Laporan Real Time PCR Covid-19 [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM BIOMEDIK NAMA



: KHAMARIL WARDANI



NIM



: P07134219021



A. Judul



: Pemeriksaan COVID-19 dengan Teknik Real Time PCR



B. Tujuan



: untuk melakukan deteksi dini terkait infeksi virus Corona baru, COVID-19 di masyarakat.



C. Dasar Teori



: PCR adalah singkatan dari polymerase chain reaction Jika dialih bahasakan ke dalam Bahasa Indonesia menjadi reaksi berantai menggunakan aktivitas enzim Polymerase. PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, orang dapat menghasilkan DNA dalam  jumlah besar dalam waktu singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang sangat kecil. Real Time PCR (qPCR) adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Dalam ilmu biologi molekular, Real Time PCR (juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction (Q-PCR/qPCR) atau kinetic polymerase chain reaction adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Real Time PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuantifikasi (sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisa. Real Time PCR (qPCR) atau dapat pula disebut kuantitatif PCR real time (qPCR) atau PCR kinetik adalah teknik laboratorium berdasarkan PCR, yang digunakan untuk mengamplifikasi dan secara simultan mengukur molekul DNA target. Untuk satu atau lebih urutan tertentu dalam sampel DNA, Real TimePCR memungkinkan deteksi dan kuantifikasi secara bersamaan. Kuantitas yang didapat berupa jumlah salinan mutlak atau jumlah relatif ketika dinormalisasi untuk DNA yang dimasukkan atau gen normalisasi tambahan. Pada analisa PCR konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan



keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektroforesis. Sedangkan analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda). Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik. D. Alat & Bahan



: Alat 1. Mikropipet 2. Tabung PCR 3. Rak tabung PCR 4. Kolom/ tabung 5. Lemari pengaman mikrobiologis 6. Kit 7. Computer 8. Sentrifuge 9. Tip 10. Mikrocentrifuge 11. Tabung tutup sekrup 12. Thermocylcer PCR 13. Penyemprot desinfektan 14. Bahan 1. Sampel 2. Etanol 95-100% 3. Buffer 4. Desinfektan 5. Aerosol 6. Air bersih 7. Enzim RT-PCR 8. Negative control 9. Positif ontrol 10. DNase 11. Direct-zol



E. Prosedur Kerja



: 1. Disiapkan alat dan bahan 2. Ekstraksi RNA virus menggunakan kit minirep langsung-zol RNA 3. Tambahkan 80µl sampel dan 240µl trizol dimasukkan kedalam tabung tutup sekrup kemudian dicampur selama 5 menit 4. Ditambahkan etanol 95-100% dan sampel lysed dengan



volume yang sama, kemudian diaduk hingga rata 5. Pindahkan sampel yang dilisiskan kedalam kolom putar yang ditempatkan dalam tabung koleksi 6. Dengan hati-hati semprotkan disinfektan ke permukaan kolom putar dan tabung koleksi sebelum ditempatkan kedalam microcentrifuge tertutup yang mengandung aerosol 7. Bersihkan bagian luar dan sarung tangan yang digunakan dengan desinfektan 8. Dimasukkan ke microcentrifuge. Lalu diputar dengan kecepatan 10 hingga 16000 rpm selama 30 detik 9. Setelah itu, lepaskan penampung dari microcentrifuge dan diletakkan kembali di dalaam lemari pengaman mikrobiologis sebelum dibuka, pindahkan kolom putar ke dalam tabung koleksi baru 10. Tambahkan 400µl direct-zol RNA kedalam kolom putar dan centrifuge. Kemudian, buang supernatant dan ulangi langkah ini sekali lagi 11. Tambahkan 700µl buffer kedalam kolom putar. Lalu di centrifuge selama 2 menit 12. Pindahkan kolom putar dengan hati-hati kedalam tabung yang bebas dari RNase 13. Untuk mengelusi RNA, ditambahkan 50µl DNase dan air bersih langsung ke matriks kolom dan centrifuge 14. Sebagai alternative untuk RNA yang sangat terkonsentrasi, dielusi menjadi 25µl 15. Dipindahkan RNA yang dielusi kedalam tabung sekrup. RNA yang dielusi dapat digunakan atau disimpan pada suhu ≤-20oC. diberi label F. Pembahasan



: Teknik PCR mempunyai akurasi hasil tinggi dan efisien waktu karena dapat mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan copy hanya dalam waktu beberapa jam. Cara kerja teknik ini menggunakan prinsip thermocycle, yaitu menaikkan dan menurunkan suhu untuk menggandakan fragmen DNA. Secara umum ada tiga tahapan perubahan suhu pada metode PCR, pertama adalah denaturasi untuk memisahkan sepasang untai DNA, kedua annealing untuk menempelkan primer ke cetakan DNA, ketiga pemanjangan, yaitu untuk ekstensi fragmen DNA dengan enzim polymerase dan primer untuk menghasilkan copy DNA. Dalam pengembangannya, dikenal juga real time PCR dengan menambahkan probe untuk menghasilkan sinyal fluoresen, sehingga kuantitas sekuen asam nukleat dapat diukur secara real time. Karena coronavirus hanya mengandung RNA diperlukan langkah mengubah RNA menjadi DNA. Langkah ini disebut reverse transcription atau transkripsi terbalik menggunakan enzim spesifik, sebab hanya DNA yang bisa digandakan atau diamplifikasi yang



menjadi bagian penting dalam RT-PCR untuk mendeteksi virus. Proses penggandaan memerlukan fragmen pendek DNA yang akan melengkapi dan menempel pada bagian target DNA virus jika virus terdapat dalam sampel. Campuran komponen-komponen tersebut kemudian ditempatkan di mesin RT-PCR. RT-PCR bekerja dengan prinsip thermocycle sesuai yang dijelaskan di atas untuk menggandakan bagian target DNA virus. G. Kesimpulan



: Pada pemeriksaan COVID-19 ini sangat dianjurkan menggunakan metode Real Time PCR karena metode ini memiliki akurasi hasil yang tinggi dan efisien waktu karena dapat mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan copy hanya dalam waktu beberapa jam.



H. Daftar Pustaka



: https://tirto.id/beda-rapid-test-dan-pcr-test-untuk-deteksi-viruscorona-covid-19-eKCY https://www.generasibiologi.com/2016/03/real-time-pcr.html https://www.scribd.com/doc/188178323/Real-Time-PCR http://www.medanbisnisdaily.com/news/online/read/2020/04/03/1047 36/mengenal_metode_pcr_untuk_deteksi_kasus_covid_19/ https://youtu.be/5f_wieig4iQ