Isolasi Virus [PDF]

Citation preview

Isolasi virus Isolasi virus adalah mengambil virus yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Material otopsi yang dapat digunakan untuk mengisolasi adalah Sistem syaraf: otak &sumsum tulang belakang, Jantung, Pantropik: ginjal, hati, limfa, Feses: rectal swab, Darah, Cairan tubuh: cerebrospinal, perironeum, Urin. Menumbuhkan virus dalam rangka mengisolasi virus dapat dilakukan dengan cara: 1. In Ovo, yaitu menumbuhkan pada media telur berembrio (telur yang sudah dibuahi) 2. In Vivo, yaitu menumbuhkan ada hewan percobaan sebagai model 3. In Vitro, yaitu menumbuhkan virus didalam gelas atau tabung menggunakan media biakan jaringan atau biakan cell. Material penyakit yang mengandung virus harus ditempatkan dalam tabung tertutup kedap udara bila didinginkan dengan CO2 padat (es kering) untuk menghindari perusakan virus oleh gas CO2. sejumlah virus dapat diinaktifkan oleh proses pembekuan pencairan (freezing-thawing). Sebagian besar virus dapat diinaktifkan pada suhu 56 ˚ c selama 30 menit atau 100 ˚ c selama beberapa detik karena terjadi proses denaturasi virus. Pengawetan virus dapat dilakukan dalam keadaan beku, atau freeze drying, dapat disimpan bertahun-tahun pada ampul gelas hampa udara dalam nitrogen cair -196 ˚c Virus harus ditumbuhkan dalam sel hidup. Mereka tidak dapat tumbuh dalam media kultur atau pada piring agar saja, mereka pasti sel-sel hidup untuk mendukung replikasi virus. Dalam metode plak: Virus, bakteri, dan agar dicampur, berlapis dan diinkubasi. Setelah replikasi virus lyses bakteri, membentuk plak, atau zona yang jelas. Setiap plak diasumsikan berasal dari partikel virus tunggal.



Gambar 1. Contoh metode invitro Metode penyuntikan telur berembrio atau in ovo memunyai 5 bagian sel yang dapat disuntikkan, yaitu:



1. Sel epitel khorion yang berada pada membran khorion 2. Sel epitel alantois yang merupakan sel penyusun pada membran khorioalantaois 3. Sel spitel amnion yang melapisi ruang amnion 4. Sel pada kantong kuning telur( yolk sac) dan sel endotel pada pembuluh darah 5. Sel dari embrionya itu sendiri yang umumnya adalah sel fibroblast



Gambar 2. Metode in ovo Virus yang tumbuh pada telur berembrio biasanya ditandai dengan kematian embrio,embrio menjadi kerdil,perdarahan di bawah kulit,pertumbuhan abnormal otot dan bulu serta organ visceral seperti hati dan limfanya membengkak,warnanya pucat dan kehijauna,ada nekrotik,fokal di hati dan jantung dan endapan asam urat di ginjal,selaput corio alantois (CAM)menebal karena edemaa dan terdapat bintik putih (pock)atau plak. Berbagai metode dapat dipakai untuk identifikasi dan klkasifikasi virus yaitu berdasarkan : 1. tipe asam inti (DNA atau RNA) 2. diameter virion 3. bentuk nukleokapsid (kubus atau helical) 4. sifat kimiawi virus,kepekaan terhadap pelarut lemak yaitu lipoprotein 5. sifat fisika (thermo stabilitas)yaitu kepekaan virus terhadap pemanasan pada suhu 56 C,proses cair beku,ultra sonikasi 6. sifat biologis yaitu kemampuan mengaaglutinasi darah ,merah unggas dan mamalia,elusi dan patogenitas (2 : 3-6)



Tujuan : Mengisolasi virus yang dicurigai dalam telur berembrio Alat : Alat peneropong posisi embrio, Pencil, Spuit steril 1 ml, Bor telur, Selotip/kutek/lilin, Inkubator Reagen : Desinfektan ( Alkohol 70% atau yodium) Bahan : Telur berembrio Prosedur kerja : A. Penyuntikan telur berembrio Metode Penyuntikan Intra alantois Prosedur kerja : 1. intra Selaput alantois • Digunakan embrio umur 8-11 hari. • Dekat dengan rongga udara di desinfektan dan dilubangi dengan bor telur. • Menggunakan tuberculin syring dengan jarum berukuran 25 gauge (16 mm),inokulum sebanyak 0,1 – 0,2 ml pertelur.disuntik dengan hati-hati langsung ke dalam selaput alantois. Jarum tidak boleh digerak-gerakkan ke samping untuk menghindari sobeknya selaput korio alantois dan matinya alantois. • Lubang bekas suntikan ditutup dengan kutek atau lilin dan telur diinkubasi di dalam inkubator suhu 37C selama 3 – 7 hari • Telur diperiksa setiap hari untuk melihat apakah ada embrio yang mati.jika ada embrio yang mati atau embrio yang masih hidup setelah periode inkubasi dikeluarkan dari inkubator dan didinginkan dalam kulkas selama 1 jam • Telur didesinfeksi,kulit telur dipotong di atas batas rongga udara kemudian cairan alanto amnionik dipanen menggunakan pipet pasteur dan ditampung dalam botol atau beaker steril. • Embrio dikeluarkan dan diletakkan di dalam petri disk • Perubahan diamati seperti perdarahan di bawah kulit,udema,dan kerdil 2. intra Korio-alantois • Digunakan embrio umur 10 - 11 hari.



• Kulit telur dekat rongga udara dan sebelah samping didesinfeksi • Kulit telur dibor,pengeboranharus hati-hati jangan sampai menembus selaput korio alantois atau mengenai pembuluh darah • Telur ditempatkan dengan poisisi horisontal,kemudian dibuat rongga udara tiruan disamping dengan cara menyedot udara melaui lubang rongga udara • Setelah lubang udara berpindah ke samping,lubang udara semula pada rongga udara ditutup dengan kutek atau lilin • Inokulum sebanyak 0,1-0,2 ml,dimasukkan vertikal masuk di atas selaput korio alantois.lubang ditutup dengan kutek atau lilin • Telur diinkubasi 37C selama 5607 hari dan diperiksa setiap hari untuk melihat apakah ada embrio yang mati.jika ada embrio yang mati atau embrio yang masih hidup setelah periode inkubasi dikeluarkan dari inkubator dan didinginkan dalam kulkas selama 1 jam • Telur didesinfeksi,kulit telur dipotong dekat rongga udara kemudian cairan alanto amnionik dipanen menggunakan pipet pasteur dan ditampung dalam botol atau beaker steril. • Embrio dikeluarkan dan diletakkan di dalam petri disk • Selaput korio alantois diambil dan diperiksa perubahan seperti udema,penebalan dan bintik atau bercak putih (pock atau plak) • Selaput korio alantois ini ditampung dengan cairan alanto amnionik tadi 3. intra kuning telur • Digunakan telur berembrio umur 6-8 hari • Telur diletakkan posisi tegak,kulit telur di atas rongga udara didesinfektan kemudian dibor • Menggunakan spuit 1 ml dan jarum 25 mm, telur diinokulum dengan suntikan tegak lurus masuk ke selaput kuning telur.disedot sedikit untuk memastikan jarum telah masuk kuning telur • Lubang telur ditutup dengan kutek atau lilin dan diinkubasi 37C selama 3-10 hari atau sampai embrio menetas • Telur diperiksa setiap hari.jika ada embrio yang mati atau masih hidup selama periode inkubasi maka segera dikeluarkan dan dimasukkan ke dalam kulkas



4. intra amnionik • Digunakan embrio telur umur 10-11 hari. • Posisi telut ditentukan dan diberi tanda dengan pencil • Kulit telur di atas rongga udara didesinfeksi kemudian kulit telur dibor • Menggunakan spuit 1 ml dengan jarum 22 gauge sebanyak 0,1-0,2 ml inokulum disuntikan langsung menembus selaput amnionik. Jika jarum tepat masuk selaput tersebut maka akan ada gerakan embrio menyentuh ujung jarum • Lubang telur ditutup dengan kutek atau lilin dan diinkubasi 37C selama 2-4 hari • Telur diperiksa setiap hari.jika ada embrio yang mati atau masih hidup selama periode inkubasi maka segera dikeluarkan dan dimasukkan ke dalam kulkas 1 jam 5. intra venous • Digunakan telur berembrio umur 10-12 hari • tentukan posisi pembuluh darah di bawah batas rongga udara • kulit telur didesinfektan kemudian kulit telur dibor bentuk segitiga tepatdi lokasi pembuluh darah. Hati-hati jangan sampai menembus selaput korio alantois • supaya pembuluh darah jelas terlihat,kulit telur diusap dengan aseton sedikit. • Menggunakan spuit 1 ml dan jarum 16 mm (25 gauge) inokulum dimasukkan melalui pembuluh darah dengan arah ke rongga udara • kulit telur ditutup kembali dengan potongan kulit telur semula kemudian ditutup dengan selotip dan diinkubasi 37C selama 7 hari • Telur diperiksa setiap hari.jika ada embrio yang mati atau masih hidup selama periode inkubasi maka segera dikeluarkan dan dimasukkan ke dalam kulkas Cara memanen specimen dari telur terinfeksi adalah: Kulit telur didesinfeksi, Kulit telur dipotong tepat di atas batas rongga udara, Cairan alantois,amnionik, selaput korio alantois, selaput kuning telur dan embrio di panen, Perubahan pada selaput korio alantois diamati penebalan,bercak-bercak putih,perdarahan di bawah kulit embrio dan kekerdilan.



Keberhasilan isolasi dan propagasi virus pada telur dipengaruhi oleh: rute inokulasi, umur embrio pada telur, temperatur/suhu inkubasi, lamanya waktu inkubasi setelah inokulasi, volume dan pengenceran inokulum yang digunakan, status kekebalan flok dari induk tempat telur berasal. Dalam membiakkan virus menggunakan telur, sebaiknya digunakan telur yang berasal dari breeding flock yang bebas atogen tertentu (SPF/Spesifik Pathogen Free). Contoh isolasi metode in ovo pada virus avian influenza adalah dengan menggunakan telur SPF (Spesifik Pathogen Free), Telur ayam bertunas umur 11 hari diperiksa (diteropong) embrionya dengan lampu candling dan diberi tanda tempat penyuntikan, Tempat penyuntikan dipilih sejauh mungkin dari embrio dan pembuluh darah. Daerah disekitar tempat penyuntikan didesinfeksi dengan alkohol 70% dan atau dengan larutan yodium 10%, Tempat penyuntikan pada rongga udara dilubangi dengan jarum penusuk, Inokulum disuntikan sebanyak 0,2 ml per telur melalui lubang yang telah dibuat kedalam kantong alantoik (Allantoic Cavity). Lubang tempat penyuntikan ditutup dengan lilin atau malam (wax) atau parafin. telur kemudian disimpan dalam inkubator bersuhu 37° C , diamati selama 4 hari. Telur- telur yang mati setelah diinokulasi dibuka kemudian cairan alantoiknya diambil untuk diuji dengan Uji HA. Telur-telur yang tidak mati selama 4 hari dari inokulasi, dibunuh dengan cara memasukan pada suhu 4° C selama semalam, Kemudian dibuka dan cairan alantoiknya diambil dan ditampung kedalam botol/tabung yang seteril secara aseptis untuk diuji Rapid dengan menggunakan set butir darah merah (BDM) ayam 10%. Bila dalam uji rapid test diamati adanya penggumpalan butir darah merah (BDM), maka hal itu merupakan petunjuk bahwa dalam telur tersebut terjadi pertumbuhan virus, Ini berarti virus yang mempunyai daya hemaglutinasi dapat diisolasi. Selanjutnya terhadap isolat ini dilakukan identifikasi. Contoh isolasi metode in vivo pada virus dengue adalah, Spesimen yang bisa digunakan diantaranya serum fase akut,plasma dari pasien, autopsi jaringan dari kausal fatal (hati, nimfa, nodus limfa, dan timus), serta pengumpulan nyamuk dilingkungan sekitar. Jaringan darah dan nyamuk yang terinfeksi harus dititrasi atau disonikasikan sebelum inokulasi. Metode isolasi virus dengue: Inokulasi nyamuk. Konfirmasi infeksi virus denguenya adalah terdapat antigen dalam hancuran kepala yang ditunjukkan melalui imunofluoresens. Inokulasi sel serangga atau kultur mamalia. Konfirmasi infeksi virus dengue adalah keberadaan antigen dalam sel yang ditunjukkan melalui immunofluorence dan efek sitopatik dan pembentukan plak pada sel mamalia