Laporan Praktikum Pewarnaan Bta - Wan Dwi Ulan - B-06 [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM PEWARNAAN BTA UNTUK PENAPISAN TB PARU



Oleh: Wan Dwi Ulan 1707101010062 B-06



FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SYIAH KUALA 2020/2021



Judul Praktikum



: Pewarnaan BTA untuk Penapisan TB Paru



Hari/Tanggal Praktikum



: Rabu/ 11 November 2020



Tujuan Praktikum



: Tujuan dari praktikum ini adalah:



• Membuat sediaan untuk pewarnaan BTA • Melakukan pengecetan/pewarnaan BTA • Mengedentifikasi bentuk-bentuk (morfologi) dan sifat BTA pada



preparat yang



telah dibuat. Tinjauan Pustaka



:



Bakteri tahan asam (BTA) merupakan nama lain dari Mycobacterium tuberculosis yaitu bakteri yang memiliki kandungan lemak yang sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa dan tidak bisa dipengaruhi oleh reaksi pewarna lainnya, tetapi harus diwarnai dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA) karena bisa mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol asam). Pada bakteri ini juga telah dilakukan proses pewarnaan dengan berbagai zat warna secara permanen dan memiliki sifat yang asam atau alkohol. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis (penyebab TBC). Bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi dari sputum penderita TBC. Reaksi hasil pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC berwarna merah. Selain menyerang manusia Mycobacterium tuberculosis juga bisa menyerang hewan seperti marmut, dan kera. Penularannya bisa melalui udara yang masuk ke saluran pernafasan (Pelczar dan Chan, 1988). Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu barantai karbon (C) yang panjangnya 8-95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat serta mengandung lipid yang bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. BTA ini merupakan jenis bakteri yang memiliki dinding bakteri tahan asam yang mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar ditembus cat dan tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan pemanasan sehingga lapisan lilin dan lemak bisa ditembus cat basic fuchsin. Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai dengan pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan impermeabel



terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam (Ball, 1997). Mikobakteria memiliki dinding sel kaya lipid yang menahan beberapa zat warna, bahkan dapat menahan perubahan warna dengan adanya asam (tahan asam). Terdapat lebih dari 50 spesies mikobakteria, sebagian besar merupakan organism lingkungan yang jarang menyebabkan infeksi pada manusia. Selain itu, Mikobakteria juga merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari oksidasi beberapa senyawa sederhana.(Gillespie, 2007). Mycobacterium tuberculose termasuk Gram Positif, tahan asam dan alcohol, pertumbuhan lambat pada media buatan sekitar 6 sampai 8 minggu, berbentuk coccoid dan seperti benang, tidak bergerak, dan tidak memiliki spora. Sifat pertumbuhan kuman tuberculosis adalah aerob, sukar tumbuh pada media biasa, dan memerlukan pembenihan istimewa (mengandung telur). Suhu optimum 37° C, pH optimum pembenihan antara 6,0-8,0 dan pH optimum antara 6,5-6,8. Keistimewaan kuman ini adalah sekali menangkap zat warna maka sukar terlepaskannya, tahan terhadap asam dan mineral (Girsang, 2013). Mycobacterium memiliki keistimewaan, karena dinding selnya mengandung lipida yang terlihat sebagai lapisan lilin. Kandungan lipida ini sangat tinggi, pada beberapa spesies lipida ini dapat mencapai sampai 60% dari berat dinding sel. Kandungan lipida yang tinggi ini menyebabkan sel bakteri sulit diwarnai, karena zat warna tidak dapat menembus lapisan lilin ini. Jika bakteri tahan asam diwarnai dengan larutan kalbol fucshin, maka zat warna ini tidak mudah dilunturkan oleh larutan pemucat (Lay, 1994). Mycobacterium tuberculosis merupakan bakteri gram positif, berbentuk batang panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat (2-8 minggu), suhu optimal 37-380C yang merupakan suhu normal manusia. Pertumbuhannya membutuhkan tambahan makanan seperti darah, egg yolk, serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam jaringan, basil tuberkel adalah bakteri batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4 – 3 μm. Pada media buatan, bentuk kokoid dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke spesies lain. Segera setelah diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat didekolorisasi oleh alkohol, tanpa memperhatikan pengobatan dengan iodine. Basil tuberkel secara umum dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Media untuk membiakan mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif. Media selektif berisi antibiotik untuk mencegah pertumbuhan kontaminan



bakteri dan fungi yang berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk kedua media nonselektif dan selektif, yaitu media agar semisintetik (middlebrook 7H10 dan 7H11), media telur inspisasi (Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media) (Jawetz et al., 2001). Bakteri tahan asam dapat diamati dengan teknik pewarnaan Ziehl Neelson, Kinyoun Gabber, dan Fluorochrom. Pengambilan sputum (sekret paru-paru atau ludah) untuk analisis tuberculosis dapat dilakukan setiap saat dikenal ada 3 jenis sputum: Sputum pagi



: sputum yang dikeluarkan oleh penderita pada saat bangun pagi.



Spot sputum



: sputum yang dikeluarkan pada saat itu.



Collection sputum



: sputum yang keluar dan ditampung selama 24 jam



Sputum yang telah diperoleh dapat disimpan dalam lemari es selama satu minggu. Dalam menegakkan diagnosis tuberkulosis paru, menilai keberhasilan pengobatan, dan menentukan potensi penularan tuberkulosis paru dapat juga dilakukan pemeriksaan dahak (sputum) mikroskopis. Pemeriksaan dahak dapat dilakukan dengan mengumpulkan 3 spesimen dahak dalam dua hari kunjungan yang berurutan sewaktu-pagi-sewaktu (SPS). 1. S (sewaktu) : Dahak dikumpulkan pada saat suspek tuberkulosis datang berkunjung pertama kali. Pada saat pulang, suspek membawa sebuah pot dahak untuk mengumpulkan dahak pada pagi hari kedua. 2. P (pagi) : Dahak dikumpulkan dirumah pada pagi hari kedua, segera setelah bangun tidur. Pot dibawa dan diserahkan sendiri kepada petugas. 3. S (sewaktu) : Dahak dikumpulkan pada hari kedua, saat menyerahkan dahak pagi hari. Teknik pewarnaan warna pada bekteri bisa dibedakan menjadi 3 macam yaitu; pengecatan sederhana, pengecatan diferensial, dan pengecatan struktural. Pada teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada pemberian warna pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat mempertahankannya. Carbol fuchsin merupakan fuksin basa yang dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi



pemanasan untuk melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru (Lay, 1994). Menurut



Entjang



(2003), pada pewarnaan



bakteri



dengan



metode



Ziehl-



Neelsendapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu : 1. Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tahan asam (acid fast). 2. Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tidak tahan asam (non acid fast).



Metode Ziehl-Neelsen digunakan karena cukup sederhana dan mempunyai sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan sensitivitas yang tinggi sebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom. Bakteri yang terwarnai menunjukkan warna yang kontras dengan lingkungannya dan tidak membutuhkan perbesaran sampai 1000x sehingga bisa mempercepat waktu. Akan tetapi, alat yang digunakan tidak ada yaitu mikroskop fluorescens (Kurniawati et al., 2005). Larutan kimia yang digunakan adalah alkohol asam 3% , carbol fuchsin 0,3%, serta methylen blue 0,3% yang masing-masing mempunyai fungsi antara lain asam alkohol digunakan sebagai peluntur, carbol fuchsin mempunyai fungsi membuka lapisan lilin agar menjadi lunak sehingga cat dapat menembus masuk ke dalam sel bakteri M. tuberculosis. Methylen blue berfungsi sebagai cat lawan dan pada pemberian methylen blue pada bakteri akan tetap berwarna merah dengan latar belakang biru atau hijau (Jutono dkk., 1980). • Negatif: apabila tidak ditemukan BTA. • Positif: apabila terdapat 1 – 9 BTA / 100 lapang pandang. • Positif 1: apabila terdapat 10 – 90 BTA / 100 lapang pandang.



• Positif 2: apabila terdapat 1 – 9 BTA / 1 lapang pandang. • Positif 3: apabila terdapat > 10 BTA / 1 lapang pandang



Alat dan Bahan Alat



:



: •



Pensil



•



Lampu spiritus



•



Objek glass



•



Ose



•



Pipet tetes steril



•



Penjepit atau pinset



•



Mikroskop



•



Tusuk sate bambu.



Bahan :



• Sputum • Minyak Emersi • Akuades/air keran • Larutan karbol fuchsin 1% • Larutan alcohol asam 3% • Methylen Blue Prosedur Kerja



:



1) Disiapkan alat dan bahan 2) Dibersihkan objek gelas hingga bebas lemak 3) Ditulis kode atau nomor sediaan pada sudut objek gelas 4) Dibuat sediaan dahak, dengan cara diletakkan sedikit sputum ke objek gelas menggunakan tusuk sate bambu, kemudian diratakan menggunakan ose. 5) Difiksasi sediaan dahak dengan meletakkan objek gelas diatas lampu spiritus 6) Diatus sediaan pada tempatnya 7) Digenangi larutan carbol fuchsin pada sediaan yang telah difiksasi



8) Panaskna sampai menguap selama 5 menit 9) Pewarna dibuang dengan cara dibilas menggunakan air mengalir dan ditetesi asam alcohol selama 1-2 detik 10) Dicuci dengan air mengalir setelah dekolorisasi 11) Dilakukan pewarnaan kontras dengan ditambahkan methylen blue kurang lebih 1 menit 12) Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan sediaan yang telah diwarnai 13) Diperiksa di bawah mikroskop dengan menggunakan minyak imersi.



Hasil Pengamatan



:



Gambar: Preparat hasil pewarnaan BTA Gambar di atas merupakan hasil pewarnaan basil tahan asam (BTA) metode ZiehlNeelsen yang dilihat di bawah mikroskop dengan pembesaran 100x. Bakteri tahan asam tampak berbentik basil warna merah sedangkan bakteri yang tidak tahan asam berwarna biru. Pembahasan : Bakteri genus mycobacterium dan beberapa spesies nocardia pada dinding selnya mengandung banyak zat lipoid (lemak) sehingga bersifat permiable dengan pewarnaan biasa. Bakteri tersebut bersifat tahan asam (+) terhadapa pewarnaan tahan asam. Pewarnaan tahan asam dapat digunakan untuk membantu menegakkan diagnosa tuberkulosis. Pewarnaan tahan asam



menggunakan larutan ziehl-Neelsen A (cat karbol fuchsin), Ziehl-Neelsen B (alkohol asam :HCL 3% dalam metanol 95%) dan ziehl –neelsen C (cat biru metilen). Hasil pewarnaan maka bakteri tahan asam akan berwarna merah dan bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru. Adapun kelemahan dan kelebihan Ziehl Neelsen yakni: latar belakang berwarna biru terang, basil merah jelas, reagen terjangkau dan mudah didapat, fenol diencerkan 5% dan tidak dipanaskan karena pemanasan dilakukan pada proses pewarnaan sedian zat warna utama maka dari itu agak lama waktu yang dibutuhkan. Kesimpulan : Pewarnaan BTA merupakan pewarnaan yang dilakukan untuk mengidentifikasi Bakteri Tahan Asam. Pewarnaan ini tidak spesifik untuk Mycobacterium tuberculosis karena hasil pewarnaan BTA juga akan positif terhadap genus Mycobacterium lain. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam proses pengecatan BTA adalah pada saat dekolorisasi dengan asam alkohol dimana pemberian asam alkohol jangan sampai berlebih karena akan menyebabkan overdekolorization sehingga sel BTA hampir sama dengan Non BTA yang menyebabkan sulit membedakannya, tetapi jangan juga terlalu sedikit dalam memberikan alkohol (underdecolorization) karena tidak akan melunturkan warna secara sempurna sehingga sel Non BTA bisa saja berwrna ungu mendekati warna sel BTA. Saat pemanasan juga tidak boleh sampai mendidih karena akan menyebabkan sel bakteri lisis. Faktor-faktor yang memberikan perbedaan antara bakteri BTA dan non BTA adalah pada komponen dinding selnya. Daftar Pustaka



:



Pelczar, M. J. Dan , E. C. S., 1988, Dasar-Dasar Mikrobiologi, diterjemahkan oleh hadioetomo, R. S., Penerbit Universitas Indonesia, Jakarta Ball, A.S. 1997. Bacterial cell culture : Essential Data. John wiley & Sons, New york. Gillespie, S.H., Bamford, K., 2007. At A Galance Mikrobiology Medis dan infeksi. Edisi ke3. Erlangga, Jakarta.



Girsang, M. Mycobacterium Penyebab Penyakit Tuberculosis Serta Mengenal Sifat – Sifat Pertumbuhannya di Laboratorium. Pusat biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan Badan Litbang Kesehatan. Jakarta. W. Lay, Bibiana. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Raja Grafindo Persada. Jawetz, et al. 2001. Mikrobiologi kedokteran, edisi XXII, diterjemahkan oleh Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga. Salemba Medika, Jakarta. Kurniawati A, Risdiani E, Nilawati S, Prawoto, Raswana Y, Alisyabana B, et al. Perbandingan Tan Thian Hok, Ziehl Neelsen dan Flurookom sebagai metode Pewarnaan Hasil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara, kesehatan. 2005;29-33. Jutono.1980. Pedoman Praktikumn Mikrobiologi Umum. Yogjakarta:Fakultas pertanian UGM.



.