Naftyan YF (PCR Konvesional & Real Time) [PDF]

Citation preview

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) METODE PCR KONVESIONAL DAN REAL TIME PCR LAPORAN PRAKTIKUM Disusun Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Tugas Instrumentasi Spesifik Dosen pengampu



: Roni Afriansya, ST.,M.Si



disusun oleh : NAFTYAN YUVINA F P1337434319041



PROGRAM STUDI SARJANA TERAPAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS JURUSAN ANALIS KESEHATAN POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES SEMARANG 2020



I.



Judul Laporan praktikum metode PCR konvensional dan real time PCR



II.



Tujuan Untuk mengetahui perbedaan cara pemeriksaan PCR dengan metode PCR konvensional dan real time PCR



III.



Prinsip A. PCR Konvensional Suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dan dilakukan dalam thermocycler. B. Real Time PCR/ qPCR Mendeteksi dan mengkuantifikasi reporter fluoresen. Sinyal fluoresen akan meningkat seiring dengan bertambahnya amplifikasi DNA PCR dalam reaksi. Reaksi selama fase eksponensial dapat dipantau dengan mencatat jumlah emisi fluoresen pada setiap siklus. Peningkatan hasil amplifikasi PCR pada fase eksponensial berhubungan dengan jumlah inisiasi target gen. makin tinggi tingkat ekspresi target gen maka deteksi emisi fluoresen makin cepat terjadi (Pardal, 2010).



IV.



Alat dan Bahan Alat A. PCR Konvensional



Bahan A. PCR Konvensional



1. PCR microtube



1. DNA genom hasil isolasi



2. Thermal cycler



2. ddH2O



3. Micropipette dan tip



3. PCR kit



4. Vortex



B. Real Time PCR/ qPCR



B. Real Time PCR/ qPCR



1. PCR microtube



1. DNA genom hasil isolasi



2. Mesin qPCR



2. SYBR Green I (DNA-binding



3. Micropipette dan tip



dye)/probe



4. Vortex



3. Fluorescence primer



5. Sentrifuse



4. ddH2O (DNAse free water) 5. qPCR kit



V.



Cara Kerja A. PCR 1. Menyiapkan PCR Master Mix (DNA polymerase, buffer, air) 2. Dalam setiap microtube, volume PCR total adalah 20 µl, yang terdiri atas; Komponen



Konsentrasi dalam



Volume yang dipipet dari



larutan working solution PCR master mix 1x 10 µl Template DNA 60 ng/20 µl 5 µl Primer 50 pmol/20 µl 5 µl Volume total larutan 20 µl Keterangan: konsentrasi DNA dan primer tergantung kondisi saat praktikum 3. PCR master mix terdiri atas: Komponen Konsentrasi final dalam volume PCR total Vi Buffer A 1x dNTP 0,08 Mm MgCl2 1,5 Mm DNA polymerase 2-3 unit 4. Komponen PCR ditambahkan ke dalam microtube dengan cara dipipet dan ditempelkan pada dinding microtube. Tiap komponen ditempelkan pada dinding yang berbeda. Dengan urutan memasukkan komponen PCR ke dalam microtube yaitu, PCR master mix, primer, kemudian terakhir template DNA 5. Setelah



seluruh



microtube



terisi,



microtube



dispin/sentrifuse



untuk



mengumpulkan larutan di dasar mirotube. Larutan PCR dihomogenasi (dicampur) dengan cara menjentik (tapping) bagian ujung microtube dan



kemudian di vortex sekali lagi. Jika PCR akan ditunda, maka sample dapat disimpan pada suhu -20ºC - 5ºC 6. Masukkan microtube ke dalam thermal cycler 7. Atur suhu sesuai kebutuhan 8. Analisis hasil PCR dapat dilihat dengan elektroforesis B. Real Time PCR/ qPCR 1. Menyiapkan PCR Master Mix (dilakukan dalam es) 2. PCR master mix terdiri atas; DNA polymerase, buffer, dNTPs, SYBR Green I/Probe 3. Vortex dahulu semua reagen yang akan digunakan agar larutan homogen 4. Siapkan sampel DNA hasil ekstrasi menggunakan kit yang tersedia 5. Masukkan masing-masing 23 µl larutan mix pada setiap PCR tube yang akan digunakan 6. Tambahkan masing-masing 2 µl ddH2O (control negative), control positif, dan sampel DNA yang akan diuji pada PCR tube yang sudah berisi 23 µl larutan mix 7. Tutup well menggunakan sealing plastic untuk PCR tube, lalu spin down untuk menurunkan larutan di bawah tube 8. Masukkan PCR tube ke dalam mesin real-time PR, lalu atur penamaan sampel dan semua parameter yang dibutuhkan 9. Atur program PCR seperti tabel dibawah ini; Tahapan Inisial denaturasi Denaturasi Annealing-ekstensi Pengulangan



Parameter Suhu



Waktu



95ºC 95ºC 60ºC



10 menit 15 detik 45 detik 40 siklus



10. Setelah proses PCR selesai, dapat langsung dilakukan analisis data VI.



Hasil Pengamatan



Gambar 1 : hasil PCR pada elektroforesis



Gambar 2: hasil Real Time PCR VII.



Pembahasan A. PCR Konvensional PCR konvensional adalah PCR di mana tahap perbanyakan materi genetik dan tahap deteksi produk PCR dilakukan secara berturut-turut, yaitu tahap deteksi dilakukan bila tahap perbanyakan materi genetik telah selesai. Reaksi PCR konvensional biasanya menggunakan satu pasang primer oligonukleotida untuk mengamplifikasi bagian tertentu dari genom agen infeksi serta dilakukan pada suatu tabung. Primer PCR adalah oligodeoksiribonukleotida pendek, atau oligomer yang dirancang untuk melengkapi urutan akhir sekuen dari amplikon target PCR dan digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. (Dyah Ayu dan Dharmayanti, 2014). Tahap deteksi dapat dilakukan dengan beberapa cara (format), salah satunya menggunakan elektroforesis gel kemudian dilanjutkan dengan hibridisasi pada membran menggunakan reagen pelacak atau hibridisasi



dalam tabung reaksi. Jika yang diekstraksi adalah materi genetik berupa DNA maka DNA dapat langsung diperbanyak. Namun jika yang diisolasi berupa RNA, maka diperlukan tahap tambahan untuk mengubah RNA menjadi DNA yaitu tahap transkripsi balik. B. Real Time PCR Real Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real time ini juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction atau Q-PCR. Teknik ini dapat digunakan untuk mengamplifikasi sekaligus menghitung jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Maksud dari kata real time pada metode ini adalah data fuoresensi yang dihasilkan dari proses amplifikasi dapat diamati secara langsung pada saat proses amplifikasi masih berjalan dan tanpa harus menunggu seluruh siklus amplifikasi selesai. Pada analisa PCR konvensional, deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan masih harus dilakukan dengan elektroforesis. Dengan analisa Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung. Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethydium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik. Cara kerja dari Real Time mengikuti prinsip umum reaksi PCR, utamanya adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai.



Gambar 3 : Alur Pemeriksaan Real Time PCR: Ekstraksi DNA, Amplifikasi dan Deteksi (Applied Biosystem) Real



Time



PCR merupakan



pengembangan



metode



PCR yang



hasil



amplifikasinya dianalisis selama proses amplifikasi dengan menggunakan pewarna DNA atau pelacak berfluoresensi. Analisis data dilakukan dalam instrumen yang sama, tanpa pemindahan sampel, tanpa penambahan sampel dan tanpa pemisahan dengan elektroforesis. Metode ini dapat digunakan untuk analisis secara kuantitatif jumlah awal sehingga dapat digunakan pengukuran secara kuantitatif (Sudjadi, 2008). Perbedaan PCR Konvensional/ standar dengan Real Time PCR PCR Konvensional Sensitivitas lebih rendah Presisi lebih rendah Tidak otomatis Hasil tidak dalam bentuk angka



Real Time PCR Sensitivitas lebih tinggi Presisi lebih tinggi Otomatis Data dikumpulkan dalam fase



Ada tahapan setelah PCR Deteksi keberadaan DNA dilakukan



pertumbuhan eksponensial PCR Tidak ada tahapan setelah PCR Keberadaan DNA hasil amplifikasi



pada akhir reaksi



dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi



Pengamatan keberadaan DNA hasil



fluoresensi dari probe (penanda) Pengamatan dapat dilakukan saat



amplifikasi dilakukan di gel agarosa



reaksi berlangsung



setelah dilakukan elektroforesis



VIII. Simpulan PCR konvensional adalah PCR dimana tahap perbanyakan materi genetik dan tahap deteksi produk PCR dilakukan secara berturut-turut, yaitu tahap deteksi dilakukan bila tahap perbanyakan materi genetik telah selesai. Reaksi PCR konvensional biasanya menggunakan satu pasang primer oligonukleotida untuk mengamplifikasi bagian tertentu dari genom agen infeksi serta dilakukan pada suatu



tabung. Pada analisa PCR konvensional, deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan masih harus dilakukan dengan elektroforesis. Real Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Teknik ini dapat digunakan untuk mengamplifikasi sekaligus menghitung jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Real time pada metode ini adalah data fuoresensi yang dihasilkan dari proses amplifikasi dapat diamati secara langsung pada saat proses amplifikasi masih berjalan dan tanpa harus menunggu seluruh siklus amplifikasi selesai. Pada analisa Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung. Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethydium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik.



IX.



Daftar Pustaka Nurhayati, Betty dan Sri Darmawati. 2017. Bahan Ajar Teknologi Laboratorium Medis (TLM) Biologi Sel dan Molekuler. Badan Pengembangan Dan pemberdayaan Sumber Daya Manusia Kesehatan Kemenkes RI. Wahyuni, Febriana Dwi. 2017. Modul Praktikum Biologi Molekuler. Universitas Esa Unggul: Jakarta.