Praktikum HA [PDF]

Citation preview

LAPORAN VIROLOGI UJI HEMAGLUTINASI (HA) & UJI HEMAGLUTINASI INHIBITION (HI)



Anggota Kelompok 4 : 1. Kadek Ika Surya Cahyani



P07134017006



2. Ni Putu Diana Sukma Dewi



P07134017008



3. Ni Made Narayani Dwi Lestari



P07134017028



4. Ni Made Dwi Priska Dana



P07134017030



5. Dewa Ayu Widiadnyasari



P07134017032



KEMENTRIAN KESEHATAN RI POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS 2019



BAB I PENDAHULUAN 1.1.



Tujuan 1. Tujuan Umum Untuk mengetahui cara melakukan Uji Hemaglutinasi (HA) 2. Tujuan Khusus a) Untuk dapat melakukan uji hemaglutinasi (Uji HA) dengan metode cepat dan metode mikrotiter b) Untuk dapat menghitung titer pengenceran virus yang terkecil



yang masih mampu mengaglutinasi eritrosit ayam. 2.1. Prinsip a) Uji Hemaglutinasi (HA) Uji HA untuk mengetahui suatu virus yang mempunyai kemampuan mengaglutinasi eritrosit atau untuk mengetahui titer virus dengan mengamati dasar sumuran paling akhir yang menunjukan adanya agregat, tanda adanya hemaglutinasi positif. b) Uji Hemaglutinasi Inbibition (HI) 2.2. Manfaat 1. Manfaat Teoritis Agar dapat menambah pengetahuan terutama dalam teknik Uji Hemaglutinasi (HA). Sehingga dapat menghitung titer pengenceran virus yang terkecil yang masih mampu mengaglutinasi eritrosit ayam dan mengetahui cara melakukan pengujian teknik uji HA. 2. Manfaat Praktis Dapat membantu dalam memahami teknik dan prosedur teknik Uji Hemaglutinasi (HA). Sehingga dapat menghitung titer pengenceran virus yang terkecil yang masih mampu mengaglutinasi eritrosit ayam dan mengetahui cara melakukan pengujian teknik uji HA.



BAB II TINJAUAN PUSTAKA Virus merupakan mikroorganisme terkecil yang memiliki ukuran bervariasi. Virus disebut sebagai parasit obligat karena virus mutlak



memerlukan sel hidup untuk menunjuang keperluannya hidupnya, oleh karena itu perbanyakan virus hanya dapat dilakukan dengan cara diisolasikan pada media hidup, misalnya: telur ayam bertunas (telur berembrio), pada biakan sel atau kultur jaringan, atau diisolasikan pada hewan percobaan atau menggunakan hospes alami (Prof. Dr. Drh. Gusti Ayu Yuniati, 2017). Virus dapat di biakkan dalam media kultur jaringan atau dalam telur berembrio dengan kondisi lingkungan yang dikendalikan. Virus akan melakukan



replikasi



menggunakan



komponen



makromolekular



untuk



mengambil energi sel hospes sehingga fungsi sel hospes terganggu (Radji, 2010). Telur berembrio seperti telur ayam berembrio (TAB) telah lama digunakan sebagai media isolasi virus (Githa Nurma Azzizl, Suwarno., et al. 2019). Identifikasi dapat dilakukan dengan berbagai uji, di antaranya uji hemaglutinasi dan hemaglutinasi inhibisi. Hemaglutinasi adalah terbentuknya agregat sel eritrosit oleh partikel hemaglutinin virus. Hal ini dapat terjadi karena ikatan antara protein luar virus hemagglutinin dengan reseptor permukaan eritrosit. Prinsip metodenya adalah mencampurkan satu sampai dua tetes virus dengan suspensi eritrosit. Hemaglutinasi biasanya akan tampak dalam waktu satu menit pada uji cepat. Proses hemaglutinasi sendiri berlangsung apabila virus dapat mengikat dua eritrosit secara simultan sehingga terbentuk semacam jembatan silang (cross bridge). Hal ini mengharuskan jumlah virus dan eritrosit yang ekuivalen (Fidyah Fitrawati dkk, 2015). Hemaglutinasi yang disebabkan oleh antibodi terhadap antigen pada permukaan sel darah merah. Misalnya untuk menentukan golongan darah dapat dilakukan reaksi hemaglutinasi. Beberapa virus tertentu mempunyai kemampuan untuk berikatan dengan permukaan sel darah merah dari spesies berbeda sehingga terjadi aglutinasi. Hemaglutinasi dimana sel darah merah hanya berfungsi sebagai pembawa antigen, sel darah merah tertentu dapat dilapiskan dengan antigen setelah permukaannya diubah sifatnya dengan asam tannin atau kromium klorida. Setelah antigen menempel pada permukaan sel darah merah, antigen ini dapat ditentukan dengan serum yang sesuai.



Keuntungan reaksi ini adalah memudahkan melihat hasil reaksi karena dilakukan dengan partikel-partikel yang besar. Reaksi ini disebut juga passive heamagglutination. Uji hemaglutinasi digunakan untuk menguji antigen, selanjutnya untuk mempersiapkan antigen 4 HA unit yang digunakan untuk uji HI (Gusti Ayu Yuniati K., et al, 2017). Uji HA dilakukan dengan tujuan untuk membedakan subtype HA dan mengukur nilai HA sediaan virus influenza. Pengukuran titer HA dilakukan pada saat kultur virus (beberapa titer virus yang berhasil dikultur), mengambil stok virus, sebelum melakukan uji HI, dan penentuan kadar 4 HAU untuk standarisasi antigen uji HI.



Gambar 1. Reaksi uji HA



Uji HA/HI merupakan uji baku dari OIE untuk meneguhkan diagnosa sementara dari kasus ND. Uji HA digunakan untuk mendeteksi protein hemaglutinin pada virus. Hemaglutinin (H) merupakan protein perlekatan virus ND yang berperan dalam mengaglutinasi eritrosit. Virus yang memiliki protein hemaglutinin adalah AI dan ND. Kegunaan lainnya dari uji HA adalah



sebagai dasar untuk menentukan titer virus Titer HA adalah pengenceran tertinggi yang masih dapat mengaglutinasi eritrosit. HA sempurna ditandai dengan tidak terjadinya pengendapan sel darah merah di dasar mikroplate, hal ini disebabkan karena aktivitas protein virus yang mengikat sel darah merah (Mahardika et al., 2015). Uji HA mikroteknik digunakan untuk mengetahui titer antigen (Santi Astuti Dwi Putri dkk, 2015). Uji Hemaglutinasi (HA), ada 2 jenis, yaitu uji HA cepat dan lambat. Uji HA cepat dilakukan dengan mencampur masingmasing 100 µl alantois telur dengan 200 µl media 5% Sel Darah Merah (SDM) ayam. Hasil positif ditunjukkan adanya penggumpalan darah untuk selanjutnya diuji dengan uji HA lambat untuk mengetahui titer HA virus. Uji HA lambat dilakukan dengan menggunakan alat microplate U buttom (Nunc) sesuai dengan standar yang berlaku. Mikroplate diisi dengan 25 µl PBS pH 7,2 pada sumur ke- 1-12. Cairan alantois diambil dari telur sebanyak 25 µl, dimasukkan ke dalam sumur sesuai nomor sampel uji. Cairan alantois diencerkan bertingkat kelipatan dua dengan PBS, kemudian ditambahkan 25 µl suspensi SDM ayam 0,5% ke dalam seluruh sumur. Tahap terakhir dilakukan pengocokan microplate dengan menggoyang-goyangkannya, lalu diinkubasi pada suhu ruang sekitar 30 menit. Pembacaan sampel uji dapat dilakukan jika SDM sumur kontrol telah teraglutinasi di dasar sumur. Sampel dinyatakan positif apabila SDM pada sumur sampel mengalami aglutinasi. Titer HA dihitung berdasarkan pengenceran tertinggi alantois yang dapat mengaglutinasi SDM (Angga Ari Wibowo dkk, 2012). Sebanyak 25 µl larutan PBS diisi ke dalam plat mikro lubang 1-12. Lalu dimasukkan antigen sebanyak 25 µl dari lubang pertama dengan menggunakan single channel, kemudian dihomogenkan. Campuran tersebut dipindahkan sebanyak 25 µl dari lubang pertama, ke lubang kedua, ke lubang ketiga, dan seterusnya sampai lubang ke-11. Hal ini tidak dilakukan pada lubang ke-12. Kemudian, ditambahkan lagi larutan PBS sebanyak 25 µl ke dalam lubang 1-12. Setelah itu dimasukkan RBC 5% sebanyak 25 µl ke



lubang nomor 1-12. Lalu ditunggu sampai terjadi agregasi pada lubang ke-12, kemudian dibaca hasil uji HA tersebut (Darmawi dkk, 2015). Interpretasi hasil pemeriksaan HA yaitu : a. Hasil HA positif : ditandai dengan adanya eritrosit yang menyebar pada dasar lubang di microplatedan berbentuk seperti endapan. b. Hasil HA negatif : ditandai dengan adanya eritrosit yang mengumpul ditengah lubang di microplate dan bila digoyangkan berbentuk seperti kancing (Santi Astuti Dwi Putri dkk, 2015). Titer HA adalah pengenceran tertinggi yang masih dapat mengaglutinasi eritrosit. HA sempurna ditandai dengan lapisan sel darah merah secara merata pada dasar sumuran microplate dan penjernihan dari cairan di bagian atas tanpa terjadinya pengendapan. Sedangkan hasil negatif menunjukan sel darah merah berbentuk titik di tengah sumuran. Beberapa virus mampu mengaglutinasikan sel darah merah. Kemampuan ini sebagai contoh dari aktivitas biologik dan aktivitas ini dapat dihambat oleh antibodi tertentu. Sisi partikel virus yang spesifik dapat berinteraksi dengan reseptor mukoprotein pada sel darah merah dan permukaan sel lain. Interaksi dari sisi reseptor dan virion membuat aglutinasi sel darah merah menjadi tampak. Enzim virus neuraminidase memecah ikatan antara virus dan sel, dan melepas keduanya ke dalam larutan (Gusti Ayu Yuniati K., et al, 2017). Reaksi positif ditandai dengan tidak terjadinya pengendapan pada dasar sumuran yang menunjukkan bahwa sel darah diaglutinasi oleh antigen virus (Suardana dkk, 2016). Reaksi positif ditandai dengan adanya bentukan kristal pada sumuran plat mikro akibat reaksi hemaglutinasi. Pembacaan titer HA dilakukan dengan memiringkan plat mikro ≥ 45o. Titer HA virus dinyatakan sebagai kebalikan dari pengenceran tertinggi virus yang masih mampu menimbulkan reaksi aglutinasi secara sempurna. Pada umumnya titer HA yang digunakan pada uji HI adalah 4 unit HI (Yuniati Kencana dkk, 2017).



Gambar 2. Hasil uji HA terhadap cairan allantois dari inokulasi suspensi virus. A. Dua suspensi cucian telur sampel FF/Sleman/2011 menunjukkan titer 2 unit HA. Masing-masing suspensi diuji sebanyak 3 baris. B. Suspensi uterus ayam sampel FF/Sleman/2011 dan SR/WNO/2011 keduanya menunjukkan titer 2 unit HA (Fidyah Fitrawati dkk, 2015).



Gambar 3. Reaksi Hemaglutinasi secara lebih rinci Faktor – faktor yang mempengaruhi hemaglutinasi berbeda-beda pada tiap virus. Faktorfaktor tersebut antara lain eritrosit hewan yang digunakan, pH pengencer, dan temperatur inkubasi. Faktor lainnya adalah pengenceran, volume, dan perlakuan serum (Fidyah Fitrawati dkk, 2015) Pemeriksaan terhadap adanya antibodi terhadap virus pada serum darah dapat dideteksi dengan Uji Hemagglutination Inhibition (HI).



Uji hambatan hemaglutinasi (Hemagglutination-inhibition/HI) merupakan uji yang dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antibodi di dalam darah. Karena pada uji ini digunakan antigen yang homolog sehingga akan terjadi ikatan antigen-antibodi, yang kemudian virus tidak akan dapat melekat atau berikatan dengan reseptor membran sel darah merah dan aglutinasi tidak akan terjadi. Uji HI mempunyai fungsi antara lain sebagai sarana untuk mengidentifikasi jenis antibodi tertentu dengan melihat reaksi antar antigen homolog yang telah diketahui dengan antibodinya, serta untuk mengetahui titer antibodi dengan cara mereaksikannya antara serum yang ingin diketahui antibodinya dengan antigen standar yang telah diketahui. (Elfidasari, Puspitasari, & Frisa, 2014) Uji HI memiliki dua metode yaitu metode α dan β. Metode α sering digunakan untuk menguji jenis antigen dengan melakukan pengenceran pada antigen. Kelebihan dari metode ini dapat mengidentifikasi antigen tanpa melakukan uji HA terlebih dahulu. Namun pada uji ini dibutuhkan antibodi dalam jumlah banyak dan titer yang cukup tinggi. Sedang metode β dapat digunakan untuk mengidentifikasi antibodi dan menghitung titer antibodi atau menguji jenis antigen dengan melakukan pengenceran pada antibodi dengan jumlah antigen tetap, jumlah antibodi yang digunakan sedikit dan dapat diketahui titer antibodinya, batas akhir pada pengenceran tertinggi yang mampu menghambat terjadinya aglutinasi secara sempurna disebut End point. (Elfidasari et al., 2014) Prinsip pengujian HI adalah antibodi yang dimiliki burung merpati terhadap virus akan mencegah pengikatan virus dengan sel darah merah. Oleh karena itu, hemaglutinasi dihambat ketika terdapat antibodi dalam serum burung merpati. Pengenceran tertinggi dari serum yang mencegah terjadinya hemaglutinasi disebut titer HI serum. Keberadaan antibodi AI pada serum dapat terdeteksi dengan uji HI setelah tujuh hari post infeksi atau vaksinasi. (Yesica, 2013) Prinsip uji HI adalah hambatan aglutinasi RBC oleh virus akibat terikatnya virus tersebut dengan antibodi spesifik. Oleh karena itu uji HI hanya bisa digunakan untuk virus yang mengaglutinasi RBC (Syukron et al., 2013).



Kencana et al. (2012) mengungkapkan bahwa virus famili Paramyxoviridae yang merupakan virus penyebab penyakit ND mempunyai sifat yang dapat mengaglutinasi sel darah merah unggas. Proses hemaglutinasi ini terjadi akibat aktivitas hemaglutinin yang terdapat pada amplop virus tersebut. Aktivitas hemaglutinasi berlangsung maksimal selama satu jam karena dipengaruhi oleh kerja enzim neuraminidase yang merusak ikatan pada reseptor eritrosit dengan hemaglutinin dari virus famili Paramyxoviridae. Pengamatan nilai titer antibodi dari serum sampel berdasarkan hasil pengenceran terbesar yang masih sanggup menghambat aglutinasi (RBC) oleh antigen. Hasil pemeriksaan menunjukkan bahwa titer antibodi bervariasi pada sebaran 21-29. Variasi ini dipengaruhi oleh beberapa kondisi seperti kesehatan ayam, jumlah virus yang menginfeksi, dan perbedaan waktu infeksi. Pengujian HI merupakan standar pengujian serologi AI untuk mendeteksi antibodi terhadap virus AI pada unggas dan mamalia. Dalam pengujian HI dibutuhkan beberapa variabel pengujian yang dapat mempengaruhi hasil dan akurasi pengujian yaitu microplate, pengenceran, pembacaan, interpretasi, antigen, antiserum dan sel darah merah. (Yesica, 2013) Dasar uji HI adalah reaksi ikatan antara antibodi yang terkandung dalam serum yang diperiksa dan jumlah antigen hemaglutinin AI yang digunakan sebanyak 4 HAU (Haemaggutination Unit). Aglutinasi sel darah merah oleh virus atau antigen AI dapat dihambat oleh antibodi atau zat kebal terhadap AI. Bila terdapat antibodi dalam jumlah mencukupi untuk membentuk kompleks dengan virion, hemaglutinasi dihambat. Sebaliknya bila antibodi terdapat dalam jumlah yang tidak mencukupi maka eritrosit akan diaglutinasi oleh antigen dan membentuk endapan. (Yesica, 2013) Dasar uji HI adalah adanya antibodi yang mampu menghambat proses hemaglutinasi oleh virus. Jumlah antibodi yang mencukupi dalam serum darah merpati,



mampu



membentuk



kompleks



dengan



virion



yang



dapat



menyebabkan hemaglutinasi terhambat dan eritrosit akan terlihat mengendap di dasar sumuran microplate. Bila jumlah antibodi tidak mencukupi maka eritrosit akan diaglutinasikan oleh virus dan terlihat adanya aglutinasi pada dasar sumuran microplate. (Yesica, 2013)



Metode kerja uji HI adalah pengenceran bertingkat serum sampel hingga pengenceran terbesar yang masih sanggup menghambat aglutinasi sel darah merah. Hasil positif jika tidak terjadi hemaglutinasi dan hasil negatif jika terjadi hemaglutinasi. Hasil yang didapat diformulasikan sehingga diketahui titer antibodinya sehingga dapat dibandingkan dengan standar titer protektif. (Yesica, 2013)



Gambar 4. Skema uji HI mikrotiter



Gambar 5. Prinsip uji hemaglutinasi Hasil uji HI positif ditandai dengan adanya endapan pada dasar microplate, tidak ada hemaglutinasi. Titer HI dihitung berdasarkan pengenceran tertinggi serum yang dapat menghambat terjadinya hemaglutinasi. Pemeriksaan serologi yang dilakukan dengan uji HI dianggap positif apabila titer antibodi ≥ 24 atau log24 dengan antigen 4 HAU (OIE,2012). Pengujian HI merupakan metode yang relatif murah dan sederhana untuk mengukur antibodi hemaglutinin spesifik pada serum yang sudah divaksinasi. (Yesica, 2013)



BAB III METODE PRAKTIKUM 3.1 Waktu dan Tempat Waktu : Jumat, 13 September 2019 Tempat :Laboratorium Bakteriologi Analis Kesehatan Politeknik Kesehatan Denpasar 3.2 Alat dan Bahan A. Alat dan bahan yang diperlukan Uji Hemaglutinasi Cepat Objek glass



Sebagai



tempat



untuk



pemeriksaan



hemaglutinasi cepat (Untuk melihat terjadinya reaksi aglutinasi antara suspense antigen virus dengan suspense sel darah merah 1%) Mikropipet



Sebagai



alat



yang



digunakan



untuk



memindahkan cairan/larutan dari satu tempat ke tempat lainnya dengan pengukuran volume yang sangat kecil secaara akurat dalam satuan µl Yellow tip



Sebagai pelengkap dari mikrotiter



PBS



Fungsi PBS pada uji hemaglutinasi cepat adalah digunakan untuk pembuatan control dan sebagai larutan penyangga



Suspensi antigen virus atau suspense bahan



Bahan yang digunakan untuk dilakukannya pemeriksaan



pemeriksaan Suspensi sel darah merah 1%



Digunakan untuk membuat virus-virus yang mempunyai



protein



hemaglutinasi



bereaksi



dengan reseptor pada sel darah merah. Uji Hemaglutinasi (Teknik Mikrotiter) Mikroplate (Plat mikro button “U”



Sebagai



tempat



untuk



pemeriksaan



hemaglutinasi secara teknik mikrotiter



Mikropipet



Sebagai



alat



yang



digunakan



untuk



memindahkan cairan/larutan dari satu tempat ke tempat lainnya dengan pengukuran volume yang sangat kecil secaara akurat dalam satuan µl Yellow tip PBS



Sebagai pelengkap dari mikrotiter Fungsi PBS pada uji hemaglutinasi cepat adalah digunakan untuk pembuatan control dan sebagai larutan penyangga



Suspensi antigen virus atau suspense bahan



Bahan yang digunakan untuk dilakukannya pemeriksaan



pemeriksaan Suspensi sel darah merah 1%



Digunakan untuk membuat virus-virus yang mempunyai



protein



hemaglutinasi



bereaksi



dengan reseptor pada sel darah merah. 3.3 Cara Kerja A. Uji Hemaglutinasi Cepat 1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan 2. Diambil gelas objek yang kemudian dibersihkan dengan tissue 3. Diteteskan satu tetes suspense antigen pada gelas objek 4. Kemudian diteteskan satu tetes suspense sel darah merah didekatnya 5. Pada penambahan suspense antigen dengan suspense sel darah merah harus sama jumlah suspense yang diteteskan 6. Selanjutnya dicampurkan kedua tetes tersebut dengan batang pengaduk (misalnya batang korek api atau lidi) aduk selama beberapa saat hingga tercampur merata 7. Diamati reaksi yang terjadi 8. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya Kristal seperti pasir pada campuran tersebut (Aglutinasi) 9. Dibuat control dengan cara suspense sel darah merah 1% diganti dengan PBS ph 7,2 10. Jika hasilnya positif pada uji HA cepat, dilanjutkan pada uji HA dengan teknik mikrotiter B. Uji Hemaglutinasi (Teknik Mikrotiter) 1. Disiapkan alat dan bahan 2. Diambil plat mikro “U” 96 sumuran



3. Diisi setiap tabung (1-12) pada plat mikro masing-masing dengan 25µl PBS dengan menggunakan mikropipet 4. Ditambahkan pada lubang pertama dan kedua suspense antigen sebanyak 25µl yang akan diuji dan selanjutnya buat pengencer seri kelipatan dua mulai dari lubang kedua sampai lubang kesebelas dengan menggunakan mikropipet. Pada sumur kesebelas, diambil 25µl lalu dibuang sehingga volumenya 25µl. 5. Ditambahkan 25µl PBS ketiap-tiap lubang (2-12) dan selanjutnya diayak dengan pengayak mikro selama 30 detik 6. Kemudian ditambahkan kedalam setiap lubang (1-12) masing-masing 50µl suspense sel darah merah 1% dan diayak kembali selama 30 detik 7. Diinkubasi pada suhu kamar selama 1 jam dan diamati timbul atau tidaknya reaksi aglutinasi sel daarah merah setiap 15 menit. Catatan : a. Sumur 1 sebagai control positif b. Sumur 12 sebagai control negative



BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Pengamatan A. Uji Hemaglutinasi Cepat Gambar



Keterangan Disiapkan bahan yang akan digunakan. Gambar sebelah kiri merupakan antigen positif 23 (sebagai control positif) ,sebelah kanan merupakan antigen hasil panen



Pada gambar sebelah kiri merupakan sel darah merah 1% dan sebelah kanan merupakan PBS



Objek glass yang sebelumnya sudah dibersihkan dilanjutkan dengan mengambil 50 µl antigen yang kemudian diteteskan pada objek glass



Kemudian ditambahkan 50 µl sel darah merah 1% pada samping suspense antigen yang sudah diteteskan sebelumnya



Dibuat Kontrol dengan penambahan suspense antigen dengan PBS



Selanjutnya dihomogenkan hingga merata



Kemudian amati aglutinasi yang terbentuk dengan bantuan cahaya



Didapatkan hasil : Yang bertanda + “Antigen positif (control positif)” didapatkan aglutinasi berupa butiran-butiran pasir Yang bertanda panen “Antigen hasil panen klp” tidak ditemukan adanya aglutinasi Pada bahan control tidak ditemukannya aglutinasi



Didapatkan hasil positif pada hasil panen virus klp 5, yang berupa butiran-butiran pasir



B. Uji Hemaglutinasi (Teknik Mikrotiter) Gambar



Keterangan Plat mikro yang sudah bersih dan kering diisi dengan 25µl PBS pada tiap lubang A 1-12 dan C 1-12



Kemudian pada lubang 1-2 ditambahkan 25µl suspense antigen yang akan diuji



Lalu dilakukan pengenceran dari lubang 2-11, pada sumur 11 diambil 25µl lalu dibuang. Selanjutnya ditambahkan 25µl PBS ke lubang 2-12



Kemudian diayak dengan pengayak mikro selama 30 detik



Setelah diayak, dilanjutkan dengan penambahan 50 µl sel darah merah 1% dan diayak kembali selama 30 detik



Diinkubasi pada suhu kamar selama 1 jam, dan diamati timbul atau tidaknya reaksi aglutinasi sel darah merah setiap 15 menit.



Pengamatan 15 menit pertama sudah terbentuknya aglutinasi pada sumur control negative (sumur 12) , sehingga sumur yang lain dapat dibaca



Hasil yang didapatkan : 







Pada sumur deret A : Terdapat pada hasil antigen positif (control positif) yaitu titer 24 Pada sumur deret C : Terdapat pada hasil panen semua negative dan pada control positif yaitu titer 21



Hasil yang didapatkan : 







Pada sumur deret A : Terdapat pada hasil antigen positif (control positif) Pada sumur deret B : Terdapat pada hasil panen yaitu titer 29



4.2 Pembahasan Virus adalah mikroorganisme terkecil, bersifat sebagai parasit obligat intraseluer yang artinya untuk dapat eksis berkembang maka virus mutlak memerlukan sel hidup. Virus tidak dapat dibunuh dengan antibiotika, oleh karena itu cara terbaik untuk mencegah penyakit virus adalah dengan melakukan vaksinasi dan meningkatkan biosekuriti. Uji serologi dilakukan untuk mengidentifikasi virus guna menentukan agen penyebab penyakit. Diagnose demikian disebut diagnose pasti. Caranya dengan menggunakan serum standar yang sudah diketahui.Prinsip dasar uji serologi adalah terjadinya ikatan antara antigen dengan antibodi yang homolog untuk membentuk ikatan antigen-antibodi komplek. Pada uji hemaglutinasi, ikatan tersebut (kompleks antigen - antibodi homolog) dapat diketahui dengan menambahkan sel darah merah 1% sebagai indikator uji. Uji serologi juga dapat digunakan untuk mengukur titer antibodi hewan pascavaksinasi (Ayu & Kencana, 2017).



Darah diambil dari hewan satu atau dua minggu setelah divaksinasi.Pada unggas pengambilan darah dilakukan melalui vena brakialis (vena sayap), dengan menggunakan spuit 1 atau 3 ml tergantung umurnya.Selanjutnya darah diletakkan pada posisi miring, dibiarkan sampai sarumnya keluar dengan sempurna.Serum yang keluar selanjutnya dipisahkan dan ditampung dengan tabung mikro untuk diuji titer antibodinya. Disamping itu uji serologi juga dapat digunakan untuk mengetahui munculnya penyakit baru dengan menggunakan serum dan antigen standar.Untuk penyakit yang sudah endemik, dilakukan pengambilan serum sepasang (paired sera) yakni serum yang diambil dua kali.Pengambilan pertama saat penyakit 19 berlangsung akut, sedangkan pengambilan serum yang kedua dilakukan 2-4 minggu kemudian. Selanjunya dibandingkan titer antibodinya (Ayu & Kencana, 2017). Uji hemaglutinasi (HA/HI) digunakan khusus untuk virus-virus yang memiliki protein hemaglutini pada amplopnya. Misalnya: Virus Newcastle Disease, virus Avian Influenza, virus Parvo. Terjadinya hemaglutinasi ditandai dengan butiran berpasir akibat adanya ikatan antara sel darah merah 1% dengan protein hemaglutinin pada amplop virus. Uji HA positif ditandai dengan bentukan berpasir warna merah pada dasar plat mikro sebagai tanda hemaglutinasi. Jika HA positif itu tandanya antigen yang diuji memiliki hemaglutinin.Untuk memastikan agen (virusnya) dilanjutkan dengan uji HI menggunakan serum standar (Ayu & Kencana, 2017).



Ilustrasi Gambar Reaksi Hemaaglutinasi Mikrotiter Positif dan Negatif Pada praktikum kali ini dilakukan uji hemaglutinasi (HA). Uji ini digunakan untuk mengetahui titer awal antigen yang akan digunakan dalam uji hambatan aglutinasi. Selain itu juga digunakan untuk retritasi antigen dengan tujuan memastikan titer antigen yang digunakan. Pada praktikkum ini dilakukan 2 uji yaitu uji hemaglutinasi cepat dan uji hemaglutinasi (teknik mikrotiter). Sebelum dimulai praktek dipersiapkan alat dan bahan terlebih dahulu, pada uji hemaglutinasi cepat dibutuhkan objek glass sebagai tempat untuk pemeriksaan hemaglutinasi cepat, mikropipet sebagai alat yang digunakan untuk memindahkan cairan atau larutan dari satu tempat ke tempat lainnya dengan pengukuran volume tertentu, yellow tip yang telah disteril sebagai pelengkap dari mikropipet, PBS yang digunakan untuk pembuatan control dan sebagai larutan penyangga, suspense antigen virus atau suspense bahan yang digunakan untuk pemeriksaan, dan suspensi sel darah merah 1% yang digunakan untuk membuat virus – virus yang mempunyai protein hemaglutinasi bereaksi dengan reseptor pada sel darah merah. Pada uji hemaglutinasi (teknik mikrotiter) dibutuhkan mikroplate yang telah disteril dengan alcohol sebelumnya untuk tempat pemeriksaan hemaglutinasi secara teknik mikrotiter, mikropipet, yellow tip yang telah disteril sebelumya, suspensi antigen virun atau suspense bahan, dan suspense sel darah.



Setelah semua alat dan bahan disiapkan dilakukan dengan pengujian.Uji Hemaglutinasi (HA), ada 2 jenis, yaitu uji HA cepat dan lambat. Untuk yang pertama akan dilakukan uji hemaglutinasi cepat. 1. Kontrol positif dan negatif Dibuat control positif dan negative dengan cara 50µL antigen positif untuk control positif pada satu sisis dan ditambahkan 50µL antigen negative untuk control negative di sisi lainnya yang diteteskan pada objek glass kemudian ditambah dengan 50µL sel darah merah 1% pada kedua control tersebut dan dihomogenkan dengan menggunakan lidi. Setelah homogen dengan merata diamati reaksi yang terjadi. Didapatkan hasil yaitu pada control positif didapatkan butiran berpasir warna merah pada objek glass sehingga reaksi tersebut positif sedangkan pada control negative tidak didapatkan butiran berpasir warna merah pada objek glass sehingga reaksi tersebut negative. Kontrol positif menunjukkan adanya aglutinasi, hal ini disebabkan karena adanya antigen yang bereaksi dengan sel darah merah. Fungsi kontrol positif adalah untuk memastikan teknik atau metode yang digunakan benar. 2. Sampel inokolum kelompok 4 dan kelompok 5 a. Pada sampel cairan hasil panen kelompok 4 dipipet 50µL inokulum cairan alantois ditambah dengan 50µL sel darah merah 1% yag diteteskan pada objek glass kemudian dihomogenkan dengan tusuk lidi dan diamati reaksi yang terjadi. Didapatkan hasil yaitu tidak terdapat butiran berpasir warna merah pada objek glass sehingga reaksi tersebut negatif. Hasil negatif ini menandakan tidak terdapat reaksi antara amplop virus dengan sel darah merah sehingga tidak terbentuknya aglutinasi. b. Pada sampel cairan hasil panen kelompok 5,dipipet 50µL inokulum cairan alantois ditambah dengan 50µL sel darah merah 1% yang diteteskan pada objek glass kemudian dihomogenkan dengan tusuk lidi dan setelah homogen dengan rata diamati reaksi yang terjadi. Didapatkan hasil yaitu terdapat butiran berpasir warna merah pada objek glass sehingga reaksi tersebut positif. Hasil positif ini



menandakan adanya reaksi antara amplop virus dengan sel darah merah sehingga terbentuknya aglutinasi. Uji HA cepat biasanya digunakan untuk mengidentifikasi virus yang mampu menghemaglutinasi eritrosit ayam.Adapun pada uji cepat ini memiliki kelebihan yaitu pada uji HA cepat sampel dan bahan yang digunakan sedikit, memerlukan



waktu



yang



singkat,



menggunakan



peralatan



yang



sederhana.Kekurangannya adalah mudah terkontaminasi. Dilanjutkan dengan uji selanjutnya yaitu uji hemaglutinasi (teknik mikrotiter). Uji HA mikrotiter dilakukan dengan menggunakan alat microplate U buttom (Nunc) sesuai dengan standar yang berlaku.Uji HA mikroteknik digunakan untuk mengetahui titer antigen (Santi Astuti Dwi Putri dkk, 2015). Selain itu uji HA lambat (teknik mikrotiter) digunakan untuk mengetahui kemampuan virus dalam menginfeksi yang ditandai dengan adanya hemaglutinasi eritrosit. Titer virus dapat diketahui dengan melihat sumuran terakhir pada nomor tertinggi (end point) yang menunjukkan adanya hemaglutinasi positif. Hal ini ditandai dengan adanya agregat – agregat di dasar sumur. a. Uji HA (mikrotiter) dengan inokulasi kelompok 4 Pada cairan Alantois yang digunakan dari kelompok 4 akan menggunakan plat mikro “U” 96 sumuran yang dimana dipergunakan sumuran A dan C. Pada sumuran A yaitu dengan menggunakan antigen positif (control positif) dan sumuran C akan menggunkan sampel panen allantois kelompok 4. Pertama diambil plat mikro “U” 96 sumuran, diisi setiap lubang sumuran A 1 – 12 dan sumuran C 1-12 pada plat mikro masing – masing dengan 25 µl PBS menggunakan mikropipet, setelah itu ditambahkan pada lubang pertama dan lubang kedua suspensi antigen sebanyak 25 µl yaitu inokulasi cairan allantois dan selanjutnya buat pengencer seri kelipatan dua mulai dari lubang kedua hingga lubang kesebelas dengan menggunakan mikropipet. Pada sumur kesebelas, diambil 25 µl lalu dibuang sehingga volumenya 25 µl, ditambahkan 25 µl PBS ke dalam tiap – tiap lubang (2 – 12) dan selanjutnya diayak dengan pengayak mikro (shaker). Kemudian



ditambahkan ke dalam setiap lubang (1 – 12) masing – masing 50 µl suspensi sel darah merah 1 % dan diayak kembali selama 30 detik. Diinkubasi pada suhu kamar selama 1 jam dan diamati timbul atau tidaknya reaksi aglutinasi sel darah merah setiap 15 menit. Dimana Sumur 1 sebagai kontrol positif dan sumur 12 sebagai kontrol negatif. Pembacaan sampel uji dapat dilakukan jika SDM sumur kontrol telah teraglutinasi di dasar sumur. Sampel dinyatakan positif apabila SDM pada



sumur



sampel



mengalami



aglutinasi.Titer



HA dihitung



berdasarkan pengenceran tertinggi alantois yang dapat mengaglutinasi SDM. Pada pengamatan 15 menit pertama sudah terbentuknya aglutinasi pada sumur control negative (sumur 12), sehingga sumur yang lain dapat dibaca. Hasil yang didapatkan yaitu pada sumur deret A terdapat pada hasil antigen positif (control positif) yaitu titer 24. Pada sumuran C yaitu pada semua hasil panen negative dan pada control positif 21. b. Uji HA (mikrotiter) dengan inokulasi kelompok 5 Pada hasil panen yang digunakan dari kelompok 5 akan menggunakan plat mikro “U” 96 sumuran yang dimana dipergunakan sumuran A dan B. Pada sumuran A yaitu dengan menggunakan antigen positif (control positif) dan sumuran B akan menggunkan sampel panen allantois kelompok 5. Pertama diambil plat mikro “U” 96 sumuran, diisi setiap lubang sumuran A 1 – 12 dan sumuran B 1-12 pada plat mikro masing – masing dengan 25 µl PBS menggunakan mikropipeT, setelah itu ditambahkan pada lubang pertama dan lubang kedua suspensi antigen sebanyak 25 µl yaitu inokulasi cairan allantois dan selanjutnya buat pengencer seri kelipatan dua mulai dari lubang kedua hingga lubang kesebelas dengan menggunakan mikropipet. Pada sumur kesebelas, diambil 25 µl lalu dibuang sehingga volumenya 25 µl, ditambahkan 25 µl PBS ke dalam tiap – tiap lubang (2 – 12) dan selanjutnya diayak dengan pengayak mikro (shaker). Kemudian ditambahkan ke dalam setiap lubang (1 – 12) masing – masing 50 µl suspensi sel darah merah 1 % dan diayak kembali selama 30 detik. Diinkubasi pada suhu kamar



selama 1 jam dan diamati timbul atau tidaknya reaksi aglutinasi sel darah merah setiap 15 menit. Dimana Sumur 1 sebagai kontrol positif dan sumur 12 sebagai kontrol negatif. Pembacaan sampel uji dapat dilakukan jika SDM sumur kontrol telah teraglutinasi di dasar sumur.Sampel dinyatakan positif apabila SDM pada sumur sampel mengalami aglutinasi. Titer HA dihitung berdasarkan pengenceran tertinggi alantois yang dapat mengaglutinasi SDM. Hasil yang didapatkan yaitu pada sumur deret A terdapat pada hasil antigen positif (control positif) yaitu titer 24. Dan sumuran B yaitu terdapat pada hasil panen yaitu titer 29. Reaksi positif ditandai dengan adanya bentukan kristal pada sumuran plat mikro akibat reaksi hemaglutinasi. Pembacaan titer HA dilakukan dengan memiringkan plat mikro ≥ 45o. Titer HA virus dinyatakan sebagai kebalikan dari pengenceran tertinggi virus yang masih mampu menimbulkan reaksi aglutinasi secara sempurna.Pada umumnya titer HA yang digunakan pada uji HI adalah 4 unit HI (Yuniati Kencana dkk, 2017). Pada uji hemaglutinasi terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi dari hemaglutinasi, Faktor-faktor yang mempengaruhi hemaglutinasi berbeda-beda pada tiap virus. Faktor - faktor tersebut antara lain eritrosit hewan yang digunakan, pH pengencer, dan temperatur inkubasi. Faktor lain menurut Hierholzer et al. (1969), adalah pengenceran, volume, dan perlakuan serum. Aktifitas hemaglutinasi juga dapat disebabkan agen non virus, misalnya bakteri Bordetella avium (Fidyah Fitrawati , Michael Haryadi Wibowo, Surya Amanu, 2015).



BAB V KESIMPULAN Pada praktikum kali ini dilakukan uji hemaglutinasi (HA). Pada metode HA cepat pada kelompok 4 mendapatkan hasil negatif dan kelompok 5 mendapat



hasil positif. Hasil positif ini menandakan adanya reaksi antara amplop virus dengan sel darah merah sehingga terbentuknya aglutinasi. Pada metode HA mikrotiter, kelompok 4 mendapatkan hasil pada sumuran C yaitu pada semua hasil panen negative dan pada control positif 2 1. Kelompok 5 mendapatkan hasil yang didapatkan yaitu pada sumur deret A terdapat pada hasil antigen positif (control positif) yaitu titer 24. Dan sumuran B yaitu terdapat pada hasil panen yaitu titer 29.



DAFTAR PUSTAKA Darmawi, Fakhrurrazi, Wiliana, Maryulia Dewi, Mahdi Abrar, Faisal Jamin, dan Zakiah Heryawati Manaf1. 2015. DETEKSI ANTIBODI SERUM AYAM KAMPUNG (Gallus domesticus) TERHADAP VIRUS NEWCASTLE DISEASE DI KOTA BANDA ACEH. Jurnal Medika Veterinaria Vol. 9 No. 1, Februari 2015. Fidyah Fitrawati , Michael Haryadi Wibowo , Surya Amanu , Bambang Sutrisno. 2015. Isolasi dan Identifikasi Egg Drop Syndrome Virus dengan Uji Hemaglutinasi dan Hemaglutinasi Inhibisi. Jurnal Sain Veteriner 33 (1), Juli



2015.



terdapat



dalam



URL



https://media.neliti.com/media/publications/140633-ID-none.pdf Angga Ari Wibowo, R. Susanti, Farikhul Ulum, Nugrahaningsih W.H. (2012). ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA SUBTIPE H5N1



DI



PETERNAKAN



TRADISIONAL



KECAMATAN



GUNUNGPATI SEMARANG. Biosaintifika 4 (2) (2012). Santi Astuti Dwi Putri , Evi Diah Woelansari , Ocky Dwi Suprobowati. (2015). PERBEDAAN ANTIBODI VIRUS Avian influenza SUBTIPE H5N1 DENGAN MENGGUNAKAN SERUM DAN PLASMA DARAH PADA PENDONOR DI PMI SURABAYA. ANALIS KESEHATAN SAINS VOL.



4



NO.



2



DESEMBER



2015.



terdapat



dalam



URL



http://journal.poltekkesdepkessby.ac.id/index.php/ANKES/article/viewFile/288/241 Gusti Ayu Yuniati Kencana, I Nyoman Suartha, Daniel Raja Bonar Nainggolan, Agatha Serena Lumban Tobing. (2015). Respons Imun Ayam Petelur Pascavaksinasi Newcastle Diseases dan Egg Drop Syndrome. JCV 35 (1), Juni 2017 Mahardika IGNK, Astawa INM, Kencana GAY, Suardana IBK dan Sari TK. 2015. Teknik Lab Virus. Udayana Universuty Press. Denpasar Suardana dan Cahyadi. (2015). ISOLASI DAN IDENTIFIKASI NEWCASTLE DISEASE



PADA



AYAM



BURAS.



terdapat



dalam



URL



https://repositori.unud.ac.id/protected/storage/upload/repositori/9d117fa74 8ec0b2d8e34bbe96eb11c9b.pdf



PROF. DR. DRH. GUSTI AYU YUNIATI KENCANA, MP. (2017). Modul Training : Cara Mengisolasi Virus dan Mengidentifikasi dengan Uji Serologi Hemaglutinasi. Disampaikan pada Acara: Training dan Workshop Laboratorium,



Timor



Leste.terdapat



dalam



URL



https://simdos.unud.ac.id/uploads/file_pendidikan_1_dir/eb1ca00126ee29 38f64067a40fc3d8e7.pdf Githa Nurma Aziz1, Suwarno, et al. 2019. Identifikasi Perkembangan Virus Infectious Bronchitis Isolat Lokal Dan Massachusetts Pada Cairan Allantois TAB Dengan Indirect Fluorescence Antibody Technique. DOI: 10.20473/jmv.vol2.iss1.2019.18-23 OIE.2012 .OIE Terrestrial manual, Avian Influenza Chapter 2.3.4. Kencana, G.A.Y., I.M. Kardena, dan I.G.N.K. Mahardika, 2012. Peneguhan diagnosis penyakit newcastle disease lapang pada ayam buras di Bali menggunakan teknik RT-PCR. J. Ked. Hewan. 6(1):28-31. Syukron, M.U., I.N. Suartha, dan N.S. Dharmawan. 2013. Serodeteksi penyakit tetelo pada ayam di Timor Leste. Indonesia Medicus Veterinus. 2(3):360368. Elfidasari, D., Puspitasari, R. L., & Frisa, A. (2014). Deteksi Antibodi Akibat Paparan Virus AI Subtipe H5N1 pada Unggas Air Domestik di Sekitar Cagar Alam Pulau Dua, 2(4), 260–269. Yesica, R. (2013). SKRIPSI DETEKSI ANTIBODI AVIAN INFLUENZA ( SUBTIPE H5 ) DENGAN UJI HI ( Hemagglutination Inhibition ) PADA SERUM MERPATI ( Columba livia ) YANG DIAMBIL DARI PASAR BANJARAN



KOTA



KEDIRI



Oleh



REZA



YESICA



FAKULTAS



KEDOKTERAN HEWAN DETEKSI ANTIBODI AVIAN INFLU.