Pirogen Dan Depirogenisasi [PDF]

Citation preview

PIROGEN DAN DEPIROGENISASI



definisi ■ Pirogen di definisikan sebagai suatu produk yang bersifat termostabil, dapat difiltrasi (filtrable) dan larut air dari sisa bakteri pada sediaan injeksi yang dapat menghasilkan reaksi pirogenik. ■ Dapat berupa antigen atau kompleks polisakarida bakteri ■ Dapat dihasilkan oleh bakteri, kapang dan khamir



Efek pirogen bagi tubuh • demam • rusaknya sel-sel endotelial • permeabilitas pembuluh darah berubah sehingga menyebabkan turunnya tekanan darah



Sumber pirogen ■ Air destilasi yang terkontaminasi bakteri yang terbawa oleh udara yang dapat tumbuh dan memproduksi endotoksin



■ Permukaan Wadah yang digunakan ■ Zat terlarut (dextrosa atau NaCl yang dapat mengandung pirogen.



depirogenisasi ■ Solvent → destilasi ■ Solute → rekristalisasi ■ Alat →



■ Produk → Penggunaan adsorben → Adsorpsi permukaan ■ Filter asbestos



filtrasi melalui filter pad ■ Arang aktif 0,1 % serbuk arang aktif → aduk 5-10 menit → dekantasi atau difiltrasi.



Uji pirogen ■ Uji pirogen pada kelinci ■ menggunakan kelinci dewasa yang sehat untuk menentukan ada atau tidaknya pirogen dalam produk yang dapat di toleransi oleh kelinci. ■ Tiga kelinci digunakan; tiapnya diberikan 10 mL larutan uji/kg secara injeksi melalui vena telinga, pemberian injeksi harus diselesaikan < 10 menit. Suhu rektal dicatat pada 1,2 dan 3 jam setelah injeksi. Syarat hasil uji : Larutan uji tidak memenuhi syarat jika jumlah respon melebih (oC)



Jumlah kelinci



Larutan uji memenuhi syarat jika jumlah respon tidak melebih (oC)



3



1,2



2,7



6



2,8



4,3



9



4,5



6,0



12



6,6



6,6



Perkembangan regulasi tentang uji pirogen ◼



◼ ◼



◼



Bacterial endotoxin test (BET) merupakan salah satu uji yang penting terhadap produk parenteral dan alat kesehatan 1912 : uji pirogen dilakukan dengan metode kelinci (Rabbit test) Digunakan dalam USP XII pada tahun 1942 sampai 40 tahun kemudian 1980 : metode baru diterapkan yaitu Limulus amoebocyte lysate (LAL) test



LAL-test ◼



◼



The Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah uji in vitro untuk deteksi dan analisis kuantitatif endotoksin bakteri. Metode analisis LAL yang dilakukan mencakup teknik gel-clot dan turbidimetri kinetik dan kromogenik (kolorimetri)



Metode LAL yang direkomendasi FDA ◼ ◼



◼



Metode Gel-Clot : prinsip bahwa LAL menggumpal dengan adanya endotoksin Metode kinetik turbidimetri : menggunakan kecepatan pembentukan gel untuk menentukan kandungan endotoksin Metode Kromogenik : menggunakan substrat kromogenik sintetik, dengan adanya LAL dan endotoksin, menghasilkan warna kuning dan secara linier ekuivalen dengan konsentrasi endotoksin yang ada



Prinsip LAL test • •



•



Uji LAL memanfaatkan dasar respon imun dari kepiting landam kuda terhadap invasi bakteri gram negatif. Bahan-bahan yang terkandung dalam amubosit kepiting landam kuda terdiri dari berbagai protein, faktor, kofaktor dan ion-ion yang berinteraksi menyebabkan koagulasi Endotoksin Gram negatif mengkatalisis aktivasi proenzim dalam lisat amubosit Limulus. Kecepatan awal aktivasi ditentukan oleh konsentrasi endotoksin



◼



◼



Selanjutnya enzim yang diaktivasi (enzim koagulase) menghidrolisis ikatan spesifik dalam suatu protein penggumpal (koagulogen) yang juga terdapat pada lisat amubosit Limulus menghasilkan koagulin. Sekali terhidrolisis, koagulin yang dihasilkan bergabung dengan sendirinya dan membentuk suatu gumpalan/bekuan seperti gel



Mengapa LAL test? ◼



◼



Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah metode alternatif terhadap rabbit pyrogen test yang difokuskan pada deteksi senyawa pirogen dalam produk, untuk menghindari penggunaan hewan/binatang dalam percobaan Metode lebih akurat



Limulus amebocyte lysate ◼



Lisat diperoleh dari amubosit kepiting landam kuda (Limulus polyphemus)



◼



Penggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawal dari pengamatan Bang (1956) bahwa infeksi bakteri gram negatif pada Limulus polyphemus menyebabkan koagulasi intravaskular yang parah.



◼



Th 1964, Levin and Bang kemudian menunjukkan bahwa penggumpalan itu merupakan hasil reaksi antara endotoksin dan protein yang dapat menggumpal dalam amubosit.



◼



Solum (1970, 1973) dan Young (1972), melakukan pemurnian dan karaterisasi protein yang dapat bergumpal dari reaksi LAL dan menunjukkan bahwa reaksi dengan endotoksin merupakan reaksi enzimatik.



Limulus polyphemus (horseshoe crab)



Cara memperoleh lysate ◼



◼



◼



Untuk memperoleh LAL, horseshoe crabs yang berukuran besar ditangkap, cek kesehatannya, lalu darahnya diambil dengan menggunakan jarum suntik. Darah kepiting ini lalu disentrifuga untuk memisahkan amoebocytes dari plasma cairnya. Amoebocyte lalu di freeze-dried dan diproses untuk digunakan. Harganya : One quart of LAL is worth $15,000! Tiga perusahaan USA :   



Associates of Cape Cod: http://www.acciusa.com Cambrex: http://www.cambrex.com/default.asp Charles River Endosafe: http://www.criver.com/products/endotoxin/index.html