![Petunjuk Praktikum Mikrobiologi 2020-2021 [PDF]](https://pdfs.asia/img/200x200/petunjuk-praktikum-mikrobiologi-2020-2021.jpg)
12 0 2 MB
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Laboratorium Mikrobiologi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta
MODUL PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI FARMASI Ratna Yuliani, M.Biotech.St Maryati, Ph.D., Apt Peni Indrayudha, Ph.D., Apt Rima Munawaroh, M.Sc., Apt Agus Purnomohadi, M.Biotech.
2021
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Gambar sampul diperoleh dari: https://www.microbiologyinpictures.com/staphylococcus%20aureus.html https://www.microbiologyinpictures.com/bacterial%20colonies.html
MODUL PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI FARMASI Ratna Yuliani, M.Biotech.St Maryati, Ph.D., Apt Peni Indrayudha, Ph.D., Apt Rima Munawaroh, M.Sc., Apt Agus Purnomohadi, M.Biotech.
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA 2021 i
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
KATA PENGANTAR Syukur alhamdulillah kepada Allah SWT akhirnya modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi ini dapat tersusun dengan baik. Modul ini merupakan pedoman bagi mahasiswa semester III Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta dalam melaksanakan praktikum. Praktikum Mikrobiologi Farmasi merupakan bagian dari mata kuliah Mikrobiologi Farmasi yang diselenggarakan agar mahasiswa lebih memahami dan mampu melakukan beberapa uji yang berkaitan dengan mikrobiologi farmasi. Capaian pembelajaran praktikum ini adalah mahasiswa mampu menganalisis hasil uji aktivitas antibakteri dan uji air minum, menentukan fase-fase pertumbuhan bakteri, menganalisis hasil skrining primer untuk memperoleh mikroorganisme penghasil antibiotik, dan menentukan kelayakan sediaan herbal untuk dikonsumsi. Semoga modul praktikum ini dapat berguna bagi perkembangan pengetahuan mahasiswa dalam menekuni ilmu farmasi. Akhinya guna penyempurnaan buku ini, kami secara terbuka menerima saran dan kritik. Semoga buku ini bermanfaat.
Surakarta, Agustus 2021 Penyusun
ii
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
TATA TERTIB PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI
1.
2. 3.
4.
5.
Praktikan harus datang 5 menit sebelum praktikum dimulai, terlambat lebih dari 10 menit dengan alasan apapun tidak diijinkan mengikuti praktikum dan harus mengganti pada hari lain. Praktikan masuk ruangan praktikum tanpa menunggu perintah dari asisten maupun dosen. Sebelum praktikum dimulai, praktikan diwajibkan: a. Mempersiapkan dasar teori, alat dan bahan yang akan dipraktikumkan (ditulis dalam laporan sementara). b. Mengikuti pretest tiap satuan acara praktikum. Tidak ada pretest ulang bagi mahasiswa yang bernilai rendah. c. Mengumpulkan laporan resmi praktikum sebelumnya. Selama praktikum: a. Praktikan dilarang berpakaian yang melanggar batas kesopanan dan kesusilaan. Praktikan tidak diperkenankan berpakaian ketat, mengenakan kaos tanpa krah, bersandal (termasuk selop). Sanksi pelanggaran tata tertib ini berupa skorsing dikeluarkan ruang praktikum. b. Setiap praktikan wajib membawa masker, lap bersih, dan sarung tangan karet. Setelah selesai praktikum: a. Hasil praktikum harus disahkan oleh asisten atau dosen jaga sambil menunjukkan hasil percobaan. b. Meja dan kursi lab harus dirapikan dan dibersihkan. Reagen dan peralatan serta bahan yang diambil harus dikembalikan ke tempat semula dalam keadaan rapi.
3
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
c. Praktikan yang merusakkan atau memecahkan alat praktikum wajib mengganti dengan alat yang spesifikasinya sama sebelum praktikum berikutnya. 6. Jika praktikan tidak hadir lebih dari 25% dari acara praktikum saja atau dari keseluruhan praktikum, maka praktikan tersebut dinyatakan tidak lulus praktikum Mikrobiologi Farmasi dan harus mengulang pada tahun berikutnya. 7. Ijin ketidakhadiran hanya berlaku jika sakit (disertai surat keterangan dari dokter), keluarga dekat (bapak, ibu, adik, atau kakak) ada yang meninggal, dan sebab keadaan darurat yang berkaitan dengan jiwa dan praktikan harus mengganti praktikum pada hari lain. 8. Penggantian hari karena alasan terlambat atau ijin dilaksanakan dengan mekanisme memo sesuai dengan peraturan yang berlaku di Laboratorium Biologi Farmasi. 9. Praktikan harus aktif dan berinisiatif sendiri mencari pengumuman yang berkaitan dengan praktikum Mikrobiologi Farmasi (jadwal, pembagian kelompok, korektor, dll). Kesalahan menerima informasi menjadi tanggung jawab mahasiswa. 10. Kesalahan penulisan pada laporan tidak boleh dihapus/di-tip-ex tetapi dicoret lalu revisi dituliskan dan diberi paraf yang dicoret.
4
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL .................................................................................. i KATA PENGANTAR ................................................................................ ii TATA TERTIB PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI......................... iii DAFTAR ISI............................................................................................. v MODUL 1. STERILISASI.......................................................................... 1 MODUL 2. STREAKING MICROBIAL CULTURES ON AGAR PLATES .. 10 MODUL 3. IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA MIKROSKOPIK ................. 14 MODUL 4. IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA MAKROSKOPIK ................ 26 MODUL 5. IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA BIOKIMIAWI ................... 36 MODUL 6. SKRINING PRIMER UNTUK MEMPEROLEH MIKROBA PENGHASIL ANTIBIOTIK ..................................................... 45 MODUL 7. UJI SENSITIVITAS BAKTERI TERHADAP ANTIBIOTIK .......... 49 MODUL 8. PEMERIKSAAN POTENSI ANTIBIOTIK ................................. 54 MODUL 9. PENETAPAN ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) EKSTRAK.. 59 MODUL 10. PEMERIKSAAN AIR MINUM SECARA BAKTERIOLOGIK
62
MODUL 11. UJI ANTIBAKTERI DENGAN METODE DIFUSI SUMURAN DAN BIOAUTOGRAFI ..................................... 71 MODUL 12. KINETIKA PERTUMBUHAN ............................................... 76 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 84
5
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
MODUL 1 STERILISASI I.
II.
CAPAIAN PEMBELAJARAN Mahasiswa diharapkan mampu memahami metode sterilisasi dan melakukan sterilisasi terhadap alat-alat dan bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum. DASAR TEORI Hampir semua tindakan yang dilakukan dalam diagnosis mikrobiologi, sterilisasi sangat diutamakan baik alat-alat yang dipakai maupun medianya. Bila pada penanaman spesimen dalam media, petri, ose, maupun media yang digunakan tidak steril, maka sangat tidak mungkin untuk membedakan apakah kuman yang berhasil diisolasi tersebut berasal dari penderita atau merupakan hasil kontaminasi dari alat-alat atau media yang digunakan. Suatu alat atau bahan dikatakan steril bila alat/bahan tersebut bebas dari mikroba baik dalam bentuk vegetatif maupun spora. Tindakan untuk membebaskan alat atau media dari jasad renik disebut STERILISASI. Ada beberapa cara sterilisasi, dan pemilihannya tergantung dari bahan atau alat yang akan disterilkan. Secara garis besar sterilisasi ada beberapa cara, yaitu: A. Pemanasan; tujuannya adalah merusak atau membunuh mikroba. 1. Pemanasan kering, yaitu dengan cara membakar atau menggunakan udara panas (oven). 2. Pemanasan basah, dapat dikerjakan dengan merebus, uap air panas, uap air panas dengan tekanan, dan pasteurisasi. B. Filtrasi; tujuannya untuk membebaskan media yang tidak tahan pemanasan dari mikroba. C. Penyinaran dengan menggunakan sinar gelombang pendek (radiasi). D. Sterilisasi Kimia A. Pemanasan Ada beberapa metode sterilisasi menggunakan panas yang dapat digunakan dalam mikrobiologi (Tabel 1).
1
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
1. Pemanasan Kering a. Pembakaran Cara ini dapat digunakan untuk sterilisasi alat-alat yang berupa: ▪ Logam : ose, pinset dan lain-lain. ▪ Gelas : ujung pipet, bibir tabung, mulut erlemeyer dan lain-lain pada penuangan media. Alat yang digunakan adalah: lampu spiritus / bunsen. Sterilisasi ose dapat dilakukan dengan membakar ose tersebut pada nyala api lampu spiritus atau bunsen dengan cara: pemanasan dimulai dari pangkal kawat dan setelah terlihat merah berpijar pemanasan dilanjutkan sampai ke ujung ose dengan menggeser perlahan-lahan. Hal ini dilakukan untuk menghindari terlontarnya sisa mikroba pada mata ose akibat pemanasan langsung dan terlalu cepat. b. Pemanasan dengan menggunakan udara panas. Metode pemanasan dengan udara panas digunakan untuk mensterilkan alat-alat gelas, termasuk: petri, tabung reaksi, botol dan pipet. Selain itu juga dapat untuk sterilisasi bahan: minyak, serbuk (misalnya: talk). Pada umumnya sterilisasi alat-alat tersebut dikerjakan dengan pemanasan 175oC selama 90 – 120 menit. 2. Pemanasan Basah a. Dengan cara merebus Pemanasan basah digunakan untuk mensterilkan alat-alat berupa: gunting, pinset, skalpel. Sterilisasi dilakukan dengan cara mendidihkan alat selama 30 – 60 menit. b. Dengan uap air panas Metode ini digunakan terutama untuk mensterilkan media yang dapat rusak bila disterilkan dengan uap air panas bertekanan (menggunakan autoklaf). Sterilisasi ini dikerjakan dengan pemanasan 100o C selama 60 menit. Pada cara sterilisasi ini spora tidak mati. Untuk media yang tidak tahan panas (Loewenstein, urea broth) dikerjakan dengan sterilisasi bertingkat atau filtrasi. Alat yang digunakan adalah autoklaf dengan tekanan di dalamnya tetap 1 atmosfir (klep pengatur tekanan tetap terbuka).
2
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
c. Dengan uap air bertekanan (autoklaf) Metode ini digunakan untuk sterilisasi media yang tahan terhadap pemanasan tinggi. Sterilisasi dikerjakan dengan autoklaf pada suhu 120C selama 10–20 menit. Hal-hal yang perlu diperhatikan pada penggunaan autoklaf adalah: ▪ Harus ditunggu selama bekerja ▪ Hati-hati bila mengurangi tekanan dalam autoklaf. Sterilisasi basah lebih cepat bila dibandingkan dengan sterilisasi kering karena pada sterilisasi basah terjadi proses koagulasi protein, sedangkan pada sterilisasi kering terjadi oksidasi protein. d. Pasteurisasi Pasterisasi digunakan untuk mensterilkan susu, yaitu dengan pemanasan pada suhu 61,7o C selama 30 menit. B. Filtrasi Cara sterilisasi ini dipakai untuk sterilisasi media yang tidak tahan pemanasan, misalnya urea broth, juga untuk sterilisasi vaksin, enzim, vitamin dan antibiotika. Kelemahan cara ini adalah: hasil filtrasi tidak bebas dari virus. C. Penyinaran (Radiasi) Jenis radiasi yang dapat digunakan untuk sterilisasi misalnya: sinar ultra violet (UV), sinar gamma, sinar X dan sinar katoda (elektron berkecepatan tinggi). Sinar UV mempunyai panjang gelombang 15–390 nm, dan yang paling tinggi daya bakterisidnya adalah UV dengan panjang gelombang 265 nm. Sinar UV dapat digunakan untuk sterilisasi ruang (kamar operasi, ruang aseptis), barang dari plastik. Sinar X mempunyai daya penetrasi lebih besar dibandingkan sinar UV. Sinar gamma mempunyai daya penetrasi lebih kuat dibanding sinar X dan digunakan untuk sterilisasi barang-barang yang tebal, misalnya alat-alat kedokteran yang terbungkus atau kemasan makanan. Sinar katoda juga digunakan untuk sterilisasi barang-barang yang sudah terbungkus.
3
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
D. Sterilisasi Kimia. Antiseptik (Tabel 2) adalah bahan/zat yang dapat mencegah pertumbuhan dan aktivitas mikroba dan biasanya digunakan untuk tubuh (yang berhubungan dengan jaringan hidup). Prosesnya disebut antiseptis. Desinfektan (Tabel 3) adalah bahan kimia yang dapat membunuh sel vegetatif mikroba pada obyek yang tidak hidup, karena dapat merusak jaringan. Prosesnya disebut desinfeksi. Biosidal adalah suatu zat yang aksinya dipakai untuk membunuh mikroorganisme, misal: bakterisid, virosid, sporosid. Biostatik adalah zat yang aksinya untuk mencegah/menghambat pertumbuhan organisme, misal: bakteriostatik, fungistatik. Tabel 1. Common Uses of Heat to Control Bacteria Treatment
Temperature
Effectiveness
Incineration
>500C
Vaporizes organic material on nonflammable surfaces but may destroy many substances in the process.
Boiling
100C
Thirty minutes of boiling kills vegetative forms of bacteria but may not kill bacterial endospores. There are also toxins that are not inactivated at 100C.
Intermittent boiling
100C
Three 30-minute intervals of boiling, followed by periods of cooling kills bacterial endospores.
Autoclave and pressure cooker (steam under pressure)
121C for 15 Kills all forms of life including minutes at 15 bacterial endospores. The substance being sterilized must p.s.i. be maintained at the effective temperature for the entire time.
Dry heat (hot air oven)
160C for 2 hours
Used for materials that must remain dry. Good for glassware, 4
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
metal, but not most plastic or rubber items. Dry heat (hot air oven)
170C for 1 hour
Same as above. Note that increasing the temperature by 10 C shortens the sterilizing time by 50 %.
Pasteurization (batch method)
63-66C for 30 minutes
Kills most vegetative bacterial cells, including pathogens such as streptococci, staphylococci and Mycobacterium tuberculosis.
Pasteurization (flash method)
72C for 15 seconds
Effect on bacterial cells is similar to batch method. For milk, this method has fewer undesirable effects on quality or taste.
Table 2. Antiseptics and their actions Chemical
Action
Uses
Ethanol (50-70%)
Denatures proteins and solubilizes lipids
Antiseptic used on skin
Isopropanol (5070%)
Denatures proteins and solubilizes lipids
Antiseptic used on skin
Tincture of iodine Inactivates proteins (2% I in 70% alcohol)
Antiseptic used on skin
Silver nitrate (AgNO3)
General antiseptic and formally used in the eyes of newborns. Erythromycin drops (an
Precipitates proteins
5
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
antibiotic) are now used Detergents (e.g. quaternary ammonium compounds)
Disrupts cell membranes
Skin antiseptics
Phenolic compounds (e.g. carboloic acid, lysol, hexylresorcinol, hexachlorophene)
Denature proteins and disrupt cell membranes
Antiseptics at low concentrations
Beberapa bahan kimia yang bersifat antimikroba adalah : 1. Fenol dan derivatnya. Fenol dan derivatnya bekerja dengan cara mempresipitasikan protein secara aktif atau merusak selaput sel dengan penurunan tegangan permukaan. Cepat bekerja sebagai desinfektan atau antiseptik, tergantung pada konsentrasinya. Daya antimikroba fenol akan berkurang pada suasana alkalis, suhu rendah, dan adanya sabun. 2. Alkohol. Etanol 50 – 70 % mempunyai daya bakterisid untuk bentuk vegetatif, sedangkan metanol daya bakterisidnya lebih rendah dibanding etanol dan bersifat toksik terhadap mata. Alkohol beraksi dengan mendenaturasi protein dengan jalan dehidrasi dan melarutkan lemak sehingga membran sel rusak dan enzim-enzim akan diinaktifkan oleh alkohol. 3. Halogen beserta gugusannya, misalnya: ▪ Iodin dipakai sebagai antiseptik pada kulit sebelum pembedahan. ▪ Hipoklorit (dalam bentuk garam Na/Ca) digunakan untuk sanitasi alat-alat rumah tangga, yang umum dipakai adalah kalsium hipoklorit dan sodium hipoklorit. Halogen beserta gugusannya ini mematikan mikroorganisme dengan cara mengoksidasi protein sehingga merusak membran dan menginaktifkan enzim-enzim. 6
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
4. Logam berat dan gugusannya Logam berat dapat mempresipitasikan enzim-enzim atau protein esensial lain dalam sel sehingga dapat berfungsi sebagai antimikroba. Contohnya : Merkurokrom, metiolat sebagai antiseptik. Perak nitrat digunakan sebagai tetes mata untuk mencegah infeksi mata karena gonococcus pada bayi baru lahir. 5. Detergen Detergen dengan gugus lipofilik dan hidrofilik akan merusak membran sitoplasma. 6. Golongan aldehid Aldehid mendesinfeksi dengan cara mendenaturasi protein, misalnya formalin. 7. Senyawa kimia berupa gas (etilen oksid) atau gas sterilisator Sterilisasi gas digunakan untuk bahan atau alat yang tidak dapat disterilkan dengan pemanasan tinggi atau dengan zat kimia cair dan dilakukan pada suhu kamar. Etilen oksida mempunyai daya penetrasi dan sterilisasi yang besar, tetapi kelemahannya adalah bersifat toksik dan mudah meledak. Table 3. Disinfectants and their action Chemical
Action
Uses
Formaldehyde (8%)
Reacts with NH2, SH and COOH groups
Disinfectant, kills endospores
Chlorine (Cl2) gas
Forms hypochlorous acid (HClO), a strong oxidizing agent
Disinfect drinking water; general disinfectant
Mercuric chloride
Inactivates proteins by reacting with sulfide groups
Disinfectant, although occasionally used as an antiseptic on skin
7
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
III.
Detergents (e.g. quaternary ammonium compounds)
Disrupts cell membranes
At higher concentrations and with some compounds is a disinfectant
Phenolic compounds (e.g. carbolic acid, lysol, hexylresorcinol, hexachlorophene)
Denature proteins and disrupt cell membranes
Disinfectants at high concentrations
Ethylene oxide gas
Alkylating agent
Disinfectant used to sterilize heatsensitive objects such as rubber and plastics
ALAT DAN BAHAN a. Alat 1. Cawan Petri 2. Tabung reaksi 3. Oven 4. Autoklaf
b. 1. 2. 3. IV.
Bahan Kapas Aluminium foil Media MacConkey
CARA KERJA 1. Cawan Petri dibungkus dengan kertas lalu disterilkan menggunakan oven selama 1 jam pada suhu 170C. 2. Beberapa tabung reaksi disumbat dengan kapas lalu dibungkus dengan kertas selanjutnya disterilkan menggunakan oven (Gambar 1) selama 1 jam pada suhu 170C. 8
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
3. Media MacConkey ditimbang lalu dimasukkan ke dalam labu Erlemeyer. Media dilarutkan dalam akuades dengan bantuan pemanasan. Labu Erlenmeyer ditutup aluminium foil lalu media disterilkan menggunakan autoklaf selama 20 menit pada suhu 121C.
Oven
Autoklaf Gambar 1. Alat-alat sterilisasi
9
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
MODUL 2 STREAKING MICROBIAL CULTURES ON AGAR PLATES (Thiel, 1999) I.
CAPAIAN PEMBELAJARAN Mahasiswa mampu melakukan streak plate untuk mendapatkan koloni bakteri tunggal.
II.
DASAR TEORI Agar sreak plates are an essential tool in microbiology. They allow bacteria and fungi to grow on a semi-solid surface to produce discrete colonies. These colonies can be used to help identify the organism, purify the strain free of contaminants, and produce a pure genetic clone. In order to obtain well-isolated discrete colonies, the quadrant streak technique should be used. This allows sequential dilution of the original microbial material (broth culture or colonies on a plate or slant) over the entire surface of a fresh plate. As the original sample is diluted by streaking it over successive quadrants, the number of organisms decreases. Usually by the third or fourth quadrant only a few organisms are transferred on the inoculating loop and these produce a few isolated colonies. The quadrant streak technique is described below. Study the diagram and read the “Tips” below the diagram (Gambar 2) before you begin the streak plate. 1. Flame the inoculating loop until it is red hot and then allow it to cool. 2. Remove a small amount of bacterial growth (either a loopful from a broth culture or a single colony from a plate or slant) with the sterile inoculating loop. 3. Immediately streak the inoculating loop very gently over a quarter of the plate using a back and forth motion (see area 1 in the figure below). 4. Flame the loop again and allow it to cool. Going back to the edge of area 1 that you just streaked, extend the streaks into the second quarter of the plate (area 2).
10
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
5. Flame the loop again and allow it to cool. Going back to the edge of area that you just streaked (area 2), extend the streaks into the third quarter of the plate (area 3). 6. Flame the loop again and allow it to cool. Going back to the edge of area that you just streaked (area 3), extend the streaks into the center fourth of the plate (area 4) by making a series of zig-zag lines away from the edge of area 3 into area 4. Quadrant Streak
Gambar 2. Pola goresan metode streak plate Inoculation of a streak plate: Area 1: Area of initial inoculation and first streaks yields heavy growth. Area 2: Area of second streaks from area 1 yields less dense growth. Area 3: Area of third streaks from area 2 yields weak growth. Area 4: Area of fourth streaks from area 3 yields single colonies. Tips: ▪ Use the entire surface of the plate, not just the middle of the plate. ▪ Streak only one loopful of a broth culture. ▪ Remove only one colony or a barely visible number of cells from a plate or slant. ▪ Flame the loop after you streak each quadrant. ▪ Streak lightly so that you do not gouge the agar. ▪ Cool the loop after flaming by gently touching the edge of the agar where you have not streaked. 11
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
▪
III.
Examine the plate carefully after colonies have grown. All colonies should have the same general appearance. If there is more than one type of colony, each type should be streaked again on a separate plate. You will have to determine which colony is the strain of interest. ALAT DAN BAHAN a. Alat 1. Jarum ose bulat 2. Lampu spiritus b. 1. 2. 3.
IV.
Bahan Kultur bakteri Media MacConkey padat Etanol 70%
CARA KERJA 17. Semprot area kerja dengan etanol 70% lalu lap sampai kering. 18. Panaskan pinggiran cawan Petri menggunakan api dari lampu spiritus. 19. Panaskan jarum ose bulat dari pangkal ke ujung sampai panas dan merah lalu dinginkan. 20. Ambil 1 ose kultur bakteri, buka tutup cawan Petri sehingga sedikit terbuka lalu goreskan ose pada media MacConkey (disebut goresan 1). Lihat Gambar 3! 21. Panaskan jarum ose bulat dari pangkal ke ujung sampai panas dan merah lalu dinginkan. 22. Goreskan jarum ose dengan menyentuh goresan 1 (disebut goresan 2). 23. Panaskan jarum ose bulat dari pangkal ke ujung sampai panas dan merah lalu dinginkan. 24. Goreskan jarum ose dengan menyentuh goresan 2 (disebut goresan 3). 25. Panaskan jarum ose bulat dari pangkal ke ujung sampai panas dan merah lalu dinginkan. 26. Goreskan jarum ose dengan menyentuh goresan 3 (disebut goresan 4). 12
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
27. Panaskan pinggiran cawan Petri menggunakan api dari lampu spiritus 28. Beri label nama spesies bakteri, kelas, kelompok, dan tanggal praktikum. 29. Inkubasi media MacConkey yang telah ditanami bakteri selama 24 jam pada suhu 37C pada posisi terbalik (tutup cawan berada di bagian bawah). 30. Amati warna, bentuk, dan sifat koloni bakteri yang tumbuh.
Gambar 3. Cara menggores bakteri dengan metode streak plate (Cappucino dan Welsh, 2017)
13
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
MODUL 3 IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA MIKROSKOPIK I.
CAPAIAN PEMBELAJARAN 1. Mahasiswa mampu mengidentifikasi bakteri berdasarkan hasil pengamatan mikroskopik. 2. Mahasiswa mampu melakukan pengecatan bakteri dengan cat Gram dan menentukan golongan bakteri serta karakteristiknya berdasarkan hasil pengecatan.
II.
DASAR TEORI Pemeriksaan mikroskopik terhadap bakteri dapat dilakukan dalam keadaan hidup maupun mati. Pemeriksaan bakteri dalam keadaan hidup dapat dikerjakan dengan membuat preparat tetesan gantung atau dengan melihat bakteri dalam mikroskop medan gelap. Dalam keadaan mati, bakteri dapat dibuat preparat dan dicat. A. PEMBUATAN PREPARAT Untuk mendapatkan hasil pemeriksaan mikroskopik yang baik, diperlukan : ▪ Preparat yang dapat dilihat dengan baik yaitu, tidak terlalu tebal dan tidak terlalu tipis. ▪ Pengecatan preparat yang baik. Pembuatan preparat dari bahan berasal langsung dari penderita. Bahan dapat berupa sputum, pus, discharge telinga, discharge hidung, urin (perlu disentrifuge terlebih dahulu, endapannya dibuat preparat). Cara: Bahan diambil dengan ose steril atau kapas lidi steril dan digoreskan pada gelas obyek ssetipis mungkin. Gelas obyek dipanaskan di atas nyala api spiritus sambil digoncangkan (jarak preparat sampai api spiritus, kira-kira 20 cm) sampai preparat tersebut kering. Setelah kering tetesi formalin 1%, tunggu 5 menit dan dikeringkan sekali lagi dan preparat siap dicat.
14
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Pembuatan preparat dari biakan cair Cara : ▪ Gelas objek yang bersih dan steril dibebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Kuman diambil dari cat sekunder/tanaman cair (yang sebelumnya telah diaduk secara steril) dengan menggunakan ose steril, diratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter kira-kira 1-2 cm. Ose yang sudah dipakai untuk mengambil kuman harus disterilkan kembali dengan membakar ose di atas nyala api spiritus. Jika akan dipakai lagi, harus disterilkan dengan cara yang sama. ▪ Preparat yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan preparat langsung. Perhatian : - Jangan memegang mata ose dengan menggunakan tangan. - Jangan meletakkan ose di atas meja, letakkan ose pada tempat yang telah disediakan. - Jangan lupa mensterilkan ose pada saat akan dipakai dan sesudah pemakaian. Pembuatan preparat dari pertumbuhan media padat. Cara : ▪ Satu ose kaldu diteteskan pada gelas obyek yang telah dibersihkan dan dibebaskan dari lemak. Satu koloni kuman diambil dengan ose steril, dicampur dengan kaldu tersebut, dihomogenkan, dan ditipiskan. Preparat kemudian dikeringkan di atas nyala api spiritus dan selanjutnya dikerjakan seperti membuat preparat dengan bahan berasal dari material langsung. B. PENGECATAN Pada umumnya pemeriksaan langsung kurang memberikan hasil yang memuaskan karena kontras antara sel bakteri dengan latar belakangnya kurang jelas. Untuk meningkatkan kontras biasanya dilakukan pengecatan.
15
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
1. a.
b.
Jenis-jenis cat Mordan Mordan adalah bahan kimia atau proses fisik yang memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Contoh : kompleks yodin yang digunakan untuk pengecatan Gram. Cat sekunder atau kontras Sebagian besar sistem pengecatan menggunakan cat sekunder atau kontras untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dengan cat primer. Contoh : safranin pada pengecatan Gram memberikan warna merah.
Pengecatan Gram Metode pengecatan ini ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dari sifat bakteri terhadap cat Gram, bakteri dapat digolongkan menjadi Gram positif dan Gram negatif. Komposisi cat Gram dapat dilihat pada Tabel 4. Bakteri gram positif adalah bakteri yang pada pengecatan Gram tahan terhadap alkohol sehingga tetap mengikat cat pertama dan tidak mengikat cat kontras sehingga bakteri akan berwarna ungu. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang pada pengecatan Gram tidak tahan alkohol sehingga warna cat yang pertama dilunturkan dan bakteri akan mengikat warna kontras sehingga tampak merah. Ada beberapa teori tentang dasar perbedaan kedua golongan tersebut: 1.Teori Salton Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20 %) di dalam dinding sel bakteri Gram negatif. Zat lipid ini larut selama pencucian dengan alkohol. Pori-pori pada dinding sel membesar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna. Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya oleh pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil sehingga komplek ungu kristal yodium dipertahankan dan bakteri tetap berwarna ungu.
16
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
2. Teori Permeabilitas Dinding Sel Teori ini berdasarkan tebal-tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding sel. Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel kurang dan komplek ungu kristal yodium tidak dapat keluar. Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1-2 lapisan dan susunan dinding sel tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks ungu kristal yodium. Cat Gram A (warna ungu)
Cat Gram B (warna coklat) Cat Gram C (tak berwarna) Cat Gram D (warna merah)
Tabel 4. Komposisi Cat Gram Kristal Violet Alkohol 96 % Ammonium oksalat 1 % dalam akuades Jodium Kalium iodida Akuades Aseton Alkohol Safranin Alkohol 96 % Akuades
2 gram 20 ml 80 ml 1 gram 2 gram 300 ml 30 ml 70 ml 1 gram 10 ml 90 ml
Cara Pengecatan Gram ▪ Preparat yang telah siap dicat digenangi dengan cat Gram A selama 13 menit. Di sini semua kuman yang pada pengecatan Gram dibedakan menjadi Gram positif dan Gram negatif akan berwarna ungu sesuai dengan warna cat Gram A. Setelah 1-3 menit cat dibuang, tanpa dicuci dengan air. ▪ Preparat kemudian digenangi dengan cat Gram B selama 0,5-1 menit. Akibat pemberian Gram B maka pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih baik. Setelah itu cat dibuang dan preparat dicuci dengan air. ▪ Preparat kemudian ditetesi cat Gram C sampai warna cat tepat dilunturkan. 17
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
▪
▪
Setelah pemberian cat Gram C maka akan terjadi : Bakteri Gram positif : tahan terhadap alkohol sehingga bakteri akan tetap berwarna ungu. Bakteri Gram negatif : tidak tahan terhadap alkohol, sehingga warna ungu dari cat dilunturkan dan bakteri menjadi tidak berwarna lagi. Preparat digenangi dengan cat Gram D selama 1-2 menit. Gram D bertindak sebagai warna kontras. Akibat pemberian Gram D maka : - Bakteri Gram positif karena telah jenuh mengikat cat Gram A maka bakteri tidak mampu lagi untuk mengikat gram D sehingga bakteri akan tetap berwarna ungu. - Bakteri Gram negatif karena warna cat yang sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C sehingga bakteri tidak berwarna lagi maka bakteri akan mengikat warna cat Gram D sehingga bakteri akan berwarna merah . Setelah itu preparat dicuci dan dikeringkan dalam udara kamar (dengan preparat dalam posisi miring) dan setelah itu diperiksa di bawah mikroskop (Gambar 5) dengan menggunakan pembesaran kuat. Contoh bakteri Gram positif: Bentuk kokus : Streptococcus, Staphylococcus, Pneumococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus (Gambar 4) Bentuk batang : Corynebacterium diphtheriae, Nycobacteria, Bacillus clostridia. Contoh bakteri Gram negatif : Bentuk kokus : Neisseria, Veillonella. Bentuk batang : E. coli, Shigella, Salmonella, Klebsiella hemophillus, Pasteurella, Bacteroides, Fusobacterium, Brusella.
18
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/Lecture4-Microbio.htm
Gambar 4. Bentuk-bentuk bakteri Para ahli mikrobiologi menggunakan bermacam-macam mikroskop cahaya dalam pekerjaannya: mikroskop medan terang, medan gelap, 19
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
fluoresens, dan fase kontras. Mikroskop digunakan untuk mempelajari bentuk, struktur, karakteristik hasil pengecatan, dan motilitas mikroorganisme yang berbeda-beda. Oleh karena itu kecakapan dalam menggunakan mikroskop sangat penting dalam semua aspek mikrobiologi dan harus dikuasai sejak awal (Harley dan Prescott, 2002).
Gambar 5. Mikroskop dan bagian-bagiannya Untuk menggunakan mikroskop secara efisien, prinsip-prinsip dasar mikroskopi seperti perbesaran (magnification), resolusi, apertur numerik (numerical aperture), pencahayaan (illumination), dan pengaturan lensa (focusing) harus dipahami. Perbesaran spesimen merupakan fungsi 2 sistem lensa yaitu lensa okuler dan lensa obyektif. Lensa obyektif terletak di dekat spesimen dan memperbesarnya sehingga menghasilkan gambar nyata yang kemudian diperbesar oleh lensa okuler yang menghasilkan gambar final. Mikroskop yang paling umum digunakan dilengkapi dengan 4 lensa obyektif dan masing-masing lensa mempunyai tingkat perbesaran yang berbeda-beda. Jika perbesaran lensa obyektif
20
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
digabungkan dengan perbesaran lensa okuler maka diperoleh perbesaran total (Tabel 5) (Cappucino dan Welsh, 2017). Tabel 5. Perbesaran total mikroskop Perbesaran Perbesaran total Lensa Obyektif Lensa Okuler Obyektif dikalikan okuler Scanning 4X 10X 40X Low-power 10X 10X 100X High-power 40X 10X 400X Oil-immersion 100X 10X 1000X (Cappucino dan Welsh, 2017)
Gambar 6. Cahaya yang masuk lensa obyektif dengan dan tanpa minyak imersi (Cappucino dan Welsh, 2017) Kemampuan sistem lensa mikroskop untuk memisahkan 2 titik yang berdekatan pada spesimen atau obyek disebut resolusi atau daya pisah. Gambar yang diamati akan semakin tajam jika resolusi semakin besar. Resolusi dipengaruhi oleh apertur numerik lensa dan panjang gelombang cahaya yang digunakan. Resolusi merupakan fungsi apertur numerik 21
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
karena panjang gelombang cahaya umumnya tetap (Pratiwi, 2008). Apertur numerik merupakan fungsi diameter lensa obyektif dalam kaitannya dengan focal length (jarak antara lensa dengan titik fokusnya). Nilai apertur numerik biasanya dituliskan di tiap lensa obyektif. Resolusi juga tergantung pada faktor lain yaitu indeks bias (kekuatan membelokkan cahaya yang melewati udara dari gelas obyek ke lensa obyektif). Pembelokan cahaya menyebabkan hilangnya cahaya ke lensa obyektif sehingga mengurangi apertur numerik dan resolusi. Hilangnya cahaya yang dibelokkan dapat dihindari dengan menggunakan minyak mineral yang mempunyai indeks bias seperti kaca. Minyak diteteskan di antara gelas obyek dan lensa obyektif. Dengan cara ini, cahaya yang dibiaskan berkurang dan cahaya masuk langsung ke lensa obyektif sehingga menghasilkan gambar yang jelas dengan resolusi tinggi (Gambar 6) (Cappucino dan Welsh, 2017). Pencahayaan yang efektif diperlukan untuk mendapatkan perbesaran dan resolusi yang efisien. Karena intensitas cahaya pada siang hari tidak dapat dikontrol, maka cahaya buatan dari lampu tungsten paling umum digunakan sebagai sumber cahaya pada mikroskop. Cahaya melewati kondensor yang terletak di bawah meja preparat (stage). Kondensor terdiri atas 2 lensa yang diperlukan untuk menghasilkan apertur numerik yang maksimal. Tinggi kondensor dapat diubah dengan memutar kenop kondensor. Kondensor harus selalu dekat dengan meja preparat khususnya ketika menggunakan obyektif 100X (dengan minyak imersi). Di antara sumber cahaya dan kondensor ada diafragma iris yang dapat dibuka dan ditutup untuk mengatur banyaknya cahaya yang masuk kondensor. Cahaya yang terlalu terang akan mengaburkan gambar spesimen karena kurangnya kontras. Banyaknya cahaya yang masuk mikroskop berbeda-beda untuk tiap lensa obyektif yang digunakan. Aturan yang berlaku: semakin tinggi perbesaran lensa, semakin pendek jarak antara spesimen/preparat dengan lensa obyektif (working distance) sementara apertur numerik lensa obyektif meningkat (Gambar 7) (Cappucino dan Welsh, 2017).
22
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Gambar 7. Hubungan antara working distance, lensa obyektif, dan pembukaan diafragma (Cappucino dan Welsh, 2017) III.
ALAT DAN BAHAN a. Alat 1. Mikroskop 4. Gelas penutup 2. Jarum ose bulat 5. Lampu spiritus 3. Gelas objek 6. Pipet tetes b. Bahan 1. Kultur bakteri 2. Preparat bakteri (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Shigella sonnei, Bacillus spizizenii, Salmonella typhi, dan Bacillus cereus) 23
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
3. 4. 5. 6. 7. IV. A.
B.
Minyak imersi Formalin 1% Cat Gram A, B, C, dan D Air Etanol 70%
CARA KERJA Pengamatan preparat secara mikroskopik 1. Hidupkan mikroskop. 2. Letakkan preparat di meja objek pada mikroskop lalu jepit. 3. Teteskan minyak imersi di atas preparat. 4. Putar lensa objektif perbesaran 100X sampai tepat di atas preparat. 5. Putar makrometer (pemutar kasar) pelan-pelan hingga terlihat bayangan preparat. 6. Putar mikrometer (pemutar halus) untuk memfokuskan bayangan. 7. Amati bentuk, susunan, dan warna bakteri. 8. Tuliskan hasil pengamatan berupa bentuk, susunan, dan warna sel serta golongan bakteri (Gram positif atau negatif). Pengecatan Gram 1. Ambil bakteri menggunakan jarum ose bulat yang telah disterilkan. 2. Goreskan bakteri setipis mungkin pada gelas objek yang telah dibersihkan. 3. Panaskan gelas objek dengan nyala api spiritus (jarak ± 20 cm) sampai preparat kering. Tetesi dengan formalin 1%. 4. Tunggu 5 menit dan keringkan lagi dengan pemanasan. Preparat siap dicat. 5. Genangi preparat dengan cat Gram A selama 1-3 menit. 6. Buang cat tanpa dicuci dengan air. 7. Genangi preparat dengan cat Gram B selama 0,5-1 menit. 8. Buang cat Gram B dan cuci preparat di bawah air mengalir. 9. Tetesi preparat dengan cat Gram C sampai warna cat tepat dilunturkan. 10. Genangi preparat dengan cat Gram D selama 1-2 menit. 24
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
11. Cuci preparat dengan air mengalir dan keringkan dalam suhu kamar pada posisi miring. 12. Tutup preparat dengan gelas penutup dan tetesi bagian atas gelas penutup dengan minyak imersi. 13. Amati hasil pengecatan di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat (1000X). 14. Tuliskan hasil pengamatan berupa bentuk, susunan, dan warna sel serta golongan bakteri (Gram positif atau negatif) (Gambar 8).
https://everythingmicro.blogspot.com/2017/10/staphylococcus-identification.html
Gambar 8. Hasil pengecatan Gram bakteri Staphylococcus aureus. Bakteri berbentuk bulat, berwarna ungu, dengan susunan sel bergerombol.
25
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
MODUL 4 IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA MAKROSKOPIK I.
CAPAIAN PEMBELAJARAN Mahasiswa mampu mengidentifikasi bakteri secara makroskopik.
II.
DASAR TEORI Penggunaan media sangat penting dalam pemeriksaan mikrobiologik baik untuk isolasi, identifikasi maupun differensiasi. Media juga digunakan untuk membawa material dari rumah sakit atau tempat lain ke laboratorium agar kuman dalam material tersebut tetap hidup sesampainya di laboratorium. Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat makanan yang diperlukan untuk menumbuhkan suatu mikroorganisme, dalam rangka isolasi, memperbanyak penghitungan dan pengujian sifat fisiologik suatu mikroorganisme. Syarat-syarat media untuk mendapatkan suatu lingkungan kehidupan yang cocok bagi pertumbuhan bakteri adalah : 1. Susunan makanan 2. Tekanan osmosis 3. Derajat keasaman 4. Temperatur 5. Sterilitas 1. Susunan Makanan Media yang digunakan untuk pertumbuhan harus mengandung air, sumber karbon, sumber nitrogen,mineral, vitamin, dan gas. a. Air Air digunakan untuk pertumbuhan bakteri, menjaga kelembaban dan untuk pertukaran zat (metabolisme). Pada umumnya bakteri peka terhadap kekeringan, kecuali jenis-jenis tertentu dan yang mampu membentuk spora. b. Sumber karbon Sebagai sumber karbon, bakteri dapat menggunakan senyawa karbon sederhana misalnya CO2 dan CH4 atau senyawa karbon yang kompleks seperti sitrat, tartrat, alkohol atau gula. Berbagai bakteri mempunyai 26
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
c.
d.
e.
f.
2.
3.
kelakuan yang berbeda terhadap berbagai macam gula (glukosa, laktosa, maltosa) dan ini dapat dipakai untuk mengidentifikasi bakteri. Sumber nitrogen Sebagai sumber nitrogen dapat digunakan unsur nitrogen sendiri atau senyawa-senyawa nitrogen yang sederhana misal NO2, NO3, NH3, atau senyawa nitrogen yang lebih komplek seperti asam amino, polipeptid, peptid dan pepton. Mineral Mineral yang penting adalah Na, K, Mg, Zn, P, S, Cl, Na dan Cl dibutuhkan dalam jumlah yang agak besar, terutama digunakan untuk menjaga tetap dalam keadaan isotonis. NaOH digunakan untuk menetapkan pH agar didapat pH yang optimal untuk bakteri tersebut. Vitamin Beberapa bakteri membutuhkan vitamin tertentu untuk kehidupannya. Sebagai contoh yang jelas adalah vitamin K yang sangat dibutuhkan oleh Bacteroides melaninogenicus. Gas Beberapa bakteri membutuhkan gas tertentu untuk kehidupannya. Sebagai contoh Gonococcus sangat membutuhkan CO2 untuk kehidupannya. Namun ada bakteri tertentu yaitu bakteri anaerob, adanya O2 akan menghambat pertumbuhan, bahkan dapat membunuhnya. Tekanan Osmosis Mengingat sifat-sifat bakteri, juga sama seperti sifat-sifat sel yang lain terhadap tekanan osmose, maka bakteri untuk pertumbuhannya membutuhkan media yang isotonis. Bila media tersebut hipotonis maka media tersebut akan mengalami plasmoptysis, sedangkan bila media tersebut hipertonis maka akan terjadi plasmolysis. Derajat Keasaman (pH) Umumnya bakteri membutuhkan pH sekitar netral. Namun ada bakteri tertentu yang membutuhkan pH yang sangat alkalis yaitu vibrio, yang membutuhkan pH sekitar 8-10 untuk pertumbuhannya yang optimal.
4. Temperatur Untuk mendapatkan pertumbuhan yang optimal, bakteri membutuhkan temperatur tertentu. Umumnya untuk bakteri yang 27
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
patogen membutuhkan temperatur sekitar 370C, sesuai dengan temperatur tubuh. Namun ada bakteri patogen yang membutuhkan suhu sekitar 420C yaitu Camphylobacter. 5. Sterilitas Sterilitas media merupakan suatu syarat yang sangat penting. Pemeriksaan mikrobiologis tidak dilakukan apabila media yang digunakan tidak steril, karena tidak dapat dibedakan dengan pasti apakah bakteri tersebut berasal dari material yang diperiksa atau hanya kontaminan. Untuk mendapatkan suatu media yang steril maka setiap tindakan (pengambilan media, penuangan media) serta alat-alat yang digunakan (tabung, petri) harus steril dan dikerjakan secara aseptik. PENGGOLONGAN MEDIA 1. Media secara garis besar terbagi atas : a. Media Hidup Media hidup terutama digunakan untuk menanam/mengisolasi virus. Di samping itu sering pula media hidup digunakan untuk mengetahui jenis Escherichia coli yang patogen digunakan tikus putih yang berumur 3-7 hari. Kebanyakan virus hanya dapat ditanam pada bagian tertentu dari binatang misalnya ginjal kera dan embrio ayam. b. Media Buatan Media yang dibuat berasal dari kumpulan zat-zat tertentu (organik dan anorganik). Untuk masing-masing bakteri membutuhkan susunan media yang berbeda-beda. 2. Menurut Konsistensinya: a. Media Padat Media padat yang digunakan dapat berupa media padat datar, padat miring maupun padat tegak. b. Media Setengah Padat (Semi solid) Misalnya: SSS (Semi Solid Sucrose), MIO (Motility Indol Ornithine), Carry and Blair medium, Fletcher’s medium. c. Media Cair
28
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Contoh media cair: media gula, media kaldu, kaldu pepton, dan kaldu darah. 3. Menurut Isinya : a. Media Basal Media basal digunakan sebagai bahan dasar untuk membuat media lain yang lebih komplek. Misalnya : 1. Media basal padat : kaldu agar, TSA (Tryptone Soya Agar) 2. Media basal cair : air pepton, kaldu pepton b. Media Campuran Selain media basal juga ditambahkan berbagai macam zat baik organik maupun anorganik sesuai dengan kebutuhan bakteri. 4. Menurut Tingkatannya : a. Media Sederhana Media sederhana hanya mengandung zat-zat kimia yang sederhana, misalnya : media larutan alkali pepton, media gula-gula. b. Media Kaya Selain mengandung zat-zat kimia biasa, juga mengandung zat anorganik tingkat tinggi seperti serum, darah, telur dan lain-lain. 5. Menurut Penggunaanya : a. Media Kaya Media kaya digunakan untuk mendapatkan pertumbuhan jenis bakteri tertentu yang tidak dapat tumbuh pada media sederhana misalnya : Gonococcus, Pneumococcus, Streptococcus, Bacteroides, Fusobacterium, Clostridia dan lain-lain. Contohnya : media agar darah, brucella agar darah, agar coklat, kaldu darah dan lain-lain. b. Media Eksklusif Media ini dibuat sedemikian rupa sehingga hanya bakteri tertentu yang dapat hidup. Hal ini dapat dilakukan dengan : ▪ Membuat pH sangat alkalis Misalnya media cair alkali pepton dan thiosulfate citrate bile salts sucrose (TCBS) yang digunakan untuk isolasi vibrio. ▪ Menambahkan antibiotik tertentu 29
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Misalnya menambahkan kloramfenikol untuk Sabouraud, kanamisin pada Brucella agar darah untuk bakteri anaerob tertentu. c. Media Selektif Media ini mempunyai susunan sedemikian rupa, sehingga kuman yang dicari akan tumbuh dengan koloni yang khas sedang kuman lain kurang khas. Contoh : ▪ Media Endo, MacConkey Agar, desoxycholate citrate lactose sucrose (DCLS) Agar, yang digunakan untuk isolasi kuman-kuman perut. Kuman perut (Enterobacter) yang tidak memecah laktosa (nonlactose fermented) misalnya Salmonella, Shigella, Proteus dan lain-lain akan terlihat jernih transparan, sedang yang memecah laktosa akan berwarna merah. ▪ Media Tellurit yang digunakan untuk isolasi Corynebacterium diphtheriae, di mana koloni difteri akan berwarna hitam. d. Media Pembiakan Media ini digunakan bilamana dalam suatu material adanya kuman yang dicari dalam jumlah yang sangat sedikit, selain itu juga terdapatnya kuman-kuman lain dalam jumlah yang besar. Oleh karena itu dibutuhkan media pembiakan di mana kuman yang dicari tumbuh subur sedangkan kuman yang lain akan terhambat pertumbuhannya. Contoh : Media SC (selenite cysteine) broth yang digunakan sebagai media penyubur untuk Salmonella dan media alkali pepton cair yang digunakan sebagai media penyubur untuk Vibrio. e. Media yang digunakan untuk mempelajari sifat-sifat biokimiawi dari bakteri terhadap berbagai macam zat. Contohnya antara lain : 1. Media gula-gula, misalnya : glukosa, maltosa, laktosa, dan sakarosa. Dalam media gula-gula yang diamati: ▪ Apakah bakteri tersebut memecah gula-gula menjadi asam dan gas? ▪ Apakah bakteri tersebut memecah gula-gula hanya menghasilkan asam tanpa gas? ▪ Apakah bakteri tersebut tidak memecah gula-gula? 2. Media darah. Dalam media ini dipelajari sifat-sifat bakteri terhadap darah : 30
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
▪ Apakah bakteri tersebut menghemolisis darah (misalnya beta Streptococcus)? ▪ Apakah bakteri tersebut hemodigesti terhadap darah (misalnya alfa Streptococcus)? ▪ Apakah bakteri tersebut tidak berpengaruh terhadap darah (misalnya gamma Streptococcus)? 3. Di samping itu dewasa ini untuk kemudahan, sering digunakan satu macam media yang dapat sekaligus mempelajari berbagai sifat bakteri. Contoh : a. KIA (Kliger Iron Agar) Media ini bentuknya miring, digunakan untuk mempelajari reaksi bakteri terhadap komponen penyusun media juga digunakan untuk melihat produksi asam/perubahan warna dari merah menjadi kuning, baik pada daerah yang miring (slant) ataupun pada tusukan (butt). Media KIA dapat digunakan untuk reaksi bakteri terhadap gula-gula, dan kemampuan membentuk H2S yang diikat sebagai ferri sulfida yang akan terlihat berwarna hitam. b. TSI (Triple Sugar Iron Agar) Prinsipnya hampir sama dengan KIA, perbedaannya dalam media TSI mengandung tiga macam gula yaitu dekstrosa, laktosa, dan sukrosa. c. SSS (Semi Solid Sucrose) Agar Dalam media ini dapat dipelajari motility (pergerakan bakteri) dan reaksi bakteri terhadap sukrosa. Di samping itu jika sukrosa diganti dengan gula yang lain maka dapat diketahui sifat bakteri terhadap gula tersebut. d. LIA (Lysine Iron Agar) Dalam media ini dapat dilihat kelakuan bakteri terhadap lisin dan kemampuan membentuk H2S. e. MIO (Motility Indol Ornithine) Dalam media ini dipelajari pergerakan bakteri, kemampuan menghasilkan indol, dan reaksi pemecahan ornitin. f. Media yang digunakan untuk penyimpanan bakteri.
31
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Contoh media agar padat miring. Dewasa ini untuk penyimpanan bakteri/virus dalam jangka waktu yang lama dapat dengan menyimpan pada suhu kira-kira –600 C. Dipandang dari segi kepraktisannya, laboratorium mikrobiologi membagi media yang dipakai sebagai berikut : A. Media Transport : a. BGS (Buffered Glycerol Saline) b. Carry and Blair transport medium c. Amies transport medium d. Alkaline pepton water (air pepton alkalis) e. Stuart transport medium f. Kaldu pepton B. Media Isolasi : a. Kultur umum 1. Agar darah (untuk kultur dan angka kuman) 2. Agar coklat 3. DCLS (Deoxycholate Citrate Lactose Sukrosa) Agar 4. Media tellurit 5. Media untuk pertussis (Mordet Gengou Agar) 6. Thayer Martin Medium 7. MacConkey Agar b. Penanaman Mycobacterium tuberculosis Medium Loewenstein-Jensen dan Middlebrook c. Penanaman Bakteri Anaerob 1. Brucella Agar darah 2. Brucella Agar darah dengan kanamisin/antibiotik lain 3. Agar darah 4. Thioglycolat 5. Thioglycolat dengan antibiotik d. Leptospira Fletcher’s medium e. Jamur Sabouraud dan Sabouraud dengan kloramfenikol f. Enterobacteriaceae 1. DCLS 32
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
2. Diagnostic sensitivity test (DST) agar 3. MacConkey C. Enriched Medium (media penyubur) 1. Selenit Cysteine Broth 2. Larutan alkali pepton 3. Kaldu darah 4. Thioglycolat 5. Gal kultur D. Media Sensitivitas Test 1. Mueller Hinton agar 2. DST agar 3. Supristol agar 4. Brain heart infusion (BHI) 5. Agar base E. Media Identifikasi a. Kultur umum : 1. Media gula-gula 2. Deret media komplek untuk identifikasi kuman perut batang Gram negatif. b. Enterobacteriaceae : 1. KIA/TSI Agar 2. SSS (Semi Solid Sukrosa) 3. LIA 4. MIO 5. ACE (Acetate agar) 6. Urea Broth 7. MR (Methyl Red) 8. VP (Voges Proskauer) Ketika ditumbuhkan pada berbagai macam media, mikroorganisme akan menunjukkan rupa yang berbeda-beda. Perbedaan tersebut dinamakan karakteristik kultur yang digunakan sebagai dasar pemisahan mikroorganisme ke kelompok-kelompok taksonomi. Karakteristik kultur ditentukan dengan menanam mikroorganisme pada media nutrien agar miring dan plate, nutrient broth, dan nutrient gelatin (Cappucino dan Welsh, 2017). 33
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Koloni yang terisolasi dengan baik pada agar dapat dievaluasi berdasarkan: 1. Ukuran: pintpoint (< 1mm), kecil, sedang, atau besar. 2. Pigmentasi: warna koloni. 3. Bentuk: bentuk koloni dideskripsikan sebagai sirkuler, tidak teratur, dan rhizoid (seperti akar) (Gambar 9). 4. Margin/tepi: tepi dideskripsikan sebagai utuh (entire), berbelah (lobate), berombak (undulate), seperti gigi (serrate), berbenang (filamentous). 5. Elevasi: tingkat ketinggian koloni di atas permukaan media dideskripsikan sebagai rata (flat), timbul (raised), mencembung (convex), membukit (umbonate). (Cappucino dan Welsh, 2017).
http://www.sciencebuddies.org/science-fairprojects/project_ideas/MicroBio_Interpreting_ Plates.shtml
Gambar 9. Bentuk, elevasi, dan tepi koloni bakteri
34
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Bau koloni dapat digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Ada koloni yang berbau khas atau berbau menyerupai bau benda lain atau koloni tidak berbau sama sekali. Koloni dapat berupa lendir (Gambar 10), liat, seperti mentega, atau getas (Irianto, 2006).
Gambar 10. Koloni bertekstur mukoid/berlendir yang tumbuh pada media MacConkey (microbeonline.com, 2013) III.
BAHAN 1. Kultur bakteri Escherichia coli pada media MacConkey padat. 2. Kultur bakteri Pseudomonas aeruginosa pada media MacConkey padat. 3. Kultur bakteri Klebsiella pneumoniae pada media MacConkey padat. 4. Kultur bakteri Shigella sonnei pada media MacConkey padat. 5. Kultur bakteri Staphylococcus aureus pada media MacConkey padat. 6. Kultur bakteri Bacillus subtilis subsp. Spizizenii pada media MacConkey padat.
IV.
CARA KERJA 1. Amati warna, bentuk, dan tekstur koloni bakteri tiap spesies. 2. Beri keterangan terkait kemampuan bakteri dalam memfermentasi laktosa.
35
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
MODUL 5 IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA BIOKIMIAWI I.
II.
CAPAIAN PEMBELAJARAN Mahasiswa diharapkan mampu mengidentifikasi bakteri berdasarkan sifat-sifat biokimiawinya. DASAR TEORI Bakteri melakukan aktivitas biokimia untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan menggunakan bahan makanan yang diperoleh dari lingkungannya. Perubahan biokimia yang terjadi baik di dalam maupun di luar bakteri diatur oleh enzim yang merupakan katalis biologis. Fermentasi merupakan reaksi biokimia yang menghasilkan energi dan molekul organik berperan sebagai penerima dan pendonor elektron. Kemampuan mikroorganisme untuk memfermentasi karbohidrat dan jenis produk yang dihasilkan sangat penting dalam identifikasi bakteri. Karbohidrat tertentu mungkin difermentasi menjadi beberapa produk akhir yang tidak sama tergantung pada mikroorganisme yang terlibat. Produk-produk akhir seperti alkohol, asam, gas, atau molekul organik yang lain merupakan ciri khas mikroorganisme tertentu. Jika bakteri yang mampu memfermentasi ditumbuhkan dalam media cair yang mengandung glukosa, mikroorganisme tersebut mungkin memproduksi asam organik sebagai hasil samping fermentasi. Asam yang dilepaskan akan menurunkan pH media. Jika indikator pH seperti merah fenol atau bromkresol ungu merupakan komponen media, produksi asam akan mengubah warna media menjadi kuning. Gas yang diproduksi selama proses fermentasi dapat dideteksi menggunakan tabung kecil yang diletakkan secara terbalik dalam media cair yang disebut tabung Durham. Jika gas diproduksi, media cair di dalam tabung Durham akan digantikan oleh gas yang terjebak di dalam tabung yang berupa gelembung (Harley dan Prescott, 2002). Banyak protein mengandung asam amino bersulfur dalam jumlah yang banyak seperti sistein. Ketika bakteri menghidrolisis protein tersebut, asam amino akan dilepaskan dari protein dan diambil oleh bakteri sebagai makanan. Sistein dengan adanya enzim sistein desulfurase akan kehilangan atom sulfur melalui penambahan hidrogen dari air dan 36
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
menghasilkan gas hidrogen sulfida. Gas hidrogen sulfida juga bisa diproduksi dengan reduksi senyawa inorganik yang mengandung sulfur seperti tiosulfat, sulfat, atau sulfit. Ketika bakteri tertentu mengambil natrium tiosulfat, bakteri dapat mereduksinya menggunakan enzim tiosulfat reduktase menjadi sulfit dan melepaskan gas hidrogen sulfida (Gambar 11) (Harley dan Prescott, 2002).
Gambar 11. Produksi hidrogen sulfida oleh bakteri (Harley dan Prescott, 2002). Tabel 6. Aktivitas bakteri terhadap komponen media diferensial (Lindquist, 2010)
37
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Media SIM agar dapat digunakan untuk mendeteksi ada atau tidak adanya pergerakan bakteri dan produksi indol. Pergerakan (motilitas) ada jika pertumbuhan kultur tidak sebatas di garis tusukan inokulasi. Pertumbuhan bakteri yang tidak bergerak (nonmotil) hanya pada sepanjang tusukan inokulasi. Media semisolid seperti MIO juga dapat digunakan untuk menentukan motilitas bakteri. Selama pertumbuhan, bakteri yang motil akan bergerak dari garis inokulasi untuk membentuk kekeruhan pada media sedangkan bakteri yang tidak bergerak hanya tumbuh di sepanjang tusukan (Harley dan Prescott, 2002).
38
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Tabel 7. Identifikasi Enterobacteriaceae dengan uji biokimia Species Salmonella typhi S. paratyphi A S. enteritidis S. gallinorus S. Pullorum Shigella dysenteriae S. flexneri S. boydii S. sonnei Escherichia coli Edwardsiella tarda Arizona Citrobacter Klebsiella Enterobacter Serratia Pseudomonas Aeromonas hidrophil Proteus vulgaris P. mirabilis P. morganii Providencia rettgeri Vibrio cholera V. nag (sp) V. parahaemolytica
Mir K K K K K K K K A/K K K K/A AG A/K K/A K K A/K K/A K K K K K
Keterangan : K = alkali G = gas N = netral Mir = miring Mot = motility Ind = indol
KIA Teg A AG AG A AG A A A AG AG AG AG AG A AG A N0 A AG AG A/d A A A A
SSS LIA MIO Ace Ure H2S Rek Mot Mir Teg H2S Rek Mot I nd +/0 K + K K/N +/0 A + 0 0 0 0/+ K + K A 0/+ K + 0 0 0 0/+ K + K K/N + K + 0 + 0 + K 0 K K/N 0 A 0 0 + 0 + K 0 K K/N + K 0 0 + 0 0 K 0 K A 0 A 0 0 0 0 0 0 0 0 + + + 0 0 0 0 0 + + 0 0 0 0 0
K/d K K/d K/d 0 0 0 K/A A/d K K A A K/d K K/d A d K
A R + Teg Ace
0 0 0 + + + 0 0 + + + + + + + + + + +
K K K K K K K K K K/N K K R R K/R R K K K
= asam = red = positif = tegak = asetat
A A A K/d K/N K/N A/AG K/d K/N K/N K/N A A A A A N N N
0 A 0 A 0 K 0 K/d +/0 K +/0 K +/0 K 0 A 0 K 0 K 0 N 0 A 0/+ A 0/+ K 0 K 0 A 0 A 0 K 0 K
X d 0 Rek Ure
0 0 0 + + + + 0 + + + + + + + + + + +
d d + + + d d 0 0/+ 0/+ d d +/0 +/0 +/0 +/0 + + +
0 0 0 + K X X X X X X X X X X X X X X
0 0 0 0 0 0 +/0 0/+ +/0 X X X + + + + X X X
= tidak penting = delayed/ (lambat) = negatif = reaksi = urea
MIO medium: ▪ Motility. Observe for cloudiness in the medium (growth away from the stab line). For a non-motile organism, growth may be seen along cracks in the medium caused by gas production, but there will be clear pockets of no growth. 39
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
▪
Indole production. About one-half dropperful of Kovacs reagent is added to the medium. A red ring indicates production of indole from the breakdown of tryptophan (Lindquist, 2010). Tabel 8. Komposisi Media KIA, TSI, LIA, dan MIO
Uji Manitol Uji ini dapat digunakan untuk membedakan S. aureus dan yang lain karena pada umumnya S. aureus mampu memfermentasi manitol dalam keadaan anaerob, sedangkan spesies yang lain jarang.
40
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Ada dua cara pemeriksaan : 1. Satu koloni bakteri diinokulasikan pada media agar manitol di dalam tabung, dengan cara menusukkan ke bawah sepanjang tabung, kemudian diinkubasikan pada 35oC selama 48 jam. Uji dinyatakan positif bila terjadi perubahan warna menjadi kuning pada bagian atas dan bawah media tersebut. 2. Bakteri digoreskan pada agar garam manitol (Manitol Salt Agar =MSA) dan diinkubasikan pada 37o C selama 36 jam. Bila daerah disekitar koloni berwarna kuning menunjukkan bahwa bakteri tersebut adalah S. aureus. III.
ALAT DAN BAHAN a. Alat 1. Jarum ose lurus 2. Lampu spiritus b. 1. 2. 3. 4. 5.
IV.
Bahan Media kliger iron agar (KIA) miring dalam tabung reaksi Media lysine iron agar (LIA) miring dalam tabung reaksi Media motility iron ornithine (MIO) dalam tabung reaksi Media mannitol salt agar (MSA) miring dalam tabung reaksi Etanol 70%
CARA KERJA A. Penanaman pada media KIA, LIA, dan MSA* 1. Semprot area kerja dengan etanol 70% dan lap sampai kering. 2. Panaskan jarum ose lurus sampai panas dan merah lalu dinginkan. 3. Panaskan mulut tabung reaksi pada api lampu spiritus. 4. Ambil kultur bakteri, tusukkan pada bagian tegak, tarik lalu goreskan dengan pola zig-zag pada bagian miring. 5. Panaskan mulut tabung reaksi pada api lampu spiritus. 6. Tutup mulut tabung dengan kapas. 7. Labeli tabung dengan nama media, spesies bakteri, kelas, kelompok, dan tanggal penanaman. 8. Inkubasi kultur selama 24 jam pada suhu 37C.
41
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
9. Amati warna media pada bagian tegak dan miring, ada tidaknya warna hitam pada media, dan ada tidaknya gas yang terbentuk (Gambar 12). * Media MSA hanya untuk ditanami Staphylococcus aureus. B. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. V.
Penanaman pada media MIO Semprot area kerja dengan etanol 70% dan lap sampai kering. Panaskan jarum ose lurus sampai panas dan merah lalu dinginkan. Panaskan mulut tabung reaksi pada api lampu spiritus. Ambil kultur bakteri, tusukkan pada media MIO, tarik tegak lurus (jangan digoyang). Panaskan mulut tabung reaksi pada api lampu spiritus. Tutup mulut tabung dengan kapas. Labeli tabung dengan nama media, spesies bakteri, kelas, kelompok, dan tanggal penanaman. Inkubasi kultur selama 24 jam pada suhu 37C. Amati warna media dan pertumbuhan bakteri.
INTERPRETASI HASIL 1. Media KIA a. Penggunaan karbohidrat Bagian miring: asam (warna kuning), basa (warna merah) Bagian tegak: asam (warna kuning), basa (warna merah) Bagian miring berwarna merah dan bagian tegak berwarna kuning menandakan bahwa hanya glukosa yang difermentasi. Bagian miring berwarna kuning dan bagian tegak berwarna kuning menandakan bahwa glukosa dan laktosa difermentasi. Bagian miring berwarna merah dan bagian tegak berwarna merah menandakan bahwa glukosa dan laktosa tidak difermentasi. b. Produksi gas Produksi gas ditandai dengan pecahnya media atau adanya gelembung. c. Produksi H2S Produksi H2S ditandai dengan warna hitam pada media, seluruh bagian atau sebagian.
42
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Merah Kuning
Hitam https://users.stlcc.edu/kkiser/TSIreact.jpg
Gambar 12. Hasil uji biokimia menggunakan media TSI 2. Media LIA Kultur yang memproduksi lisin dekarboksilase secara cepat menyebabkan reaksi alkalin (basa) sehingga media berwarna ungu. Organisme yang tidak mendekarboksilasi lisin menghasilkan reaksi basa pada bagian miring (ungu) dan asam pada bagian tegak (kuning). Kultur yang menghasilkan hidrogen sulfida (H2S) menyebabkan warna hitam pada media. Deaminasi lisin ditandai dengan bagian miring yang berwarna merah dan bagian tegak yang berwarna kuning. 3. Media MIO (HIMEDIA) Pergerakan bakteri (motility) diindikasikan dengan pertumbuhan bakteri keluar garis inokulasi. Organisme yang tidak bergerak (nonmotile) hanya tumbuh sepanjang garis inokulasi (Gambar 13). Dekarboksilasi ornitin ditandai dengan ungu pada seluruh media sedangkan reaksi negatif ditandai dengan warna kuning atau warna kuning dengan pita ungu di bagian atas media. Produksi indol ditandai dengan pembentukan warna merah muda pada bagian atas media setelah penambahan reagen Kovacs dan penggojogan sedang. Reaksi negatif ditandai warna kuning.
43
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
A
B
Gambar 13. Hasil uji motilitas bakteri. Bakteri yang tidak bergerak (A) dan bergerak (B) dalam media. 4. Media MSA Bakteri yang mampu memfermentasi manitol tampak sebagai koloni berwarna kuning dengan warna kuning pada media sedangkan bakteri yang tidak memfermentasi manitol mempunyai koloni berwarna merah muda sampai merah dengan tidak ada warna kuning pada media.
44
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
MODUL 6 SKRINING PRIMER UNTUK MEMPEROLEH MIKROBA PENGHASIL ANTIBIOTIK I.
CAPAIAN PEMBELAJARAN Mahasiswa mampu melakukan berbagai teknik mikrobiologi dalam skrining (menanam, mengisolasi, memurnikan biakan, dan melakukan uji terhadap kemampuan biakan penghasil antibiotik).
II.
DASAR TEORI Mikroba penghasil antibiotik terseleksi diperoleh dari proses skrining, di mana mikroba tersebut potensial untuk menghasilkan metabolit yang dapat menghambat pertumbuhan atau reproduksi mikroba patogen. Hasil yang positif dari proses skrining primer masih harus mengalami penelitian lebih lanjut sampai menjadi antibiotik yang bisa dimanfaatkan. Mikroba terdapat dimana-mana termasuk dalam tanah. Tanah merupakan sumber yang kaya akan mikroba, dan telah banyak menghasilkan antibiotik yang digunakan sekarang. Cara untuk memperoleh antibiotik melalui : 1. Skrining Primer Skrining primer adalah prosedur selektif untuk mendeteksi atau mengisolasi banyak mikroba/metabolit yang dikehendaki dari sejumlah besar populasi. Adapun tujuan daripada skrining primer adalah sebagai berikut : a. Memperoleh mikroba penghasil antibiotik b. Mengisolasi dan mengumpulkan mikroba penghasil antibiotik c. Menguji kemampuan mikroba penghasil antibiotik dengan mikroba uji 2. a. b.
III.
Skrining Sekunder Skrining sekunder mempunyai tujuan sebagai berikut : Menentukan mikroba yang menghasilkan antibiotik Memperoleh antibiotik yang bersifat spesifik ALAT DAN BAHAN a. Alat 11. Neraca analitik 13. Lampu spiritus 12. Tabung reaksi steril 45
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
14. Pelubang gabus (cork borer) 15. Jarum ose bulat 16. Inkubator b. 1. 2. 3. 4. IV.
17. Mikropipet 18. Spreader 19. Penggaris
Bahan Salin steril Media Czapek dox Media Sabouraud Media Mueller Hinton
5. 6. 7. 8.
Kultur bakteri cair Etanol 70% Yellow tips Blue tips
CARA KERJA Tahap I 1. Suspensikan 0,5 gram sampel tanah dengan larutan salin 5 ml dalam tabung steril 1 (10-1). 2. Ambil 0,5 ml suspensi pengenceran 10-1 dan masukkan ke dalam tabung reaksi steril 2 yang berisi salin sebanyak 4,5 ml (10-2). 3. Ambil 0,5 ml suspensi pengenceran 10-2 dan masukkan ke dalam tabung reaksi steril 3 yang berisi salin sebanyak 4,5 ml (10-3). 4. Ambil 100 µl suspensi tersebut (10-3), teteskan ke dalam petri steril yang telah dituangi media selektif padat (Czapex Dox) lalu ratakan menggunakan spreader. 5. Labeli dengan keterangan asal tanah, media, kelas, kelompok, dan tanggal percobaan. 6. Inkubasi 28oC dalam posisi terbalik sampai praktikum berikutnya. 7. Deskripsikan mikroorganisme yang tumbuh. Tahap II 1. Buat 3 lubang pada media Sabouraud menggunakan cork borer yang telah disterilkan. 2. Pilih 3 koloni yang dominan pada media Czapex Dox, iris menggunakan cork borer yang telah disterilkan, masukkan ke dalam lubang pada media Sabouraud. 3. Labeli cawan dengan keterangan asal tanah, media, kelas, kelompok, dan tanggal percobaan. 4. Inkubasi 28oC dalam posisi terbalik sampai praktikum berikutnya. 46
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
5. Deskripsikan mikroorganisme yang tumbuh. Tahap III 1. Panaskan pinggiran cawan Petri berisi media MH pada api lampu Bunsen. 2. Inokulasi media MH dengan kultur bakteri cair lalu ratakan menggunakan spreader yang telah disterilkan, diamkan selama 10 menit. 3. Buat lubang pada media MH menggunakan cork borer yang telah disterilkan. 4. Iris 3 koloni dominan menggunakan cork borer yang telah disterilkan lalu pindah ke media MH. 5. Labeli cawan dengan nama bakteri uji, media, kelas, kelompok, dan tanggal percobaan. 6. Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam dalam posisi terbalik. 7. Amati ada tidaknya zona hambat pada daerah sekitar koloni (Gambar 14). 8. Jika ada zona hambat, ukur diameter zona hambat menggunakan penggaris.
https://microbepost.org/2015/10/13/antibiotics-weapons-or-signals/
Gambar 14. Hasil skrining primer tahap III. Zona hambat di sekitar jamur mengindikasikan bahwa jamur menghasilkan antibiotik.
48
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
MODUL 7 UJI SENSITIVITAS BAKTERI TERHADAP ANTIBIOTIK I.
CAPAIAN PEMBELAJARAN Mahasiswa mampu melakukan uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik dan menginterpretasikan hasilnya.
II.
DASAR TEORI Pemeriksaan uji sensitivitas bakteri bertujuan : 1. Mengetahui obat-obat yang paling cocok (paling poten) untuk bakteri penyebab penyakit terutama pada kasus-kasus penyakit yang kronis. 2. Mengetahui adanya resistensi bakteri terhadap berbagai antibiotik. Secara garis besar resistensi bakteri terhadap antibiotik disebabkan : a. Secara alamiah bakteri resisten terhadap antibiotik yang diberikan. b. Akibat pemberian dosis di bawah dosis yang diberikan. c. Akibat penghentian obat sebelum kuman-kuman tersebut betul-betul terbunuh oleh antibiotik. Pemeriksaan uji sensitivitas dapat dikerjakan dengan beberapa cara : A. Dilusi cair atau dilusi padat Pada prinsipnya antibiotika diencerkan hingga diperoleh beberapa konsentrasi. Pada dilusi cair, masing-masing konsentrasi obat ditambah suspensi kuman dalam media; sedangkan pada dilusi padat tiap konsentrasi obat dicampur dengan media agar, lalu ditanami kuman. B. Difusi Media yang dipakai adalah agar Mueller Hinton. Pada metode difusi ini ada beberapa cara, yaitu: 1. Cara Kirby Bauer. a. Sedikitnya 3-5 koloni terisolasi baik dengan tipe morfologi yang sama dipilih dari kultur semalam plat agar MH, disuspensikan ke dalam 45 ml BHI cair, diinkubasi pada 370 C sampai mencapai atau melebihi 0,5 Mc Farland (biasanya 2-3 jam). b. Suspensi di atas ditambah salin steril hingga kekeruhan tertentu sesuai dengan standart 0,5 Mc Farland/konsentrasi kuman 1-2 x 108 CFU per ml (CFU = Colony Forming Unit). 49
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
c. Kapas lidi steril dicelupkan ke dalam suspensi kuman lalu ditekantekan pada dinding tabung supaya tidak menetes kemudian diusapkan pada permukaan media agar hingga rata. d. Kemudian kertas samir (disk) yang mengandung antibiotik diletakkan di atas media, diinkubasi pada 370C selama 18-24 jam (Wanger, 2007). Dibaca hasilnya : 1. Zona radikal = suatu daerah di sekitar disk di mana sama sekali tidak diketemukan adanya pertumbuhan bakteri. Potensi antibiotik diukur dengan mengukur diameter dari zona radikal. 2. Zona irradikal = suatu daerah di sekitar disk menunjukkan pertumbuhan bakteri dihambat oleh antibiotik tersebut, tetapi tidak dimatikan. Di sini akan terlihat adanya pertumbuhan yang kurang subur/lebih jarang, dibanding dengan daerah di luar pengaruh antibiotik tersebut. 3. Cara sumuran a,b,c sama dengan cara Kirby Bauer. d. Pada agar tersebut dibuat sumuran dengan garis tengah tertentu menurut kebutuhan. Ke dalam sumuran tersebut diteteskan larutan antibiotik yang digunakan. Diinkubasi pada 370C selama 18-24 jam. Dibaca hasilnya, seperti pada cara Kirby Bauer. 3. Cara pour plate a dan b, sama dengan cara Kirby Bauer. c. Dengan menggunakan ose khusus, ambillah satu mata ose dan masukkan dalam 4 ml agar base 1,5 % yang mempunyai temperatur 500 C (diambil dari waterbath). d. Setelah suspensi kuman tersebut dibuat homogen, tuanglah pada media Muller Hinton agar. e. Tunggulah sebentar sampai agar tersebut membeku, letakkanlah disk antibiotik. f. Eramkanlah selama 15-20 jam dengan temperatur 370C. g. Bacalah dengan disesuaikan standard masing-masing antibiotik. Untuk masing-masing antibiotik dan jenis kumannya, mempunyai diameter yang berbeda-beda untuk dinilai sebagai antibiotik yang sensitif (poten dalam terapi) seperti pada Tabel 9. 50
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Tabel 9. Interpretasi zona diameter standard dan korelasinya dengan MIC Isi Antibiotik 1. Ampicillin - kuman perut dan Enterococcus - Staphylococcus - Hemophylus 2. Carbenillin - Proteus - Pseudomonas 3. Chepalotin 4. Chloramphenicol 5. Clidamycin 6. Erythromycin 7. Gentamycin 8. Kanamycin 9. Methicillin - Staphylococcus 10. Neomycin 11. Penicillin G - Staphylococcus - kuman lain 12. Polimixin B 13. Streptomycin 14. Tetracyclin 15. Vancomycin 16. Sulfa 17. Citromoxazole 18. Nitrofurantoin 19. Nalidixic acid
III.
disk
Diameter zona hambatan (mm) Resisten Interme- Sensitif diet () ()
Korelasi dengan MIC (mg/ml) Resisten Sensitif () ()
10 g 11
12-13
14
32
8
20 19
21-28 -
29 20
2 -
0,2 2
17 12 14 11 14 13 11 13
18-22 13-14 15-17 13-17 15-16 14-17 14-17
23 15 18 18 17 18 13 18
32 250 32 25 2 8 6 25
16 125 10 12,5 1 2 6 6
9 12
10-13 13-16
14 17
-
3 10
20 11 8 11 14 9 12 10 14 13
21-28 12-22 9-11 12-14 15-18 10-11 13-16 11-15 15-18 14-18
29 22 12 15 19 11 17 16 19 19
32 15 12 35mg/100ml 200 100 32
0,11 1,5 50 6 4 5 10mg/100ml 35 25 12
50 g 30 g 30 g 2 g 15 g 10 g 30 g 5 g 30 g 10 unit 300 g 10 g 30 g 30 g 150-300g 25 g 300 g 30 g
ALAT DAN BAHAN a. Alat 1. Lampu spiritus 2. Inkubator 3. Mikropipet 4. Spreader
5. 6. 7. 8. 51
Pinset Penggaris Cork borer Silinder logam steril
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
b. 1. 2. 3. IV.
Bahan Kultur cair bakteri Yellow tips Disk antibiotik
4. Media Mueller Hinton 5. Disk kosong 6. Larutan antibiotik
CARA KERJA Uji sensitivitas bakteri terhadap antibiotik 1. Panaskan pinggiran cawan Petri berisi media MH pada api lampu spiritus. 2. Inokulasi media MH dengan kultur bakteri cair lalu ratakan menggunakan spreader yang telah disterilkan, diamkan selama 10 menit. 3. Letakkan beberapa disk antibiotik di atas media menggunakan pinset. 4. Labeli cawan dengan keterangan nama bakteri uji, kelas, kelompok, dan tanggal percobaan. 5. Inkubasi pada suhu 37C selama 24 jam dalam posisi terbalik. 6. Amati ada tidaknya zona hambat pada daerah sekitar disk. 7. Jika ada zona hambat, ukur diameternya menggunakan penggaris (Gambar 15) sebanyak 2 kali dari sisi yang berbeda dan hitung rata-rata diameternya dalam satuan mm. Jika tidak ada zona hambat, diameternya dihitung sama dengan diameter disk. Tentukan sifat bakteri terhadap antibiotik berdasarkan Tabel 9. A
B
https://www.cdc.gov/std/gonorrhea/lab/diskdiff.htm http://mikrobiologie.lf3.cuni.cz/engl/pract1.htm
Gambar 15. Cara mengukur diameter zona hambat hasil uji sensitivitas bakteri menggunakan penggaris
52
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Uji aktivitas antibiotik menggunakan metode difusi disk, sumuran, dan silinder 1. Panaskan pinggiran cawan Petri berisi media MH pada api lampu spiritus. 2. Inokulasi media MH dengan kultur bakteri cair lalu ratakan menggunakan spreader yang telah disterilkan, diamkan selama 10 menit. 3. Letakkan disk kosong dan silinder di atas media. 4. Buat sumuran menggunakan cork borer. 5. Masukkan 10 L larutan antibiotik ke dalam sumuran, disk, dan silinder. 6. Labeli cawan dengan keterangan nama bakteri uji, kelas, kelompok, dan tanggal percobaan. 7. Inkubasi pada suhu 37C selama 24 jam dalam posisi tegak. 8. Amati ada tidaknya zona hambat pada daerah sekitar disk, sumuran, dan silinder. Ambil silinder. 9. Jika ada zona hambat, ukur diameternya menggunakan penggaris (Gambar 15) sebanyak 2 kali dari sisi yang berbeda dan hitung rata-rata diameternya dalam satuan mm. Jika tidak ada zona hambat, diameternya dihitung sama dengan diameter disk.
53
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
MODUL 8 PEMERIKSAAN POTENSI ANTIBIOTIK I.
CAPAIAN PEMBELAJARAN Mahasiswa mampu melakukan uji antibakteri dengan metode dilusi cair dan menentukan Kadar Hambat Minimal larutan antibakteri yang diuji.
II.
DASAR TEORI Tujuan pemeriksaan ini adalah untuk mengetahui daya antibakteri dari suatu antibiotik terhadap bakteri standar. Ada beberapa cara pemeriksaan potensi antibiotik yaitu: A. Agar diffusi : untuk industri obat-obatan juga rumah sakit, dan untuk menetapkan potensi obat dalam bentuk bahannya. B. Turbidimetri : 1. Pengenceran seri bahan pemeriksaan/larutan obat, ditambah suspensi kuman dengan konsentrasi 104 CFU per ml. Suspensi kuman ini diperoleh dengan mengencerkan pertumbuhan kuman dalam kaldu yang telah diinkubasi semalam. Kemudian campuran tersebut diinkubasi 18-24 jam. Lalu dicari MIC-nya (Minimum Inhibitory Concentration), yaitu konsentrasi terkecil yang masih mampu menghambat pertumbuhan kuman. 2. Cara yang lebih teliti adalah dengan menggunakan kurva berbagai konsentrasi antibiotika. Prosedur uji dilusi Metode ini digunakan untuk mencari MIC. Dasar : pengenceran seri antibiotik ditambah mikroorganisme kemudian dieramkan. MIC : konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan kuman. Bahan yang dipersiapkan (antibiotik) : Bahan yang diperiksa (antibiotik) harus asli dan murni dan kadar (mcg atau unit) serta tanggal kadaluwarsanya harus diketahui. Serbuk antibiotik kemudian ditimbang dan dilarutkan dengan pelarut yang sesuai (sebagai larutan induk) dan disimpan pada suhu -200 C atau lebih. 54
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Dilusi 1. Dilusi cair (macro broth dilution) a. Lakukan pengenceran antibiotika yang diperiksa, sehingga didapat beberapa konsentrasi. Pelarut dan pengencer antibiotik dapat dilihat pada Tabel 10. Caranya : ▪ Siapkan 10 tabung steril (ukuran 13 x 100 mm) nomor 1 s/d 11. ▪ Tabung no. 2 s/d 11 masing-masing diisi dengan 0,5 ml BHI/MH Broth steril ▪ Tabung no. 1 dan 2 masing-masing diisi dengan 0,5 ml larutan antibiotik. ▪ Larutan antibiotik di tabung no 2 dicampur homogen dan diambil sebanyak 0,5 ml larutan dipindahkan ke tabung no 3, demikian seterusnya sampai tabung nomor 9, blue tips diganti tiap kali pengenceran larutan antibiotik tersebut. ▪ Larutan antibiotik di tabung no 9 diambil 0,5 ml dan dibuang. ▪ Tabung no 10 tidak diberi larutan antibiotik (kontrol bakteri). b. Penyiapan inokulum bakteri sama seperti penyiapan inokulum untuk uji difusi, tetapi setelah kekeruhan sama dengan standar 0,5 Mc Farland, inokulum diencerkan 1:100 (106 CFU/ml) menggunakan NaCl 0,9% steril. Dalam 15 menit, 0,5 ml suspensi bakteri ditambahkan ke dalam tiap tabung kecuali tabung nomor 11 (kontrol media). Konsentrasi inokulum akhir adalah 105 CFU/ml. c. Sebanyak 10 μl suspensi bakteri dari tabung nomor 10 (kontrol bakteri) digoreskan ke media MH Agar dan diinkubasi semalam untuk mengecek kemurnian isolat dan kebenaran ukuran inokulum. Adanya sekitar 50 koloni mengindikasikan kerapatan inokulum 5 x 105 CFU/ml. d. Semua tabung diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Sebelum diamati, tabung digojog dengan baik. Kadar hambat minimum (KHM) adalah konsentrasi terendah antibiotik yang menghambat pertumbuhan bakteri, ditandai dengan tidak adanya kekeruhan visual dibandingkan dengan kontrol negatif. e. Kadar bunuh minimum (KBM) adalah konsentrasi terendah antibiotik yang membunuh sebagian besar (99,9%) inokulum bakteri. KBM ditetapkan dengan menggoreskan 50 μl suspensi dari semua tabung yang jernih pada uji dilusi (penentuan KHM) ke plate agar yang terpisah. Setelah inkubasi 37oC selama 18-24 jam, jumlah koloni yang 55
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
tumbuh pada masing-masing plate dicatat. Konsentrasi pertama yang menghasilkan kurang dari 25 koloni dianggap sebagai KBM (Qaiyumi, 2007; Smith, 2004) 2. Dilusi padat a. Siapkan suspensi kuman seperti pada dilusi cair b. Buat beberapa pengenceran antibiotika. c. Lelehkan media padat. Dinginkan sampai temperatur kurang lebih 50550C. Ambil 90 ml media tambahkan 10 ml larutan pengenceran antibiotik, kocok. Tuangkan ke petri steril kurang lebih 25 ml. Biarkan 3-5 menit sampai mengeras. d. Ambil kapas lidi, celupkan pada suspensi kuman, tekan-tekan pada pinggir tabung supaya tidak menetes. Usapkan pada permukaan media sampai merata. e. Inkubasi 370C 18-24 jam. Kemudian lihat pertumbuhan kuman. III.
ALAT DAN BAHAN a. Alat 1. Lampu spiritus 2. Inkubator 3. Mikropipet 4. Tabung reaksi 5. Rak tabung reaksi b. 1. 2. 3. 4. 5.
Bahan Kultur cair bakteri Blue tips tips Larutan antibakteri Media BHI cair Etanol 70%
56
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Tabel 10. Pelarut dan Pengencer Antibiotik Antibiotik 1. Ampicilin 2. Carbenicillin 3. Cephalotin 4. Chloramphenicol 5. Clindamycin 6. Cycloserine 7. Erytromycin 8. Ethambutol 9. Flucilosin Saline 10.Gentamycin Buffer Fosfat 11.Isoniazed 12. Kanamycin 13. Nalidixic acid 14. Nitro furantoin 15. Oxacillin 16. P. Amino Salisilat 17. Penicillin 18. Polymixcyn 19. Rifampicin 20. Streptomycin 21. Sulfon Amide 22. Tetracyclin 23. Vancomycin
IV.
Pelarut Pengencer Buffer fosfat pH 8.0 + 0,14 Buffer fosfat 0,1 M Akuades Akuades Buffer fosfat 0,1 M pH 6.0 Akuades Ethanol Akuades Akuades Akuades Akuades Akuades Ethanol Akuades Akuades Akuades Saline 0,85 % Akuades Buffer fosfat 0,1 M pH 8.0 Akuades Akuades Akuades Buffer fosfat 0,1 M pH 8 Akuades NaOH 1 N Akuades Limethyl paramide Akuades Akuades Akuades Akuades Akuades Akuades Akuades Akuades Buffer phospat pH 7 Dimethyl sulfoxid Akuades Akuades Akuades Akuades panas + sedikit NaOH Akuades 10% Akuades Akuades Akuades Akuades
CARA KERJA 1. Semprot area kerja dengan etanol 70% dan lap sampai kering. 2. Siapkan 9 tabung steril dan beri nomor 1-9. 3. Tabung no. 2-9 masing-masing diisi 0,5 ml BHI steril 4. Tabung no.1 diisi 1 ml larutan antibakteri 5. Tabung no. 2 ditambah 0,5 ml larutan antibakteri dari tabung no. 1, campur homogen. 6. Ambil 0,5 ml larutan dari tabung no. 2 lalu masukkan ke dalam tabung no. 3, campur homogen. 7. Ambil 0,5 ml larutan dari tabung no. 3 lalu masukkan ke dalam tabung no. 4, campur homogen.
57
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
8. Lakukan seterusnya sampai tabung no. 7, campur homogen, ambil 0,5 ml dan buang. 9. Tambahkan 0,5 ml suspensi bakteri dalam media BHI (106 CFU/ml) ke dalam tabung no. 1-8 Tabung kontrol: Tabung no. 8 (K1): berisi 0,5 ml media BHI + 0,5 ml suspensi bakteri Tabung no. 9 (K2): berisi 0,5 ml media BHI 10. Inkubasi semua tabung (termasuk tabung kontrol) pada suhu 37C selama 18-24 jam. 11. Gojog tiap tabung dan amati pertumbuhan bakteri (kekeruhan pada tiap tabung). Media yang jernih menandakan tidak ada pertumbuhan bakteri yang terlihat. 12. Tentukan nilai KHM larutan antibakteri yang diuji (Gambar 16).
KERUH
JERNIH KHM
http://www.bsac.org.uk/wpcontent/uploads/2015/12/Susceptibility-testing-methods.pdf
Gambar 16. Hasil uji dilusi cair dan penentuan nilai KHM
58
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
MODUL 9 PENETAPAN ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) EKSTRAK I.
II.
III.
IV.
CAPAIAN PEMBELAJARAN Mahasiswa mampu melakukan uji dan menetapkan angka lempeng total ekstrak. DASAR TEORI Angka lempeng total merupakan salah satu parameter non spesifik ekstrak, yaitu aspek yang tidak terkait dengan aktivitas farmakologi secara langsung namun mempengaruhi aspek keamanan dan stabilitas ekstrak dan sediaan yang dihasilkan. ALT menunjukkan jumlah koloni bakteri aerob mesofil per gram sampel, setelah sampel diinokulasikan pada media lempeng agar dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang sesuai. Terdapat batasan nilai ALT dari BPOM RI baik terhadap bahan baku ekstrak maupun sediaannya. ALAT DAN BAHAN I. Alat 1. Laminar air flow (LAF) 2. Lampu spiritus 3. Inkubator 4. Mikropipet 5. Tabung reaksi steril
6. Rak tabung reaksi 7. Cawan Petri steril 8. Neraca analitik 9. Labu takar 10. Microwave atau kompor
II. 1. 2. 3.
4. Media plate count agar (PCA) 5. Blue tips
Bahan Ekstrak Etanol 70% Pepton dilution fluid (PDF)
CARA KERJA 1. Semprot permukaan dalam LAF dengan etanol 70% dan lap sampai kering. 2. Semprot alat dan bahan yang akan digunakan dengan etanol 70% lalu masukkan ke dalam LAF. 3. Nyalakan lampu UV selama 15 menit. 4. Siapkan 6 tabung reaksi steril di dalam LAF. 59
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
5. Timbang 1 gram ekstrak lalu masukkan ke dalam labu takar 10 mL. Tambahkan larutan PDF sampai tanda, gojog sampai homogen (disebut pengenceran 10-1). 6. Masukkan suspensi ekstrak tersebut ke dalam tabung reaksi steril (tabung 1). 7. Masukkan 9 ml PDF ke dalam tabung reaksi 2-6. 8. Gojog tabung 1 dan ambil 1 ml suspensi ekstrak (10-1) lalu masukkan ke dalam tabung 2 (10-2). 9. Gojog tabung 2 dan ambil 1 ml suspensi ekstrak (10-2) lalu masukkan ke dalam tabung 3 (10-3). 10. Gojog tabung 3 dan ambil 1 ml suspensi ekstrak (10-3) lalu masukkan ke dalam tabung 4 (10-4). 11. Gojog tabung 4 dan ambil 1 ml suspensi ekstrak (10-4) lalu masukkan ke dalam tabung 5 (10-5). 12. Gojog tabung 5 dan ambil 1 ml suspensi ekstrak (10-5) lalu masukkan ke dalam tabung 6 (10-6). 13. Cairkan media PCA menggunakan microwave atau kompor. Tunggu sampai hangat (45 ± 1oC). 14. Pipet suspensi dengan pengenceran 10-1-10-6 sebanyak 1 ml lalu masukkan tiap pengenceran ke dalam cawan Petri steril. 15. Tuang 20 mL PCA hangat ke dalam cawan Petri steril yang telah berisi 1 ml suspensi ekstrak dengan pengenceran 10-1-10-6. 16. Goyang dan putar cawan Petri sedemikian rupa hingga suspensi tersebar merata. Diamkan hingga memadat. 17. Lakukan uji sebanyak 2 kali (duplo). 18. Tuang 20 ml media PCA hangat ke dalam cawan Petri steril dan diamkan hingga memadat (kontrol media). 19. Masukkan 1 ml PDF ke dalam cawan Petri steril lalu tambah dengan 20 ml media PCA hangat, goyang dan putar hingga PDF tersebar merata. Diamkan hingga memadat (kontrol pengencer). 20. Setelah media memadat, cawan petri inkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-28 jam dengan posisi terbalik. Amati dan hitung jumlah koloni yang tumbuh. Penghitungan Cawan Petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 30-300 dipilih. Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai 60
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Angka Lempeng Total dalam setiap gram contoh. Bila ditemui jumlah koloni kurang dari 30 atau lebih dari 300, maka diikuti petunjuk sebagai berikut: (1) Bila hanya salah satu diantara kedua cawan yang menunjukkan jumlah antara 30-300 koloni, dihitung rata-rata dari kedua cawan dan dikalikan dengan faktor pengenceran. (2) Bila pada cawan petri dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah antara 30-300 koloni, maka dihitung jumlah koloni dan dikalikan faktor pengenceran kemudian diambil angka ratarata. Jika pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapati jumlah kolonilebih besar dari dua kali jumlah koloni yang seharusnya, maka dipilih tingkat pengenceran terendah missal pada pengenceran 10-2 diperoleh 140 koloni dan pada pengenceran 10-3 diperoleh 32 koloni, maka dipilih jumah koloni pada tingkat pengenceran 10-2. (3) Bila dari seluruh cawan petri tidak ada satupun yang menunjukkan jumlah antara 30-300 koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat pengenceran terendah dan dihitung sebagau Angka Lempeng Total Perkiraan. (4) Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan dan bukan disebabkan karena faktor inhibitor, maka Angka Lempeng Total dilaporkan sebagai kurang dari satu dikalikan faktor pengenceran terendah. (5) Bila jumlah koloni per cawan lebih dari 3000, maka cawan dengan tingkat pengenceran tertinggi dibagi dalam beberapa sektor (2,4, atau 8). Jumlah koloni dikalikan dengan faktor pembagi dan faktor pengencerannya, hasil dilaporkan sebagai Angka Lempeng Total Perkiraan. (6) Bila jumlah koloni lebih dari 200 pada bagian cawan, maka jumlah koloni adalah 200 x 8 x faktor pengenceran. Angka Lempeng Total Perkiraan dihitung sebagai lebih besar dari jumlah koloni yang diperoleh.
61
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
MODUL 10 PEMERIKSAAN AIR MINUM SECARA BAKTERIOLOGIK I.
II.
CAPAIAN PEMBELAJARAN Mahasiswa dapat melakukan pemeriksaan menentukan kelayakannya untuk dikonsumsi.
air
minum
dan
DASAR TEORI Macam-macam standard dan tes yang digunakan untuk pemeriksaan air tergantung pada penggunaan air untuk minum, renang, produksi /pengolahan ikan, industri. Flora bakteri di dalam air minum sangat bermacam-macam dan tidak sama pada setiap contoh air. Karena itu sebaiknya perlu diadakan pemeriksaan yang teratur terhadap air minum. Bila dari pemeriksaan suatu laboratorium dinyatakan baik (pemeriksaan tunggal), belum tentu air tersebut baik sebagai air minum. A. Standar Air Minum Standard yang dipakai adalah WHO. Semua sampel tidak boleh mengandung E. coli dan sebaiknya juga bebas dari bakteri Coliform. Standard dari WHO tersebut ialah : 1. Dalam setiap tahun, 95 % dari sampel-sampel tidak boleh mengandung Coliform dalam 100 ml. 2. Tidak ada sampel yang mengandung E. coli dalam 100 ml. 3. Tidak ada sampel yang mengandung Coliform lebih dari 10 dalam 100 ml. 4. Tidak boleh ada Coliform dalam 100 ml dari dua sampel yang berurutan. B. Frekuensi Sampling Sering mengambil sampel dan diperiksa dengan cara yang sederhana lebih baik daripada jarang mengambil sampel walaupun cara pemeriksaannya lebih lengkap. Pengambilan sampel perlu ditingkatkan bila keadaan : 1. Sangat panas. 2. Kecepatan aliran berkurang. 3. Hujan deras terus menerus. 4. Angin kencang. 5. Angin berdebu. 62
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
C. Metode Sampling dan Pengirimannya Pada waktu sampling, harus selalu dijaga agar tidak terjadi kontaminasi. Untuk itu digunakan botol steril yang tertutup (screw cup) yang dibalut dengan celophan sebelum diautoklaf. Bila yang akan diambil air yang telah diklorinasi, botol diberi sedikit larutan Na2S2O3, misalnya 0,1 ml dari 3 % Na2S2O3 tiap 100 ml air sebelum disterilkan. Petunjuk untuk sampling adalah sebagai berikut : 1. Botol steril tidak boleh dibuka sebelum akan digunakan untuk mengambil sampel dan tidak boleh dicuci dulu sebelum diisi sampel. 2. Perekat pada tutup dibuka. 3. Tutup dibuka, dijaga agar jari-jari tidak menyentuh mulut botol atau permukaan tutup botol bagian dalam. 4. Botol segera diisi dengan air dan ditutup kembali seperti semula. Harus diberi ruang udara dalam botol agar populasi bakteri dalam udara tersebut juga ikut bercampur dengan air. 5. Sampel dari kran Buka penutup kran (kalau ada) bersihkan bagian luar dan dalam dari kran. Alirkan air selama 2-3 menit sebelum mengisi botol penampung. 6. Sampel dari sungai, mata air, danau, bak persediaan atau sumur Harus dilakukan agar mendapatkan sampel yang representatif dari air yang digunakan konsumen. Oleh karena itutidak tepatbila pengambilan sampel sangat dekat dengan sumber/tempat persediaan air atau tempat keluarnya. Aliran/arus pada daerah yang stagnasi harus dihindari dan dihindari pula perusakan tempat persediaan air. Bila mengambil air dalam volume yang besar digunakan sampling stick. Botol diikat pada ujung tongkat yang panjangnya 4-8 kaki dan tutupnya dibuka. Botol dimasukkan secara cepat sedalam satu kaki dari permukaan dengan menghadap ke bawah, botol akan segera bergerak dengan mulut botol. Jika sudah penuh, botol segera diangkat dari air dan segera ditutup. Jika tidak digunakan sampling stick, masukkan botol dekat dasar dengan tangan. Tenggelamkan botol dalam air sedalam 3 cm dan gerakkan botol dalam air menentukan arus.
63
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
7. Sampel dari pompa tangan Pompa digerakkan 5 menit sebelum diambil sampelnya. Permukaan pompa dibakar dulu. Sampel ditampung langsung dari pompa ke botol. Besar Sampel Volume minimum yang diperlukan untuk analisis dari semua jenis air adalah 100 ml. Jika akan diperiksa adanya patogen misalnya Salmonella, volume sampelnya 500 ml. Pengiriman Sampel Sampel segera dimasukkan ke dalam portable ice box pada central cannister. Di sekitar cannister diletakkan es yang dipotong-potong atau dry ice. Bila lama pengiriman (dari pengambilan sampai laboratorium) kurang dari 4 jam, tidak perlu temperatur seperti refrigator, tapi cukup dijaga dalam keadaan dingin selama perjalanan. Laboratorium harus menerima kabar waktu pengiriman dan harus disertai form yang lengkap pada sampel. D. Pengujian Bakteriologik dari Air Minum. Pengujian bakteriologik ini terutama berhubungan dengan kesehatan lingkungan dalam usaha membasmi bakteri patogen dalam air minum. Oleh karena kuman patogen biasanya ada dalam jumlah kecil, maka tidak sesuai bila digunakan sebagai standar untuk pengujian, sehingga bakteri yang berasal dari faeses dipakai sebagai indikator adanya bakteri patogen yang berasal dari perut. Kuman patogen dapat berasal dari manusia, binatang (piaraan dan liar) dan burung, walaupun demikian tidak dapat diasumsikan bahwa air dari persedian yang tertutup untuk pabrik (diisolasi) dan distok akan bebas dari kuman perut, walaupun biasanya derajat kontaminasi jauh berkurang. Yang biasa digunakan sebagai indikator dari populasi faeses adalah E. coli, juga Streptococcus faecalis, Clostridium perfingens dan virus perut. Ada beberapa metode pemeriksaan air minum, diantaranya : 1. Metode Most Probable Number (MPN)/Angka Paling Mungkin (APM) Golongan coliform termasuk bakteri batang Gram negatif yang tidak membentuk spora dan fakultatif anaerob, yang tumbuh dengan adanya garam empedu dan memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam pada 37C, oksidase negatif. E.coli adalah salah satu grup coliform yang 64
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
dapat memfermentasi laktosa dengan membentuk asam dan gas pada 44C, indol positif, tidak dapat menggunakan citrat, menghasilkan asam dari manitol pada 37C, MR positif, VP negatif. Media yang dipergunakan : a. LB (Lactose Broth, Gibco b. BGLB (Brilian Green Lactose Broth) Beef extract 3,5 g Pepton Pepton 5,0 g Lactose Lactose 5,0 g Ox gall Distilled Water 1 L Briliant Green Distilled Water 1 L Catatan : Untuk memudahkan pembacaan, tabung II yang sudah diberi satu tetes cairan dari tabung I yang menghasilkan gas diletakkan tepat di belakang tabung tahap I tersebut, serta seluruh tabung tahap I ikut dieramkan lagi bersama tabung tahap II. Hal ini sangat perlu untuk menghitung jumlah coliform. Jumlah coliform (Tabel 9) dapat dilihat dengan dari buku : Standar Method for The Examination of Water and Waste Water. Edition, 1971, Michael J. Taras. MPN INDEX AND 95 % Conference limits for various combination of positive and geatif result when three 100 ml portions, three 1 ml portions and three 0,1 portions are used. 2. Filtrasi Membran Sebagian besar laboratorium menggunakan metode ini jika kekeruhan air memerlukan filtrasi. Sejumlah volume air yang cocok, difiltrasi melalui membran steril. Volume aliquot untuk air kualitas tinggi adalah 50 - 100 ml, sedangkan untuk kualitas rendah dan air terkontaminasi yang telah diencerkan ialah 10 ml. Jumlah koloni pada membran yang baik untuk dihitung ialah 10-80 koloni. Keuntungan dari metode membran ini ialah dapat dikerjakan dengan cepat seBAB lebih baik memeriksa dengan frekuensi yang lebih banyak dengan metode sederhana daripada dengan metode yang lebih rumit seperti metode MPN.
65
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
a. Prosedur Umum Simpan air dalam pendingin sampai siap diperiksa. Digunakan membran asetat (0,45) pada filter stainles steel. Cuci dengan akuadest steril setiap ganti air yang difiltrasi dan harus diganti sesudah dipakai 6 sampel. 1. Saring sejumlah volume tertentu yang sesuai melalui membran steril. 2. Gunakan pompa vakum. Dengan tang steril, ambil membran dan letakkan pada media dengan menempelkan bagian yang mengandung bakteri pada agar, hati-hati agar tidak terjadi gelembung udara antara membran dan agar. 3. Inkubasikan dan hitung koloni. Hitung jumlah koloni per 100 ml sampel, dengan anggapan 1 koloni berasal dari membran. b. Konfirmasi Koloni dan Perhitungan Kuman Sebagian koloni adalah khas, 5-100 % adalah tetap tergantung pada jumlah seluruh koloni. Bila ada koloni yang jelas berbeda morfologinya, tiap grup dihitung dan ditetapkan terpisah (ditetapkan sendiri-sendiri). Bila koloni dianggap campuran, gunakan metode seperti pada The Bacteriological Examination of Water Supply Sample.
66
Modul Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2021
Tabel 11. Jumlah Tabung yang Memberikan Reaksi Positif pada Pemeriksaan Air Minum MPN INDEX 3 of 10 mL 3 of 1 mL each 3 of 0,1 mL MPN per 100 each each mL 0 0 0
