Laporan Resmi Teknis Analis Instrumen [PDF]

Citation preview

LAPORAN RESMI PRAKTIKUM TEKNIS ANALIS INSTRUMEN PENETAPAN KADAR PARACETAMOL DENGAN HPLC



Disusun oleh Kelompok 2 Nama



:



NIM



: 5201905008



Kelas



: 2C Farmasi



UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH KUDUS PROGRAM STUDI S1 FARMASI FAKULTAS KESEHATAN TAHUN AJARAN 2020/2021



I.



JUDUL PRAKTIKUM “ PENETAPAN KADAR PARACETAMOL DENGAN HPLC”



II.



TUJUAN PRAKTIKUM a. Mahasiswa mampu mengoperasikan peralatan atau instrumen HPLC b. Mahasiswa mampu menerapkan prinsip kerja proses pengujian obat menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT (HPLC) dan pengolahan data hasil percobaan.



III. DASAR TEORI Kromatografi cairan kinerja tinggi atau dalam bahasa inggrisnya dikenal dengan sebutan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan salah satu teknik pemisahan campuran secara modern. Teknik HPLC ini merupakan salah satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/area standar. Pada prakteknya, pembandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar. Oleh karena itu, maka pembandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi. Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan system pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detector yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran. KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain; farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities) dan analisis senyawasenyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil). KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam



nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain. Beberapa senyawa organik yang mudah terurai (labil) pada pemanasan dapat dianalisis dengan cara kromatografi cairan kinerja tinggi atau HPLC karena HPLC dilakukan pada suhu kamar. Selain senyawa organic teknik HPLC juga dapat menganalisis senyawa anorganik, cuplikan yang mempunyai berat molekul tinggi atau titik didihnya tinggi seperti polimer. Kelebihan KCKT antara lain: 



Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran







Resolusinya baik







Mudah melaksanakannya







Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi







Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis







Dapat digunakan bermacam-macam detector







Kolom dapat digunakan kembali







Mudah melakukan rekoveri cuplikan







Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator dan reprodusibilitasnya lebih baik







Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif







Waktu analisis umumnya singkat







Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar







Ideal untuk molekul besar dan ion Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT



dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh. Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut dengan bantuan pompa, fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor, cuplikan dimasukkan ke dalam fasa gerak dengan penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan kompenen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu,



sebaliknya solut-solut yang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Kromatogram HPLC serupa dengan kromatogram gas. Komponen-komponen atau instrumentasi dari HPLC ialah sebagai berikut : 1. Fasa gerak Berupa zat cair yang disebut eluen (pelarut) dalam HPLC, fasa gerak selain bertugas membawa komponen-komponen campuran menuju detektor, juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut : a. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis. b. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatogram. c. Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbata pada kolom. Biasanya pelarut disaring dengan saringan nilon berukuran diameter 0,45 µm. Pompa vakum biasanya digunakan untuk menyaring partikel kotoran sekaligus menghilangkan gas dari pelarut karena gas dapat mengganggu base line. d. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun. e. Zat cair tidak kental. Umumnya keketalan tidak melebihi 0,5 cP (centi poise). f. Sesuai dengan detektor. Pemilihan zat cair sebagai fasa gerak ini merupakan hal yang kritis dalam keberhasilan pemisahan. Seyangnya, teori interaksi fasa gerak dengan sejumlah solut kurang jelas sehingga para pakar hanya dapat memilih sekelompok pelarut. Jadi, pada akhirnya, pemilihan fasa gerak didasarkan atas eksperimen trial-and error dengan berbagai jenis dan krom posisi pelarut hingga diperoleh kromatogram yang diharapkan. Dengan kata lain, fasa gerak yang baik memberikan faktor kapasitas k‟ pada rentang yang seesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaliknya dicari fasa gerak yang memberikan k‟ antara 2-5. Sedangkan untuk campuran multikomponen, waktu cukup untuk pemisahan semua komponen. Biasanya beberapa pelarut atau kombinasi pelarut dapat ditemukan



untuk memberikan faktor kapasitas yang cocok. Pemilihan pelarutpelarut juga bergantung pada faktor selektifitas (α) untuk komponen cuplikan. Gelembung udara (degassing) yang ada harus dihilangkan dari pelarut, karena udara yang terlarut keluar melewati detektor dapat menghasilkan banyak noise sehingga data tidak dapat digunakan. 2. Pompa Pompa dalam HPLC berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair malalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan : 



Menghasilkan tekanan sampai 600psi.







Keluar bebas pulsa







Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit.







Bahan tahan korosi.



3. Pemasukan Cuplikan Kebanyakan pemasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukan harus sekecil mungkin, beberapa puluh miroliter. Teknik pemasukan cuplikan kedalam system HPLC melalu injeksi srynge, injeksi “stop-flow”, dan kran cuplikan. 



Injeksi syringe Alat yang paling dulu ada dan paling paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit labih baik dari2-3% dan sering lebih jelek.







Injeksi ‘stop-flow’ Injeksi stop-flow adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara, asambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali.







Kran cuplikan Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah : a. Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi “load”, cuplikan masih berada dalam loop. b. Kran diputar untuk mengubah cuplikan “load” menjadi posisi “injeksi” dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat digantiganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500 µL. Dengan sistem pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukan cuplikan pada tekanan 7000 psi denga ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia dengan volume 0,5 hingga 5µL.



4. Kolom Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utma berisi fasa diam, tepat teradinya pemisahan camppuran menjadi komonen-komponennya. Bergantung keperluannya koom utama dapat digunkan untuk analisis atau preparatif. Untuk keperluan preparatif, setiap komponen yang keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector. Selain kolom utama dikenal pula kolom pengaman (guard kolom). Kolom utama berisi fasa diam dan jenisnya bervariasi bergantung keperluan, misalnya dikenal kolom C-18, C-8, cyanopropyl, penularan ion. Kolom jenis C-18 dan C-8 paling banyak dipakai dalam HPLC. Fasa diam jenis terikat ini dapat dibuat dengan mereaksikan silika dengan alkilklorosilana yang dikenal dengan reaksi silanisasi. 5. Detektor Berbagai detektor untuk HPLC telah tersedia, walaupun demikian detektor harus memenuhi persyaratan berikut : 



Cukup sensitive







Stabilitas dan ketrulangan tiggi







Respon linear terhadap solute







Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung alir







Reliabilitas tinggi dan mudah digunakan







Tidak merusak cuplikan.



Detektor HPLC dikelompokkan ke dalam tiga jenis detektor yaitu detektor umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanya solut. Sebaliknya, detektor spesifik memberi respon terhadap beberapa sifat solut yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, detektor yang brsifat umum terhadap solut setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan. 6. Recorder Untuk mencetak hasil percobaan pada lembaran kertas berupa kumpulan puncak (kromatogram). Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncakpuncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram. IV.



ALAT DAN BAHAN ALAT HPLC Sonicator Filter Milipore 0,45 mikrometer Corong Buchner Labu Ukur Gelas Ukur 50ml



BAHAN Aquabides Methanol Pro HPLC Baku Paracetamol (PA) Sampel paracetamol tablet



Gelas Ukur 1000ml Vial HPLC Kolom (Fase Diam) Beaker Glass Syringe Injector HPLC Pompa Vakum Pipet Volume Kertas Saring Sendok Takar Batang Pengaduk Alumunium Foil V.



PROSEDUR KERJA A. Pembuatan Fase Gerak Air : Methanol Pro HPLC (3;1) Fase Gerak Aquabidest : Methanol Pro HPLC (3:1) -



Di buat fase gerak aquabidest 750ml dan methanol 250ml



-



Di saring fase gerak dengan kertas saring



-



Di lapisi kertas whatman dengan corong Buchner dan pompa vakum



-



Disonikasi selama 10 menit.



Hasil



B. Pembuatan Larutan Baku



Paracetamol PA sebanyak 25mg - Ditimbang baku paracetamol 25mg -



Dimasukkan dalam labu ukur 100ml



-



Ditambahkan 50ml fase gerak untuk melarutkan



-



Ditambah fase gerak sampai tanda batas



-



Dihomogenkan



-



Disonikasi selama 10 menit



-



Dipipet sebanyak 1ml



-



Dimasukkan dalam labu ukur 100ml



-



Ditambah fase gerak sampai tanda batas



-



Dihomogenkan



-



Disonikasi selama 10 menit



-



Di saring larutan kedalam vial menggunakan spuit



-



Difilter milipore 0,45 mikrometer.



Hasil C. Pembuatan Larutan Uji Sampel Paracetamol 500mg sebanyak 3 tablet - Ditimbang sampel paracetamol sebanyak 3 tablet - Dicatat kekuatan sediaan dan berat tablet



- Digerus dan ditimbang sebanyak 25mg - Dimasukkan kedalam labu ukur 100ml - Ditambahkan 50ml fase gerak untuk melrutkan - Ditambah fase gerak sampai tanda batas - Dihomogenkan - Disonikasi selama 10 menit - Disaring larutan ke dalam vial menggunakan spuit - Difilter milipore 0,45 mikrometer. Hasil D. Penetapan Kadar



Penetapan Kadar Paracetamol KCKT (HPLC) - Dialirkan fase gerak dengan laju alir 1,5 ml/menit dalam fase diam -



Dilakukan sampai kurva stabil pada angka 0



-



Di injeksikan secara terpisah larutan baku paracetamol dan larutan sampel dalam HPLC



-



Di injeksikan dengan volume 10 mikroliter



-



Pemisahan kromatografi dengan HPLC panjang gelombang 243nm



-



Dihitung kadar paracetamol pada sampel dari luas area.



Hasil



VI.



HASIL DAN PEMBAHASAN Pada percobaan penentuan kadar parasetamol dalam sampel obat menggunakan kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC) ini menggunakan fasa gerak metanol dan air dengan komposisi 3;1. Fasa gerak dalam HPLC ini selain berfungsi sebagai pelarut, juga



bersifat interaktif sehingga bisa berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Fasa gerak dalam hal ini bertindak sebagai pelarut sangat mempengaruhi waktu retensi, sehingga pelarut yang digunakan harus benar-benar jernih dan murni. Oleh sebab itu, metanol dan air terlebih dahulu disaring. Dalam pembuatan larutan induk parasetamol, pembuatannya harus dilakukan dalam satu kali pengerjaan, artinya untuk membuat larutan standar parasetamol dan untuk keperluan pengenceran sampel harus menggunakan larutan induk parasetamol yang sama. Hal tersebut dilakukan untuk menjaga agar peak yang ditunjukkan kromatogram sampel memungkinkan masih berada dalam rentang konsentrasi larutan standar yang dibuat. Selain itu, baik dalam pembuatan larutan induk parasetamol, larutan standar parasetamol maupun sampel harus dihomogenkan, supaya larutan benar-benar bercampur sempurna (merata). Larutan standar dan sampel juga harus didegassing untuk menghilangkan gas-gas yang kemungkinan ada dalam larutan tersebut. Hal itu dilakukan karena gas dapat mengganggu baseline pada kromatogram, sehingga peak yang dihasilkan tidak sesuai. Hasil analisis paracetamol menggunakan KCKT yang diperoleh :



Waktu Analisis



Senyawa



Penginjeksian



Tinggi



Area



(mAU)



(mAU*Min)



0.973 1.459 1.693 2.218 3.405



1180 1505 10866 326 238



32928 20342 102853 7634 11295



1.552 3.257



11473 16594



315763 271175



Retensi (Menit)



Uji



Paracetamol



Sampel



500mg Tablet



Baku



Paracetamol (PA)



Penginjeksian 1 Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 4 Peak 5 Penginjeksian 2 Peak 1 Peak 2



Kromatogram sampel yang diperoleh dari masing – masing penginjeksian menunjukkan adanya 2 peak dan 5 peak. Hal tersebut dikarenakan kandungan dalam sampel obat tidak hanya mengandung parasetamol saja, tetapi juga mengandung bahan lain



seperti propanezon, deklorfenilamina maleat dan kafein, sehingga



peak lainnya yang



ditunjukkan dalam kromatogram adalah bahan lain yang terkandung dalam sampel obat tersebut. Peak yang dianggap sebagai peak parasetamol adalah peak yang pertama (penginjeksian pertama) dan peak yang ketiga (penginjeksian kedua) karena dilihat dari waktu retensi yang sama atau hampir sama dengan waktu retensi deret larutan standar. Untuk menentukan kadar parasetamol yang terkandung dalam sampel obat tersebut, maka dibuat terlebih dahulu kurva kalibrasi dari data deret larutan standar. Berikut kurva kalibrasi deret larutan standar yang diperoleh:



Gambar 1 : Kurva Paracetamol Sampel.



Gambar 2 : Kurva Paracetamol Baku. Hasil Perhitungan Kadar Zat Aktif



Kadar Zat Aktif = [(Au/Ab) x (Bb/Bu) x (Fu/Fb)] x % Kemurnian Baku Keterangan : Au



= Area Sampel



Ab



= Area Baku



Bb



= Bobot Baku



Bu



= Bobot Sampel



Fu



= Faktor Pengenceran Sampel



Fb



= Faktor Pengenceran Baku



% Kemurnian Baku



= 99,98%.



Kadar Zat Aktif = [(11295/271175) x (25/25) x (100/100)] x 99,98% = [(0,0416 x 1 x 1)] x 99,98% = 0,0416 x 99,98% = 4,2 % Setelah dilakukan perhitungan menggunakan, maka kadar parasetamol dalam sampel adalah 4,2% dalam 25 mg sampel obat. Pada percobaan kali ini dilakukan analisis kualitatif dan kuantitatif terhadap tablet parasetamol dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Analisis ini bertujuan untuk mengetahui mutu sediaan dari tablet parasetamol. Prinsip kerja dari KCKT adalah pemisahan suatu senyawa berdasarkan sifat kepolarannya. Sistem kromatografi yang digunakan pada percobaan ini yaitu fase balik, dimana fase diam yang digunakan bersifat non polar sedangkan fase geraknya bersifat polar. Fase diam yang digunakan adalah ODS atau Okta Desil Silica. ODS merupakan kolom berisi silika yang bersifat polar yang kemudian ditambahkan 18 atom C sehingga ODS bersifat non polar. ODS banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa dari tingkat kepolaran terendah hingga



tertinggi. ODS digunakan karena parasetamol bersifat polar sehingga senyawa parasetamol tidak akan tertahan pada fase diam tetapi ikut keluar bersama fase gerak yaitu metanol : air. Pengujian tablet parasetamol diawali dengan penginjeksian sampel uji yang telah disaring dengan membran filter PTFE, penyaringan ini dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom. Dengan bantuan pompa bertekanan tinggi, sampel masuk ke dalam kolom. Di dalam kolom, komponen-komponen sampel dipisahkan berdasarkan kepolarannya. Parasetamol yang bersifat polar akan keluar lebih dulu bersama fase gerak, dan eksipien lain yang bersifat non polar akan tertahan di dalam kolom. Pada pengujian ini detektor yang digunakan adalah detektor UV 243 nm karena parasetamol memiliki gugus kromofor yang dapat terbaca oleh detektor UV. Panjang gelombang yang digunakan 243 nm karena merupakan panjang gelombang maksimal dari parasetamol, dimana pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal dan memenuhi hukum Lambert-Beer, selain itu jika dilakukan pengulangan maka kesalahannya akan kecil. Dari hasil pengamatan, berdasarkan Farmakope Indonesia IV, kadar parasetamol dalam tablet tidak boleh < 90% dan >110%, hal ini berarti kadar parasetamol dalam tablet parasetamol tidak memenuhi syarat. Hal ini disebabkan :  Kondisi alat yang digunakan yang telah digunakan berulang kali.  Kemungkinan tablet parasetamol yang sudah kadaluarsa.  Kemungkinan penyimpanan tablet yang tidak baik sehingga, kadar parasetamol terdegradasi dan teroksidasi karena paparan cahaya.  Adanya kontaminasi selama pengerjaan. Dilihat dari kromatogram yang terbentuk, terdapat tailing factor dari setiap konsentrasi. Tailing factor ini disebabkan oleh beberapa faktor antara lain: 1) Guard column yang sudah mulai rusak. 2) Fase gerak yang sudah mulai rusak. 3) Partikel silika yang dipakai di dalam bahan pendukung bukanlah partikel silika yang baik. 4) Adanya komponen lain yang keluar tepat setelah peak. 5) Sampel bereaksi dengan gugus silanol pada partikel silika. 6) pH fase gerak yang tidak tepat.



7) Pemilihan kolom yang tidak teapat dengan senyawa yang menjadi target analisa. 8) Pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel tidak kompatibel dengan fase gerak. VII. KESIMPULAN KCKT adalah instrument untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidak murnian ( impurities) dan analisis senyawasenyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil). Dari hasil pengamatan, berdasarkan Farmakope Indonesia IV, kadar parasetamol dalam tablet tidak boleh < 90% dan >110%, hal ini berarti kadar parasetamol dalam tablet parasetamol tidak memenuhi syarat. Hal ini disebabkan : 



Kondisi alat yang digunakan yang telah digunakan berulang kali.







Kemungkinan tablet parasetamol yang sudah kadaluarsa.







Kemungkinan penyimpanan tablet yang tidak baik sehingga, kadar parasetamol terdegradasi dan teroksidasi karena paparan cahaya.







Adanya kontaminasi selama pengerjaan.



DAFTAR PUSTAKA



Harvey, David. (2000). Modern Analytical Chemistry. USA: The McGraw-Hill Companies. Hendayana, Sumar. (1994). Kmia Instrumen Edisi Kesatu. Semarang : IKIP Semarang Press.



Hendayana, Sumar. (2006). KIMIA PEMISAHAN Metode Kromatografi dan Elektroforensis Modern. Bandung : PT. Remaja Rosdakarya. Clark, Jim. (2007). “Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)”. [Online]. Tersedia: http://www.chem-istry.org yang direkam pada 6-10-2007. [16 Desember 2010]. Putra, Effendy De Lux. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Sumatera Utara : Jurusan Farmasi FMIPA USU. Suhanda, Hokcu. (2001). Handout Perkuliahan



Kimia



Analitik



Instrumen:



KCKT/HPLC. Jurusan Pendidikan Kimia UPI : tidak diterbitkan. Tim Kimia Analitik Instrumen. (2010). Penuntun Praktikum Kimia Analitik Instrumen (KI-431). Bandung : Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI.



LAMPIRAN-LAMPIRAN