fiksasi paling lama 30 menit setelah spesimen terlepas dr induknya



Reagentia PAS : Periodic Acid ½ - 1 % Meyer’s Hematoksilin



Cara membuat reagen Schiff :  Aquades dipanaskan,dinginkan 70°C,ambil 800 cc.  Tambahkan 4 gr Basic Fuchsin,aduk hingga rata  Dinginkan sampai suhu 50°C,pertahankan suhu tsb dg



memasukkan kedlm Oven.  Masukkan 8 cc HCl 1N melalui dinding tabung  Tambahkan 8 gr Potassium Metabisulfit,aduk hingga rata.  Lar.simpan dlm botol gelap selama 1X24 jam di ruang gelap pd suhu kamar.



 Tambahkan 4 gr Charcoal/Norit dan campur hingga rata.  Tunggu 5 menit ,saring larutan (jernih ) dan simpan dalam botol



gelap dlm lemari es. Catatan : 1.Test reagen Schiff : teteskan bbp tetes kedlm petridish berisi Formaldehyde 37-40% scr cepat menjadi Merah Magenta. 2.Bila reagen Schiff bewarna kuning lemah/ merah mudah reagen jelek buang



Metode parafin



Prosedur PAS :  Deparafinisasi  Hidrasi  Air



 Periodic Acid ½-1 % selama 5 mnt.  Cuci dg air 5 mnt  Reagen Schiff selama 15 mnt.  Cuci dg air 10 mnt



 Counter stain Meyer’s Hematoksilin 15 mnt  Cuci air 10 mnt  Dehidrasi



 Clearing  Mounting Medium



Hasil  PAS POSITIF BERWARNA MERAH MAGENTA



 INTI SEL BIRU  PAS POSITIF PADA :



a.Polisakarida:glycogen,selulose b.Mucopolisacarida c.Muko dan glikoprotein d.Glyolipid e.Unsaturated lipid dan Phospho lipid



Gambaran mikroskopik PAS Positif



Suatu enzim amilase yang berfungsi untuk mencerna glikogen menjadi glukosa yg akhirnya larut saat mencucian dg air Enzim ini bekerja pada pH :6,suhu tertentu 37°C Menghindarkan terbentuknya gugus aldehyde.



Larutan Diastase 0,1% R/  Sodium Chloride 8 gr  Sodium fosfat dibasic 0,282 gr  Sodium fosfat mono basic 2,97 gr  Aquades 100 cc Cara membuatnya : Diastase malt : 0,1 gr Fosfat buffer 100 cc Larutan ini harus segera dipakai.



Prosedur Diastase sblm PAS  Deparafinisasi  Hidrasi



 Air  Larutan Diastase selama 1 jam pada suhu 37°C  Cuci dengan air 10 mnt



 Periodic Acid ½-1 % selama 5 mnt.  Cuci dg air 5 mnt  Reagen Schiff selama 15 mnt.



 Dst seperti pewarnaan PAS selesai.



Kontrol Diastase PAS, Hasil:  Kontrol Diastase PAS : Negatif artinya Jaringan



/Substrat Positif Glikogen.  Kontrol Diastase PAS : Positif artinya Jaringan /Substrat Negatif Glikogen.



Prinsip Teknik impregnasi perak/silver adalah cat yang selektif thd sabutsabut retikulin oleh reaksi reduksi amonical silver,sabut-sabut yang tdk tereduksi harus dilakukan oksidasi dan disensitisasi. Grup hydroxyl dr hexose sugars dr glycoprotein yg membentuk sabut-sabut retikulin dioksidasi dg potasium permanganat terhadap grup aldehyde, potasium permanganat di hilangkan dg potassium metabisulfit,iron alum sebagai sensitiser. Hal tsb membentuk ikatan antara logam organik dg sabut-sabut retikulin ,yg kemudian diganti dg ion silver,silver yg tdk bereaksi dihilangkan dg sodium thiosulfat.disini background memakai Gold Chloride



Reagentia untuk Retikulin :  Larutan Potasium permanganat 1%  Potasium metabisulfit 2%  Laurtan ferri ammonia/iron alum



 Larutan Silver Nitrat.  Larutan Formalin 4%  Larutan Thiosulfat



 Larutan Gold Chloride 0,2%  Neutral red fuchsin 1%



Cara membuat larutan Silver Nitrat:  Campurkan lar.10% potassium hidroksida 10 cc dengan 10%     







silver nitrat 40 cc ,maka terbentuk presipitasi (endapan ) Buang supernatannya hingga tinggal endapannya. Cuci endapan 5X dengan aquades Tambahkan ammonia 28% tetes demi tetes hingga tinggal endapan kecil minimal. Tambahkan dengan aquades hingga 100cc Saring dan simpan dalam botol yg gelap Lar. Simpan dalam lemari es.



Prosedur pewarnaan 



       



    



      



Deparafinisasi Hidrasi Air Potassium Permanganat 1%: 2 mnt Cuci dg Aquades Ferri Ammonia 2% : 2 mnt Cuci dg aquades Lar.Silver nitrat : 1 mnt Cuci Aquades Formalin 4% : 3 mnt Cuci aquades Gold Chloride 0,2% : 5 mnt Cuci Aquades Potassium Metabisulfit 2%: 1 mnt Cuci Aquades Sodium Thiosulfat 5% : 1 mnt Cuci Aquades Lar.Neutral red fuchsin 1% : 30-45 dtk Dehidrasi Clearing Mounting Medium



Hasil :  Sabut-sabut retikulin : Hitam  Inti sel : merah  Back ground : Kuning emas



Gambaran mikroskopik sabut retikulin



Gambaran mikroskopik sabut retikulin



Masson Goldner/Masson Trichrome Prinsip Masson Trchrome adalah suatu pewarnaan ganda apabila pewarnaan lain umumnya menggunakan 2 warna ,pewarnaan ini menggunakan 3 warna ,Masson menamakan 3 warna ini sebagai Trichrome



Reagentia Masson Trichrome  Eisenhematosilin Weigert.  Lar.Masson Goldner I



 Lar.Masson Goldner II  Lar.Masson Goldner III



Cara membuatnya  Lar.Masson Goldner I



Ponceau de Xyylidin 0,2 gr Acid Fuchsin 0,1 gr Asam asetat 0,6 gr Aquades 100 cc  Lar.Masson Goldner II Phosphotungstic acid 4 gr Orange G 2 gr Aquades 100 gr



 Lar.Masson Goldner III



Light green Asam asetat Aquades



0,2 gr 0,2 cc 100 cc



Prosedur pewarnaan               



Deparafinisasi Hidrasi Air Eisenhematoksilin Weigert 5 menit Cuci dengan air mengalir 5 menit Bilas dengan Aquades 2 kali Lar. Masson Goldner 1 selama 5 menit. Cuci dengan asam asetat 1% selama 1 menit Lar.Masson Goldner II selama 5 menit Cuci dengan asam asetat 1% selama 1 menit Lar.Masson Goldner III selama 5 menit Cuci dengan asam asetat 1% selama 1 menit Dehidrasi Clearing Mounting Medium



Hasil pewarnaan Masson Trichrome  Inti



: Coklat hitam  Sitoplasma,Erytrocyte : abu-abu sampai merah.  Kolagen : Hijau atau biru ( Methylen Blue )  Otot : Merah



Gambaran mikroskopik Masson Trichrome



Wade Fite Stain  Latar belakang



Bakteri tahan asam : sel bakteri (TB ) yang mengandung lipid dalam kadar yang cukup besar didalam dinding selnya. Sel bakteri tersebut tidak bisa diwarnai dengan pewarnaan biasa,maka harus dengan pewarnaan khusus : Pewarnaan tahan asam Mengapa : dinding sel bakteri yang mengandung lipid tersebut dapat larut pada larutan asam alkohol



Prinsip Bakteri tahan asam ditujukan oleh pewarna jaringan dengan carbol fuchsin dan kemudian dipindahkan dalam acid alkohol,bakteri tahan asam(M.Tubercolusis,M.Leprae) akan menyimpan cat carbol fuchsin sedangkan bakteri lain larut. Larutan carbol fuchsin adalah suatu cat phenylmethane dan dilarutkan dalam Fenol dan alkohol,fenol bekerja dengan mengikat cat dalam BTA



Reagentia wade Fite  Lar. Carbol Fuchsin  Acid Alkohol 0,2 %  Methylen Blue 1 %



Cara membuatnya  Larutan Carbol Fuchsin



Basic Fuchsin 10 gr Phenol Liquid 50 cc Alkohol Absolut 100 cc Aquades 900 cc Basic Fuchsin larutkan dalam Alkohol kemudian tambahan phenol dan aquades



Prosedur wade Fite Stain                



Deparafinisasi Hidrasi Air Lar.Carbol Fuchsin ( disaring ) incubasi 60°C selama 1 jam Dinginkan hingga pada suhu kamar Cuci dg air Bilas dengan acid alkohol 0,2 % selama 20 detik Cuci dengan air Tuangi dengan acid alkohol lagi bila pelunturan dirasa kurang , sampai warna pink Cuci air Berikan counter stain Methylen blue 1% selama 30 detik Cuci Aquades Isap dengan tissue /kertas saring Dehidrasi Clearing Mounting Medium



Hasil Wade Fite Stain  Bakteri tahan asam : merah  Background : biru pucat.



Gambaran mikroskopik Wade Fite Stain



Special Stain : 1. Van Gieson Technique HASIL : - Inti : biru - Collagen :Merah - Jaringan lain Kuning. Termasuk Otot 2. Highman’s Congo Red Technique HASIL: - Inti biru - Amyloid: oranye - Elastic fibres : merah



3. Best’s Carmine Technique HASIL: - Inti biru - Glycogen : Deep Red. - Mucin ,Fibrin : Weak Red 4. Masson Fontana technique HASIL: - Inti merah - Melanin,Argentaffin,Chromaffin dan beberapa lipofucsin : Hitam



5. Giemsa technique HASIL: - Inti biru - Protozoa : biru gelap - Mikroorganisme /Bakteri : biru gelap 6. dll