Isolasi DNA Buah [PDF]

Citation preview

ISOLASI DNA BUAH



Oleh: Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten



: Annisa Dwinda Fatimah : B1J011082 :1 : II : Marsekal Muhammad Karana



LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER



KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2013



I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetic (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA dapat diisolasi, baik dari sel hewan, manusia, maupun pada tumbuhan (Faatih, 2009). Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipuri-fikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA total (Faatih, 2009). DNA genom merupakan seluruh materi genetik yang dimiliki oleh suatu organisme termasuk di dalamnya DNA yang berinteraksi dengan protein dan RNA (Weaver, 1999). Isolasi DNA adalah pemisahan molekul DNA dari molekul lain seperti dinding sel, membran sel, dan membran inti sehingga strukturnya dapat terlihat dengan jelas. Tujuannya adalah mengidentifikasi dan mengkarakterisasi DNA yang dibutuhkan untuk proses analisis biomolekuler lainnya. Tahap-tahap dalam isolasi DNA tanaman yaitu pengambilan sampel (jaringan), lisis dinding sel dan membran sel, purifikasi serta presipitasi (Kephart 1999). Teknik molekuler bervariasi dalam cara pelaksanaan untuk mendapatkan data, baik tekniknya maupun tingkatan target data yang diinginkan sesuai kemudahan pelaksanaan, ketersediaan sumber daya manusia, fasilitas, dan dana (Karp et al. 1997). Ekstraksi untuk mendapatkan DNA berkualitas tinggi merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam pencandraan sidik jari DNA. Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol (Lumaret et al. 1998). B. Tujuan



Tujuan praktikum kali ini adalah untuk mengisolasi DNA kromosom buah dan mengetahui prinsip serta proses isolasi DNA buah.



II. MATERI DAN METODE A. Materi Bahan yang digunakan adalah buah strawberry (Fragraria vesca), buah papaya (Carica papaya), buah alpukat (Persea americana), buah mangga (Mangifera indica), buah naga (Hylocereus undatus), deterjen cair, NaCl (garam dapur), etanol absolut, akuades, dan tenderizer. Alat yang digunakan adalah kantung plastik, tabung ependorf, corong plastik, pipet plastik, sarung tangan, saringan (kain), dan kamera digital. B. Metode 1. Dua buah masing-masing dimasukkan ke dalam plastik. 2. Buah di dalam kantung plastik dihancurkan dengan cara diremas-remas. 3. Ke dalam kantung yang berisi buah, ditambahkan 50 ml larutan ekstraksi (900 ml akuades, 100 mL deterjen, 2 sendok teh garam dapur). 4. Larutan yang sudah tercampur disaring, ditambahkan tenderizer, dan dimasukkan ke dalam tabung ependorf. 5. Ditambahkan larutan etanol absolut dan kabut yang terbentuk diamati.



III. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil B. Tabel 1. Pengamatan Isolasi DNA Buah Kelompok



Buah



Kabut Putih (+)



(-)



1 2 3 4 5



Strawberry Alpokat Pepaya Mangga Buah Naga



+ + +



Gambar 1. DNA Strawberry (+)



Gambar 2. DNA Strawberry (+)



Gambar 3. DNA Pepaya (-)



Gambar 4. DNA Pepaya (-)



Gambar 5. DNA Alpukat (-)



Gambar 5. DNA Buah Naga (+)



+ + +



Gambar 6. DNA Mangga (+)



C. Pembahasans Buah yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA buah ini antara lain buah strawberry, buah alpokat, buah pepaya, buah mangga, dan buah naga. Dua buah tersebut masing-masing dimasukkan ke dalam kantung plastik. Kemudian, buah di dalam plastik dihancurkan dengan cara meremas-merasnya dengan tangan. Buah yang sudah hancur dimasukkan larutan ekstraksi sebanyak 50 ml. Larutan ekstraksi terdiri dari 900 ml akuades, 100 ml deterjen, dan 2 sendok teh garam dapur. Buah dalam plastik kemudian diremas kembali untuk mencampurkannya dengan larutan. Setelah tercampur, larutan disaring menggunakan corong plastik dan kain saring. Larutan yang sudah tersaring ditambahkan dengan tenderizer dan dimasukkan ke dalam tabung ependorf. Etanol dingin kemudian ditambahkan sampai volumenya 1,5 ml. kabut putih yang terbentuk dalam tabung ependorf selanjutnya diamati. Alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain kantung plastik yang berfungsi sebagai tempat untuk menghancurkan buah. Corong plastik dan kain kasa berfungsi untuk menyaring larutan yang sudah tercampur dengan buah. Sarung tangan digunakan untuk mencegah DNAse yang ada di kulit merusak DNA. Selain itu, sarung tangan juga menjaga agar terhindar dari bahan-bahan mutagenik dan karsinogenik. Pipet plastik digunakan untuk memindahkan larutan. Tabung ependorf berfungsi untuk sentrifugasi dan kamera digital berfungsi untuk mendokumentasikan hasil pengamatan. Berdasarkan pengamatan, didapatkan hasil bahwa isolasi DNA strawberry kedua-duanya memiliki hasil positif. Begitu juga pada buah mangga dan buah naga. Namun, pada buah pepaya dan alpokat menunjukkan hasil negatif. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya kabut putih yang terbentuk. Sebaliknya, hasil negatif ditunjukkan dengan tidak adanya kabut putih yang terbentuk. Tidak terbentuknya kabut putih tersebut diduga karena buah yang belum benar-benar hancur atau buah belum tercampur sempurna dengan etanol dingin absolut. Hasil yang positif sesuai dengan pernyataan Jamilah (2005) bahwa pada saat penambahan etanol, larutan akan tampak terbalik untuk beberapa saat, dan pada akhirnya ethanol akan berada di bagian atas tabung, sementara filtrat berada dibagian dasar tabung karena etanol memiliki kerapatan yang lebih kecil dibandingkan air. Sel makhluk hidup memiliki dinding sel pada bagian luarnya, sehingga untuk mengeluarkan materi DNA dari inti, dinding sel harus dipecah terlebih dahulu



dengan cara mekanik ataupun enzimatik yang biasa disebut sebagai proses isolasi DNA. DNA merupakan bahan penyusun gen dan makromolekul beruntai ganda berbentuk heliks yang berfungsi sebagai pewarisan sifat yang menyimpan beragam materi genetik. Tiap molekul DNA terdiri atas dua rantai panjang yang masingmasing tersusun dari empat jenis penyusun kimiawi yang disebut nukleotida (Campbell et al.2002). DNA genom merupakan seluruh materi genetik yang dimiliki oleh suatu organisme termasuk di dalamnya DNA yang berinteraksi dengan protein dan RNA (Weaver, 1999). Isolasi DNA adalah pemisahan molekul DNA dari molekul lain seperti dinding sel, membran sel, dan membran inti sehingga strukturnya dapat terlihat dengan jelas. Tujuannya adalah mengidentifikasi dan mengkarakterisasi DNA yang dibutuhkan untuk proses analisis biomolekuler lainnya. Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: (1) Isolasi sel; (2) Lisis dinding dan membran sel; (3) Ekstraksi dalam larutan; (4) Purifikasi; dan (5) Presipitasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm. Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA (Rogers and Bendich, 1994). DNA hasil isolasi perlu dimurnikan terlebih dahulu. Pemurnian DNA bertujuan untuk memperoleh DNA yang terbebas dari kontaminasi senyawa dan makromolekul lain. Tahapan yang dilakukan untuk memperoleh DNA murni yaitu membebaskan DNA dari dinding dan membran sel, disosiasi kompleks DNA-protein dengan cara denaturasi atau proteolisis, serta pemisahan DNA dari berbagai makromolekul lain (Ausubel et al., 1990). Pemurnian DNA dilakukan dengan menambahkan etanol ke dalam larutan yang mengandung DNA. Penambahan etanol dapat menyebabkan terjadinya pengendapan DNA (Sudjadi, 2008). DNA juga dapat diendapkan dengan larutan isopropanol, namun larutan ini lebih sulit menguap



dibandingkan dengan etanol sehingga memerlukan waktu yang lebih lama dalam proses evaporasi. Tahap yang paling penting dalam mengisolasi DNA adalah tahap pemecahan dinding sel untuk mengeluarkan DNA. Menurut Taylor et al. (1993), kegagalan dalam memecahkan semua dinding sel dari suatu jaringan dapat mempengaruhi hasil akhir isolasi DNA. Selain itu, selama penggerusan perlu ditambahkan nitogen cair untuk menjaga suhu tetap dingin sehingga DNA tidak rusak. Menurut Rogers and Bendich (1994), penambahan deterjen cair berfungsi melisis sel, mendenaturasi protein, dan memisahkan karbohidrat dari asam nukleat yang disebabkan perbedaan kelarutan. Fungsi dari penambahan garam yaitu untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat menyebabkan protein dan karbohidrat terpresipitasi. Penambahan garam juga dpat digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu memblokir dengan kutub negatif fosfat DNA. Dalam hal ini penambahan garam bisa dikatakan dapat membantu dalam hal pemekatan DNA (Dollard, 1994). Penambahan NaCl konsentrasi tinggi juga dilaporkan dapat meningkatkan kelarutan polisakarida dalam etanol, secara efektif mengurangi presipitasi tambahan pada polisakarida dan DNA (Sahasrabudhe & Deodhar, 2010). Purifikasi genom DNA tergantung pada seberapa kali pencuciannya. Tiga kali pencucian dengan sentrifugasi singkat cukup untuk purifikasi DNA dan membuang nuclease endogen atau protein lain. Penggunaan etanol dingin untuk presipitasi DNA meningkatkan hasil isolasi DNA (Sahasrabudhe & Deodhar, 2010). Penambahan etanol dingin berfungsi untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul. Strandstrand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagai benang benang putih yang terapung di atas filtrat. Pemekatan dengan etanol pada lapisan atas sampel sehingga terjadi presipitasi DNA pada perbatasan kedua larutan (Jamilah, 2005). Pada saat penambahan etanol, larutan akan tampak terbalik untuk beberapa saat, dan pada akhirnya ethanol akan berada di bagian atas tabung, sementara filtrat berada dibagian dasar tabung karena etanol memiliki kerapatan yang lebih kecil dibandingkan air (Jamilah, 2005). Akuades pada larutan ekstraksi berfungsi sebagai pelarut. Menurut Syafaruddin dan Santoso (2011), seiring dengan berkembangnya ilmu pengetahuan yang mampu mendukung akselerasi kemajuan dari seleksi untuk



mendapatkan



karakter



yang



diinginkan,



berbagai



metode



seleksi



dengan



memanfaatkan isolasi DNA juga berkembang, antara lain adalah seleksi dilakukan pada tingkat gametofit dan sporofit, seleksi secara in vitro, dan seleksi tingkat molekuler. Metode PCR dengan menggunakan sepasang primer, yang meliputi : STSs (Sequence-Tagged Sites) dan (SCARs) Sequence Characterized Amplified Regions, DALP (Direct Amplification of Length Polymorphism), SSRs (Simple Sequence Repeats), IFLP (Intron Fragment Length Polymorphism), ESTs (Expressed Sequence Tags), RAMP (Random Amplified Microsatellite Polymorphism) dan REMAP (Retroposon-Microsatellite Amplified Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) dan modifikasinya, SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) dan melacak beberapa sifat QTL (Quantitative Trait Locus). Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis atau forensik, seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman untuk tujuan diagnostik. Di sisi lain, ilmu forensik perlu memulihkan DNA untuk identifikasi individu (misalnya bagi pencuri, kecelakaan atau korban perang), penentuan ayah atau identifikasi hewan.



IV. KESIMPULAN A. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan sebelumnya dapat diambil kesimpulan bahwa: 1.



Hasil isolasi DNA buah strawberry (Fragraria vesca), buah mangga (Mangifera indica), dan buah naga (Hylocereus undatus) adalah positif, yang artinya terdapat kabut putih pada tabung ependorf. Sedangkan hasil isolasi DNA buah papaya (Carica papaya) dan buah alpukat (Persea americana) adalah negatif.



2.



Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu isolasi sel, lisis dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. B. Saran Untuk praktikum selanjutnya sebaiknya lebih dimaksimalkan lagi waktu



praktikumnya.



DAFTAR REFERENSI Ausubel FM et al. 1990. Current Protocols in Molecular Biology. Kanada, John Willey & Sons. Campbell NA, JB Reece, and LG Mitchell. 2002. Biologi. Ed ke-5. Lestari R, EIM Adil, N Anita, Andri, Wibowo WF, W Manulu, penerjemah; Safitri A, L simarmata, HW Hardani, editor. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Biology Fifth Edition. Dollard. 1994. Personality And Psychotherapy: An Analysis In Terms Of Learning, Thinking And Culture. New York: McGraw-Hill. Faatih, M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom Isolation and Digestion of Chromosomal DNA. Sains dan Teknologi, 10(1), 61-67. Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang. Karp, A., S. Kresovich, K.V. Bhat, W.G. Ayad, and T. Hodgkin. 1997. Molecular Tool in Plant Genetic Resources Conservation: A Guide to The Technologies. IPGRI Technical Bulletin no. 2. Kephart D. 1999. Rapid Isolation of genomic DNA from small quantities of human tissue. http://www.promega.com/profiles/203/ProfilesinDNA_203_07.pdf. Diakses pada tanggal 18 Mei 2013. Lumaret, R., H. Michaud, J.P. Ripoll, and L. Toumi. 1998. Chloroplast DNA Extraction Procedure For Species High In Phenolics And Polysaccharides. p. 15-17. In A. Karp, P.G. Isaac, and D.S. Ingram (Eds.). Molecular Tool for Screening Biodiversity. Chapman and Hall, London. Rogers, S.O. and Bendich, A.J. 1994. Extraction of total celluler DNA from plants, algae, and fungi. Plant Mol Biol DI: 1-81. Sahasrabudhe, A., & Deodhar, M. 2010. Standardization of DNA Extraction and Optimization of RAPD-PCR. International Journal of Botany, 6(3), 293-298. Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta, Kanisius. Syafaruddin dan T. J. Santoso. 2011. Optimasi Teknik Isolasi dan Purifikasi Dna Yang Efisien dan Efektif Pada Kemiri Sunan (Reutalis trisperma (Blanco) Airy Shaw). Jurnal Littri 17(1), Maret 2011. Hlm. 11 – 17. Taylor BH, Manhart JR, Amasino RM. 1993. Isolation and Characterizations of Plants DNA, Methods in Plant Moleculer Biology and Biotechnology. London: CRC Pr. Weaver, R.F. 1999. Molecular Biology. WCB McGraw-Hill Publisher. USA.