Pewarnaan Kapsul Linny [PDF]

Citation preview

Pewarnaan Kapsul Linny Luciana Pembimbing: dr. July Kumalawati, SpPK(K), DMM Latar Belakang Banyak bakteri, termasuk gram positif dan gram negatif dikelilingi oleh lapisan polisakarida yang disebut glikokaliks. Bila komposisi lapisan ini terikat erat dan tetap melekat pada sel, maka disebut sebagai kapsul. Jika lapisan tersebut melekat dengan longgar dan sulit terlihat maka disebut dengan slime layer atau lapisan lendir. Kapsul biasanya terdiri dari polisakarida, namun juga mengandung polialkohol dan poliamin (polipeptida), misalnya Bacillus anthracis yang tersusun dari polimer asam amino. Perlu diingat bahwa polisakarida pada kapsul bakteri adalah molekul yang sangat terhidrasi yang mengandung lebih dari 95% air. Dengan demikian, kapsul paling baik ditunjukkan dalam persiapan tanpa fiksasi panas karena panas akan menyebabkan distorsi dan penyusutan kapsul. Berbagai fungsi kapsul bakteri yaitu proteksi terhadap lingkungan, adhesi ke struktur spesifik, dan pembentukan biofilm. Kapsul juga sering berperan dalam patogenisitas sebagai faktor virulensi untuk melindungi sel dari fagositosis dan/atau agen bakterisidal. Contoh bakteri berkapsul yang sering dijumpai pada praktik klinis sehari-hari dapat diingat dengan singkatan: Even Some Killers Have Pretty Nice Capsules. 



Escherichia coli







Salmonella typhi/Streptococcus pneumoniae







Klebsiella pneumoniae







Haemophilus influenzae







Pseudomonas aeruginosa







Neisseria meningitidis







Cryptococcus neoformans



Kebanyakan bakteri yang memiliki kapsul ialah bakteri Gram-negatif, namun ada juga beberapa bakteri Gram-positif yang memiliki kapsul, diantaranya: 



Bacillus megaterium (kapsul campuran popipeptida dan polisakarida)







Streptococcus pyogenes (kapsul asam hialuronat, mikrokapsul)







Streptococcus pneumoniae (kapsulnya ialah dasar vaksin pneumonia)







Streptococcus agalactiae (kapsul asam sialat)







Staphylococcus epidermidis (variable)



Prinsip Seringkali metode pewarnaan kapsul dilakukan dengan menggunakan salah satu atau kombinasi berikut ini: (1) zat warna basa yang berinteraksi dengan sel bakteri yang bersifat basofilik, (2) mordant yang menyebabkan presipitasi bahan kapsul, misalnya ion logam, alkohol, dan asam asetat, dan (3) pewarnaan berbasis asam yang digunakan untuk mewarnai latar belakang kuman. Tidak seperti sitoplasma atau dinding sel bakteri, kapsul bersifat non-ionik, sehingga tidak akan terwarnai oleh baik zat warna positif maupun negatif. Oleh karena itu, mudahnya, cara terbaik untuk visualisasi kapsul ialah dengan mewarnai isi sel bakteri menggunakan zat warna basa dan latar belakangnya menggunakan zat warna asam. Terdapat 2 jenis metode pewarnaan, yaitu metode Anthony dan metode Maneval. Prosedur Pewarnaan Kapsul: Metode Anthony Pada pewarnaan kapsul Anthony, kristal violet digunakan sebagai zat pewarna utama yang berikatan dengan sel bakteri sekaligus protein pada broth di sekelilingnya, dengan tembaga sulfat yang berfungsi sebagai mordant sekaligus decolorizer. Nantinya, sel bakteri dan latar belakangnya akan terwarnai oleh kristal violet, sementara kapsul yang tidak terwarnai akan tampak terang. Langkah Pengerjaan: 1. Siapkan smear dari kultur 12 - 18 jam yang ditanam dalam media cair berbasis protein seperti milk broth. 2. Biarkan mengering di udara. Jangan dipanaskan (untuk menghindari kerusakan atau distorsi kapsul atau menyebabkan kapsul menjadi menyusut). 3. Genangi slide dengan kristal violet 1% selama 1-2 menit. 4. Bilas hati-hati dengan larutan tembaga sulfat 20%. 5. Keringkan di udara.



6. Periksa slide dengan pembesaran 1000x dengan minyak emersi. Sel bakteri dan latar belakang protein akan tampak berwarna keunguan sementara kapsul akan tampak transparan/terang.



Gambar 1. Kapsul Serratia marcescens yang diwarnai dengan metode Anthony.



Gambar 2. Bacillus megaterium yang diwarnai dengan metode Anthony (tidak berkapsul). Metode Maneval Pada metode pewarnaan kapsul Maneval, zat pewarna dasar yang berinteraksi dengan sel bakteri adalah fuchsin, dengan counterstaining Congo Red. Pada prosedur pewarnaan kapsul Maneval, sel bakteri pertama kali dipajankan dengan setetes solusio Congo Red pada kaca objek. Congo Red adalah indikator pH yang berwarna biru pada pH di bawah 3.0 dan merah di atas pH 5.2. Pada langkah ini, Congo Red mengering untuk membentuk latar belakang merah pada kaca objek. Setelah itu, larutan Maneval (campuran asam asetat dan fuchsin) ditambahkan ke slide. Asam asetat menurunkan pH dalam sampel dan menyebabkan Congo Red berubah dari warna merah menjadi biru. Fuchsin yang berada di dalam sel bakteri mewarnai sel menjadi merah terang. Asam asetat juga berfungsi sebagai mordant untuk menstabilkan struktur kapsul. Kapsul menjadi tidak terwarnai dan nampak sebagai halo terang di sekeliling sel bakteri. Langkah pengerjaan: 1. Tempatkan beberapa tetes Congo red pada slide. 2. Tambahkan kuman dari kultur ke slide. 3. Keringkan di udara. 4. Genangi smear dengan larutan Maneval dan tunggu 5 menit.



5. Angkat dan tiriskan zat warna berlebih. 6. Bilas dengan air secara hati-hati 7. Keringkan di udara. 8. Periksa slide dengan perbesaran 1000x dan minyak imersi.



Gambar 3. Kapsul Bacillus sp. yang diwarnai dengan metode Maneval.



Gambar 4. Staphylococcus epidermidis yang diwarnai dengan metode Maneval (tidak berkapsul).



Catatan Penting: 1. JANGAN pernah memfiksasi sediaan smear di atas api. 2. JANGAN pernah membilas sediaan yang diwarnai dengan air. 3. Pada beberapa sumber, metode Anthony dapat dimodifikasi sehingga latar belakang sel menggunakan Congo Red atau nigrosin atau tinta india, sehingga biasanya tidak diperlukan broth berbasis protein lagi.



Gambar 5. Kapsul Klebsiella pneumoniae dengan kombinasi kristal violet dan tinta india tipis. Perhatikan sel bakteri yang berwarna ungu, latarbelakang abu-abu tipis, dan kapsul yang tidak berwarna.



Gambar 6. Pewarnaan kriptokokus, dengan menggunakan pewarnaan negatif sederhana untuk memvisualisasi kapsul. 4. Untuk organisme yang morfologinya khas seperti kriptokokus, cukup digunakan pewarnaan negatif sederhana untuk memvisualisasi kapsul. 5. Methylene blue, malachite green, safranin, atau zat warna basa lainnya juga dapat digunakan sebagai alternatif kristal violet.



Menarik Diketahui 1: Reaksi Quellung Reaksi Quellung atau yang disebut juga reaksi Neufeld merupakan salah satu metode yang meningkatkan visualisasi kapsul bakteri di bawah mikroskop. Caranya adalah dengan menambahkan serum anti-kapsul spesifik ke sediaan mikrobiologis yang akan diperiksa. Kapsul bersifat antigenik, sehingga reaksi antara kapsul dan antibodi antikapsul akan menyebabkan presipitasi dan membuat kapsul bakteri menjadi lebih opak dan tampak membengkak. Reaksi ini bermanfaat untuk mengidentifikasi bermacam-macam serotipe kapsul kuman terutama S. pneumonia, walaupun saat ini telah mulai digantikan oleh metode aglutinasi lateks dan PCR di lab-lab modern. Menarik Diketahui 2: Antigenisitas Kapsul Polisakarida tidak terlalu bersifat antigenik dan tidak terlalu mencetuskan memori sel T. Oleh karena itu, vaksin berbasis kapsul biasanya menggunakan polisakarida yang dikonjugasikan dengan carrier protein, agar reaksi imun yang terbentuk lebih kuat.



Gambar 5. Reaksi Quellung-Neufeld (kiri: positif, kanan: negatif) Sumber Bacaan 1. Hughes RB, Smith AC. Capsule Stain Protocols. American Society of Microbiology (ASM):http://www.asmscience.org/content/education/protocol/protocol.3041;



jsessionid=CBClGkBWC0erLTX-Ylh4ghGn.x-asm-books-live-01. Published September 2007. 2. Breakwell DP, Moyes RB, Reynolds J. Differential staining of bacteria: capsule stain. In: Current Protocols in Microbiology (Appendix 31). 2009. Philadelphia: Wiley and Sons. p.15:A.3I.1-A.3I.4