Mikrobiologi Teknik Pewarnaan [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI I TEKNIK PEWARNAAN MIKROB



Disusun Oleh: Nama



: Hasriany Vellarenza



Npm



: F1D016014



Diketahui,



Praktikan



Asisten praktikum



Yuni Clara Situngkir



Hasriany Vellarenza



F1D014032



F1D016014



LABORATORIUM MIKROBIOLOGI JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS BENGKULU 2018



BAB I PENDAHULUAN



1.1 Latar Belakang Untuk mengamati bentuk atau ciri-ciri suatu mikroba menggunakan mikroskop dapat digunakan dua cara yaitu mengamati sel mikroba yang masih hidup tanpa diwarnai dan mengamati sel mikroba yang telah mati dengan diwarnai. Untuk lebih mudah dilihat sebaiknya bakteri diwarnai dengan zat warna, beberapa zat yang digunakan untuk mewarnai bakteri juga dapat digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Dengan adanya pewarnaan terutama bakteri yang mempunyai sel dengan ukuran yang retif kecil akan lebih mudah terlihat di bawah mikroskop denagn menggunakan lensa objektif minyak imersi yang mempunyai tingkat pembesaran yang relatif tinggi (Tracy, 2005). Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu bakteri yang hidup akan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Sedangkan, untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa (Sutedjo, 1991). Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008). 1.2 Tujuan Percobaan Adapun tujuan dari praktikaum Teknik Pewarnaan Mikrob ini adalah: 1) Mengetahui teknik pewarnaan sederhana, differensial dan khusus. 2) Mengetahui kegunaan teknik pewarnaan sederhana, differensial dan khusus. 3) Mengetahui morfologi dari bakteri yang telah di lakukan pewarnaan.



BAB II TINJAUAN PUSTAKA



Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih. Bakteri atau mikroba lainya dapat di lihat dengan mikroskop biasa yaitu tanpa dengan cara-cara khusus, misalnya dengan cara tetesan bergantung, menggunakan kondensor medan gelap dan lainlain. Tetapi pengamatan dari pewarnaan ini lebih sukar dan tidak di pakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti, karena sel bakteri dan mikroba lainya transparan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil untuk mengatasi hal tersebut maka di kembangkan suatu teknik pewarnaan bakteri ,sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah di amati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitianpenelitian mikrobiologi (Hadiotomo, 1990). Bakteri yang hidup tidak berwarna sehingga sulit untuk dibedakan dengan lingkungan sekelilingnya. Meskipun kontras bakteri dengan lingkungan tidak mencolok namun susunan kimiawinya sangat berbeda. Perbedaan kimiawi inilah yang menuntungkan kita, sehingga bakteri dapat diwarnai tanpa mewarnai lingkungan sekitarnya. Keuntungan melakukan pewarnaan adalah: 1) Meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnyam sehingga dapat diamati berbagai bentuk susunan bakteri. 2) Memungkinkan pengamatan salah satu bagian dari sel bakteri, misalkan spora, kapsel, atau flagela. 3) Memungkinkan penggunaan perbesaran (Lay,1992). Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Volk,1984). Pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantar sel-sel mikroba atau bagian- bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul (Karmana,2008). Salah satu pewarnaan yang sering digunakan untuk mengidentifikasi bakteri adalah pewarnaan Gram. Berdasarkan pewarrnaan Gram, bakteri dibagi menjadi dua golongan, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau kristal violet. Bakteri yang tetap berwarna ungu dengan pewarnaan oleh kristal violet disebut bakteri Gram positif,



misalnya Clostridium perfringers, Staphylococcus aureus, sedangkan bakteri yang warna ungunya hilang jika dibilas dengan alkohol, tetapi tetap berwarna merah muda karena menahan warna merah safranin disebut bakteri Gram negatif, misalnya Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan Gram misalnya Mycobacterium Sp. Karena dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga digunakan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasinya. Pada pewarnaan ini sel bakteri akan berwarna merah muda tetapi sel jaringan akan berwarna hijau (James, 2006). Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif (Karmana,2008). Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri sehingga dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna basa dan pewarna asam (Hadiotomo, 1990). Pewarnaan asam dapat terjadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cendrung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam disebut pewarna negatif. Contoh pewarna asam misalnya tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin daan lainnya. Pewarnaan basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa mmisalnya metilen biru, kristal violet, safranin dan lain-lain. Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa pewarna. Teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana diperlukan untuk mengammati morfolgi, baik bentuk maupun susunan sel (Hadiotomo, 1990). Pewarnaan bakteri dengan pewarnaan ini memilahkan bakteri menjadi Gram Positif dan Gram Negatif. Gram positif terlihat ungu, sedangkan negatif terlihat merah. Perbedaan ini disebabkan oleh: a) Daya Permeabilitas Pada bakteri Gram-positif, kompleks KV-I (Kristal Violet-Yodium) terperangkap dalam dinding sel setelah perlakuan dengan ethanol. Hal ini disebabkan pori-pori pada lapisan peptidogligan mengecil. Dinding sel bakteri Gram-Negatif mengandung lapisan peptidogligan yang lebih rendah dibandingkan bakteri Gram-positif. Pori-pori pada lapisan peptodogligan bakteri Gram-negatif setelah perlakuan dengan ethanol cukup besar, sehingga melalukan kompleks KV-I.



Jika pada bakteri gram-positif ditambahkan Lisozim, suatu enzim yang akan melisiskan (menghancurkan) dinding sel, maka akan terjadi bentuk protoplas. Pewarnaan Gram pada protoplas menyebabkan warna ungu pada tahap pertama, tetapi warna ini akan dilunturkan sewaktu penambahan larutan pemucat. Ini berarti dinding sel baktri Gram-positif merupakan lapisan yang mangikat zat warna kristal violet.Bakteri gran-positif dapat pula memberikan hasil pewrnaan Gram variabel. Biakan yang tua tidak berdaya untuk tetap mengikat kompleks KV-I, sehingga alan mengambil zat warna kedua. b) Dinding sel bakteri Gram-Negatif mengandung lipid yang tinggi, sehingga sewaktu pencucian dengan larutan pemucat menyebabkan pembesaran lubang pori-pori dan peningkatan permeabilitas zat warna. Pencucian menyebabkan kompleks zat warna terlepas, dan sel akan mengambil zat warna kedua. c) Dinding sel bakteri Gram-positif mengandung lipid yang rendah, sehingga sewaktu penambahan alkohol terjadi dehidrasi dan pengecilan lubang pori-pori. Ini menyababkan zat warna tetap terikat dan sel tetap ungu. d) Struktur dinding sel Bakteri Gram- negatif berdinding tipis, sedangkan bakteri Gram-Positif berdinding tebal. e) Pada bakteri Gram-positif ditemukan senyawa Mg-ribonukleat yang akan bereaksi dengan kristal-violet dan menyebabkan tidak mudah dilarutkan oleh larutan pemucat. Ribonukleat ini tidak ditemukan pada Gram-negatif (Lay,1992). Bakteri atau mikroba lainya dapat di lihat dengan mikroskop biasa yaitu tanpa dengan cara-cara khusus, misalnya dengan cara tetesan bergantung, menggunakan kondensor medan gelap dan lainlain. Tetapi pengamatan dari pewarnaan ini lebih sukar dan tidak di pakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti, karena sel bakteri dan mikroba lainya transparan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil untuk mengatasi hal tersebut maka di kembangkan suatu teknik pewarnaan bakteri ,sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah di amati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro, 2005).



BAB III METODOLOGI PENELITIAN



3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada hari Senin dan Rabu tanggal 5 Maret 2018, di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Bengkulu. 3.2 Alat Alat yang digunakan untuk percobaan kali ini adalah kaca objek, kaca penutup, mikroskop, pipet tetes, lampu spritus, bak pewarna, jarum ose, dan pensil lilin. 3.2 Bahan Bahan yang digunakan untuk percobaan ini yaitu tisu gulung, suspensi mikrob, 25 ml larutan biru metil atau karbol fuksin, alkohol 70%, 10 ml iodium, 10 ml safranin, 10 ml ungu kristal, 100 ml minyak imersi, biakan bakteri, 1 biakan Bacillus, 200 ml air suling, dan larutan hijau malakit.



3.3 Prosedur Kerja a) Pewarnaan Sederhana Pertama objek difiksasi terlebih dahulu. Kemudian olesan suspensi mikrob yang tersedia di kaca objek dibuat.xat wrna biru metil/ karbol fuksin diambil dan ditetesi sebanyak 1 tetes ke olesan suspensi mikrob selama 1-2 menit. Kemudian kaca objek dimiringkan dan dibilas olesan mikrob dengan air. Apabila terdapat kelebihan zat warna pada kaca preparat perlu diserap dengan kertas tisu. Terakhir dilihat bentuk dan warna mikrob dengan mikroskop. b) Pewrnaan Gram Olesan suspensi mikrob yang akan diamati terlebih dahulu disiapkan. Dengan pipet tetes, diberikan 1 tetes pewrna ungu kristal pada suspensi mikrob dan dibiarkan selama 1 menit. Dibilas dengan air selama 10 detik, kemudian diberikan 1 tetes iodium dan dibiarkan selama 2 menit, barulah bilas dengan air selama 10 detik. Selanjutnya dilakukan pemucatan dengan alkohol 96% selama 1 menit, dibilas dengan air selama 10 detik. Selanjutnya diberi 1 tetes pewarna safranin dan dibiarkan selama 30 detik. Dibilas lagi dengan air selama 10 detik, kelebihan warna diserap dengan tisu. Diamati bentuk dan warna mikrob dibawah mikroskop. c) Pewarnaan Spora Disiapkan olesan bakteri dengan fiksasi panas. Disepanjang kaca objek dibuat garis dengan pensil guna menahan agar zat warna tidak meluap keluar. Kemudian kaca objek diletakkan pada cincin besi dan letakkan kira-kira 25 cm dari meja serta letakkan kertas dibawanya untuk melindungi meja dari pewarna yang tercecer. Selanjutnya diberikan 1 tetes hijau malakit dengan pipet tetes ke atas olesan bakteri, selama 10 menit sembari dipanaskan langsung di atas lampu spritus sampai beruap (jangan sampai mendidih dan



mengering, untuk mengatasi dapat ditambahkan pewarna). Kaca objek dibiarkan dingin, kelebihan pewarna dicuci dengan air, diberi 1 tetes pewarna safranin dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dibilas dengan air, kelebihan zat warna diserap menggunakan tisu. Terakhir bentuk dan warna sel bakteri diamati dibawah mikroskop. .



BAB VI HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Dari praktikum pewarnaan mikrob didapati hasil kelas sebagai berikut : Tabel 1. Bentuk dan penataan bakteri yang dapat NO Bakteri Bentuk Penataan Bakteri Sp 1 Basil Streptobasil 1. Sp 2 Basil Streptobasil 2. Sp 3 Cocobasil Streptococus, Diplococus 3. Sp 4 Cocus Monococus, Diplococus 4. Sp 5 Cocus Diplococus, Streptococus, 5. Staphylococus. Sp 6 Cocus Mikrococus 6.



(a)



(b)



(c)



Gambar 1. Bakteri hasil pengamatan setelah dilakukan pewarnaan sederhana (a), pewarnaan Gram (b) dan pewarnaan Spora(c). 4.2 Pembahasan Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985): 1. Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi. 2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad 3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad. 4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui. Didapatinya berbagai macam bentuk dan penataan bakteri yang berbeda merupakan hasil dari lokasi yang berbeda dalam pengisolasian bakteri-bateri tersebut. Praktikum ini dilakukan dengan 3 cara pewarnaan yakni pewarnaan sederhana, pewarnaan Gram, dan pewarnaan Sprora. Pada pengamatan Kelompok 5(Sp 5) pewarnaan sederhana



menggunakan zat warna MB (Methylen Blue) kemudian di dapatkan hasil berupa bakteri berbentuk Cocus berwarna biru dengan penataan yang beragam mulai dari diplococus hingga streptococus. Kemudian begitupula pada pewarnaan gram dan spora. Pada Pewarnaan garam merupakan suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Pada saat praktikum pewarnaan gram, larutan yang digunakan yaitu larutan Kristal violet, larutan safranin, larutan lugol, dan larutan peluntur. Bakteri yang dipakai saat pewarnaan yaitu bacteri yang telah di lakukan enumirasi pada praktikum sebelumnya. Hasil pewarnaan Gram pada satu jenis bakteri dapat menunjukkan Gram variabel, yaitu dapat bersifat gram positif maupun gram negatif. Hal tersebut diakibatkan oleh perbedaan umur koloni bakteri tersebut pada saat pewarnaan Gram dilakukan. Koloni berumur tua akan menunjukkan Gram negatif, sebaliknya jika berumur muda akan menunjukkan Gram positif (Nugroho, 2006, p. 88). Namun pada pewarnaan spora bakteri yang seharusnya didapat bukanlah berbentuk cocus melainkan yang berbentuk basil. Bakteri cocus tidak menghasilkan Spora. Menurut Dwidjoseputro (2005), beberapa spesies bakteri dapat kehilangan kemampuannya untuk membentuk spora. Spora dapat tumbuh lagi menjadi bakteri biasa apabila keaadaan di luar menguntungkan. Mula-mula air meresap ke dalam spora, kemudian spora mengembang dan kulit spora menjadi retak karenanya. Keretakan ini dapat terjadi pada salah satu ujung, tetapi juga dapat terjadi pada tengah-tengah atau dekat tengah-tengah spora. Hal ini merupakan ciri khas bagi beberapa spesies Bacillus. Jika kulit spora pecah di tengah-tengah, maka masing-masing pecahan akan merupakan suatu tutup pada kedua ujung bakteri.



DAFTAR PUSTAKA Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar Dasar Mikrobiologi. Malang: Penerbit Djambatan. Hadiotomo, Ratna Siri., 1990, Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : PT Gramedia. James, Joyce., Colin Baker, Helen Swain.2006. Prinsip-prinsip Sains Untuk Keperawatan diterjemahkan oleh dr. Indah Retno Wardhani. Jakarta : PT Gramedia Karmana, Oman. 2008. Biologi. PT Grafindo Media Pratama: Jakarta Nugroho, Astri. (2006). Biodegradasi Sludge Minyak Bumi dalam Skala Mikrokosmos: Simulasi Sederhana Sebagai Kajian Awal Bioremediasi Land Treatment. Jurnal Makara Teknologi, 10(2):82-89. Suriawiria, U., 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia. Jakarta. Sutedjo, M., 1991, Mikrobiologi Tanah, Rineka Cipta. Jakarta Tracy.2005.GramStaining. www.tracy.k12.ca.us/ thsadvbio/ pdfs/ gram%20stain.pdf, Diakses pada tanggal 4 Maret 2018. Umsl. 2008.StainingBacteria. www.umsl.edu /~microbes/pdf/ stainingbacteria.pdf. Diakses pada tanggal 4 Maret 2018. Volk & Wheeler. 1984. Mikrobiologi Dasar Edisi Kelima Jilid I. Jakarta : Erlangga