Prediksi Soal Dan Jawaban Teknologi Dna [PDF]

Citation preview

PREDIKSI SOAL DAN JAWABAN TEKNOLOGI DNA



1) Jelaskan :



a. prinsip dasar teknik isolasi DNA genom bakteri b. prinsip dasar teknik isolasi DNA plasmid bakteri



Jawaban: a. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada lima, yakni kultur bakteri ditumbuhkan dan dipanen, penghancuran (lisis), pemisahan DNA dari komponen lain selain DNA, pemurnian DNA, dan pemekatan DNA. 1. Mula-mula pembiakan dan pemanenan sel bakteri di media M9 (defined medium) atau LB (undefined medium) kemudian pemanenan sel yang umumnya dilakukan dengan sentrifugasi berkecepatan rendah. Supernatan dibuang, pelet adalah sel hasil pemanenan. 2. Penghancuran (lisis)  Dapat dilakukan secara fisik (sonikasi, French Press)  Dapat dilakukan secara enzimatik dan kimia (penambahan lisozim, EDTA, SDS) (umum dilakukan): o Lisozim memecah dinding sel bakteri o Ethylenediamine tetraacetate (EDTA) menarik ion magnesium yang diperlukan untuk keutuhan membran sel. EDTA juga menghambat enzim pendegradasi DNA. Bersama lisozim dapat melisis sel. o SDS membantu lisis sel dengan menghilangkan lipid sehingga merusak membran sel. 3. Pemisahan DNA dari komponen lain (menghilangkan debris yang tidak larut) Pemisahan dilakukan dengan sentrifugasi 8000 rpm 10 menit. Akan diperoleh supernatan (DNA, RNA, dan protein). 4. Pemurnian/Purifikasi DNA Dua pendekatan untuk purifikasi DNA : (a) degragasi kontaminan (b) memisahkan DNA dari kontaminan. Komponen yang perlu dihilangkan: (1) Protein (dihilangkan dengan cara ekstraksi fenol:kloroform, adakalanya dibantu menggunakan enzim). (2) RNA (dihilangkan dengan cara penambahan RNase). Jika kandungan protein tinggi dapat ditambahkan protease (pronase, proteinase K) sebelum ekstraksi fenol/kloroform. Enzim ini akan memecah protein menjadi peptida kecil sehingga memudahka proses ekstraksi fenol/fenol:kloroform. Penghilangan protein dan RNA dapat juga dilakukan menggunakan kromatografi penukar ion. DNA dimurnikan dengan teknik kromatografi kolom. Larutan akan melewati kolom dan dapat dikumpulkan akibat gaya gravitasi atau dengan metode spin colomn yang mana kolom ditempatkan pada sentrifuse berkecepatan rendah. 5. Pemekatan DNA. 1. Umumya dengan cara preparasi etanol pada suhu rendah: (a) Ditambahkan etanol absolut, (b) Inkubasi (suhu -200C), (c) Pengendapan DNA (sentrifugasi), (d) Penguapan sisa etanol (e) Pelarutan kembali DNA dengan air atau bufer (sesuai konsentrasi yang diinginkan). 2. Menggunakan kromatografi penukar ion. Tahapan Isolasi DNA tanaman (percobaan sederhana) Hancurkan dinding sel dan membran plasma dengan cara mekanik (ditumbuk) → sentrifugasi untuk memisahkan padatan dari DNA terlarut → endapkan DNA menggunakan isopropanol → pisahkan DNA dari garam yang terlarut dan gula → cuci pelet DNA dengan etanol dan keringkan pelet → DNA terlarut → DNA tanaman dimurnikan dengan CTAB (cetylmethylammonium bromide) atau guanidium tiosianat. b. Prinsip utama dalam isolasi plasmid



Tahapan hampir sama dengan isolasi DNA genom. Melibatkan strategi yang dapat memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosom. Prinsip pemisahan DNA plasmid dari DNA kromosom: 1. Berdasarkan Ukuran dan 2. Berdasarkan Konformasi 1. Strategi berdasarkan ukuran (a)) Kultivasi dan pemanenan sel bakteri (b) Lisis bakteri: perlakuan dengan lisozim dan EDTA dilakukan melalui penambahan sukrosa untuk mencegah agar sel tidak pecah secara tiba-tiba, melainkan terbentuk sphaeroplast. Lisis sel dibantu dengan penambahan detergent non-ionik seperti Triton X-100 dan alkali (NaOH). (c) DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan kalium asetat (netralisasi) dan dipisahkan dengan sentrifugasi. (d) Supernatan yang mengandung plasmid, RNAase dan protease ditambahkan untuk mendegradasi RNA dan protein. (e) DNA plasmid dipisahkan dengan presipitasi menggunakan etanol. 2. Strategi berdasarkan konformasi Plasmid : konformasi superkoil Kromosom : konformasi linier



a. teknik denaturasi alkali Penambahan alkali mengakibatkan ikatan hidrogen pada DNA linier putus. Adanya penambahan asam (amonium asetat) mengakibatkan DNA kromosom kusut. Jika sebelumnya lisis sel menggunakan SDS, netralisasi dengan amonium asetat mengakibatkan protein dan RNA mengendap. b. sentrifugasi gradien densitas EtBr-CsCl



Pemurnian plasmid dengan sentrifugas gradien densitas EtBr-CsCl



2) Sebutkan beberapa faktor yang perlu dipertimbangkan dalam merancang strategi untuk isolasi RNA! Jawaban



Secara garis besar proses isolasi RNA terdiri atas tiga tahap: (1) Pemecahan Sel dan Solubilisasi Membran (2) Isolasi dan Pemurnian RNA, dan (3) Pemekatan RNA. Beberapa faktor penting yang harus dipertimbangkan dalam merancang strategi isolasi RNA antara lain: a. Pemilihan metode untuk pemecahan sel dan solubilisasi membran. Sebaiknya cepat dan tuntas. Metode : mekanik (homogenisasi, vorteks, sonikasi, french press, bead milling, penggilingan) dan enzimatik (lysozyme, zymolase, dan lysostaphin) b. Melakukan penghambatan terhadap aktivitas nuklease (inhibitor spesifik → co/:RNA guard dari Pharmacia, inhibitor nonspesifik → co/: heparin, dan reagen lain →co/: SDS). c. Pemilihan metode deproteinisasi (1. enzim proteinase K, 2. ekstraksi dengan pelarut organik seperti fenol dan kloroform,3. salting-out, 4. kombinasi seluruh perlakuan). d. Pemilihan metode pemekatan RNA (presipitasi : kombinasi garam dan alkohol). e. Penghilangan DNA Kontaminan. Ada tiga cara yang digunakan: 1. penambahan DNase, 2. ekstraksi dengan fenol:kloroform (5:1), presipitasi litium klorida (LiCl). LiCl selektif mengendapkan molekul RNA. 3) Jelaskan prinsip dasar pengklonan gen (gene cloning) yang juga disebut teknologi DNA rekombinan! Jawaban: Teknologi DNA rekombinan merupakan pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Tahapan-tahapan teknologi DNA rekombinan antara lain: a. Fragmen DNA mengandung gen yang akan diklon dimasukkan ke dalam molekul DNA sirkular yang disebut vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan. b. Vektor mentranspor gen ke dalam sel inang, biasanya bakteri meskipun tipe lain makhluk hidup dapat digunakan. c. Dalam sel inang, vektor memperbanyak diri menghasilkan jumlah salinan yang identik tidak hanya untuk dirinya sendiri tapi juga untuk gen yang dibawanya. d. Ketika sel inang membelah, salinan molekul DNA rekombinan dimasukkan ke keturunan dan replikasi vektor berlangsung. e. Setelah sejumlah besar sel membelah, koloni, atau klon, identik sel inang diproduksi. Setiap sel dalam klon mengandung satu atau lebih jumlah salinana molekul DNA rekombinan; gen yang dibawa 4) Jelaskan manfaat teknologi DNA rekombinan dalam bidang kesehatan! Jawaban: a. Insulin manusia telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan untuk mengobati penyakit diabetes. Merek dagang: HumulinR b. Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala industri c. Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan E.coli dan digunakan untuk mengobati kelainan pertumbuhan (misal: cebol). d. Terapi gen untuk penyakit dilakukan dengan menggantikan gen yang mengalami kerusakan dengan gen yang normal, digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit keturunan (genetic disorders) dan penyakit lain yang disebabkan oleh kerusakan gen (misal: kanker). 5) Sebuah gen insulin (INS) akan diklon ke dalam vektor pBK1 untuk selanjutnya diekspresikan pada bakteri. Situs restriksi yang tersedia pada segmen DNA yang membawa gen INS dan situs restriksi yang tersedia pada vektor diperlihatkan pada gambar. Jelaskan: a. Enzim restriksi yang Anda pilih untuk mengklon gen INS ke dalam vektor pBK1 (berikan alasannya)!



b. Cara menapis (screening) koloni yang membawa plasmid pBK1 dengan insert gen INS c. Sebutkan faktor yang perlu dipertimbangkan untuk mengoptimumkan ekspresi gen INS pada bakteri



Jawaban: a. Enzim restriksi yang dipilih adalah EcoR1. Enzim restriksi adalah enzim yang digunakan untuk memotong DNA secara spesifik. Restriksi yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing agar urutan basanya bisa sesuai sehingga antara plasmid dan DNA yang disisipkan akan bersatu. Dari gambar diketahui bahwa situs restriksi ecoR1 berada pada gen LacZ1. Situs ini paling tepat karena DNA asing akan menyisip di daerah gen LacZ1 sehingga gen LacZ1 tidak berfungsi. Hal ini akan menjadi indikator keberhasilan dalam seleksi transforman (seleksi biru-putih). Kita tidak dapat menyisipkan si situs BamHI karena akan merusak gen penyandi resistensi antibiotik. Nantinya, bakteri hasil transformasi ditempatkan pada medium nutrient padat yang mengandung amphicillin dan gula yang disebut X-gal. Amphicilin dalam medium yang akan memastikan bahwa hanya bakteri yang mengandung plasmid yang dapat tumbuh karena adanya resistensi dari amp-R, sedangkan X-gal akan memudahkan identifikasi koloni bakteri yang mengandung DNA asing yang disisipkan. b. Cara penapisan (screening) yang dilakukan adalah dengan seleksi biru putih (media mengandung Xgal dan IPTG/isopropil tiogalaktosidase). Enzim β-galaktosidase dari ekspresi gen LacZ1 akan memecah Xgal menjadi galaktosa dan 5-bromo-4chloroindigo yang berwarna biru sehingga koloni bakteri yang mengandung plasmid dengan gen β-galaktosidase utuh akan berwarna biru, tetapi jika suatu plasmid memiliki DNA asing tersisipkan ke dalam gen lacZ1-nya maka koloni sel akan berwarna putih karena sel tersebut tidak bisa menghasilkan β-galaktosidase untuk menghidrolisis X-gal. c. Faktor yang berpengaruh terhadap tingkat ekspresi gen: 1. Promoter 2. Stabilitas mRNA 3. Pemilihan kodon 4. Jumlah salinan plasmid 5. Stabilitas plasmid 6. Fisiologi sel inang 6) Jelaskan prinsip dasar dan manfaat (pilih dua soal): a. DNA fingerprinting b. PCR c. Reverse transcriptase PCR Jawaban: a. DNA fingerprinting



DNA fingerprint adalah teknik untuk mengidentifikasi seseorang berdasarkan pada profil DNA nya. DNA fingerprint yang merupakan gambaran pola potongan DNA dari setiap individu karena setiap individu mempunyai DNA fingerprint yang berbeda. Dalam kasus forensik info ini bisa digunakan sebagai bukti kuat kejahatan di sidang pengadilan. Analisis DNA masih memanfaatkan metode elektroforesis. Intrepretasi hasilnya adalah dengan cara menganalisis pola DNA menggunakan marka STR (short tandem repeats). STR adalah lokus DNA yang tersusun atas pengulangan 2-6 basa. Dalam genom manusia dapat ditemukan pengulangan basa yang bervariasi jumlah dan jenisnya. Dengan menganalisa STR ini, maka DNA tersebut dapat diprofilkan dan dibandingkan dengan sampel DNA terduga lainnya. Ketika sampel DNA yang telah dimurnikan dimasukkan ke dalam mesin PCR sebagai tahapan amplifikasi, maka hasil akhirnya berupa copy urutan DNA lengkap dari DNA sampel. Selanjutnya copy urutan DNA ini akan dikarakterisasi dengan elektroforesis untuk melihat pola pitanya. Urutan DNA setiap orang berbeda, maka jumlah dan lokasi pita DNA (pola elektroforesis) setiap individu akan berbeda juga. Pola pita inilah yang disebut DNA sidik jari (DNA finger print) yang akan dianalisia pola STR nya. Tahap terakhir adalah DNA berada dalam tahapan typing, proses ini dimaksudkan untuk memperoleh tipe DNA. Mesin PCR akan membaca data-data DNA dan menampilkannya dalam bentuk angka-angka dan gambar-gambar identifikasi DNA. Penetapan hasil tes DNA ini dilakukan mencocokkan tipe DNA korban dengan tipe DNA pihak tercurigai atau dengan tipe DNA yang telah tersedia dalam data base. Jika dari pembacaan, diperoleh tingkat homolog melebihi ambang yang ditetapkan (misal 90%), maka dapat dipastikan korban adalah kerabat pihak tercurigai. b. PCR PCR digunakan untuk mendeteksi virus, bakteri atau komponennya (faktor virulensi), amplifikasi urutan nukleotida, menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi, bidang kedokteran forensik, melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan “finger print”, DNA sekuensing, isolasi DNA, dan lain-lain. Prinsip dasar Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah proses sintesis enzimatik untuk amplifikasi sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Komponen reaksi yang diperlukan dalam teknik ini adalah untai tunggal DNA sebagai cetakan, primer, dNTPs (deoxynucleotide triphosphates), buffer, kofaktor, dan enzim DNA polimerase. Secara umum prinsip reaksi PCR membutuhkan tiga tahap, yaitu: 1. Denaturasi Prinsipnya adalah memisahkan DNA untai ganda menjadi komponen untai tunggal sehingga memungkinkan terjadinya hibridisasi primer. denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi dilakukan pada suhu tinggi (91980C) untuk memutus ikatan hidrogen antarnukleotida dan dapat diperlama jika sekuens banyak mengandung nukleotida G-C. Biasanya dilakukan selama 3 menit. Waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase. 2. Annealing Pada tahap ini terjadi hibridisasi primer PCR pada sekuens targetnya. Dilakukan pada suhu 50-600C, dipengaruhi oleh panjang dan susunan DNA (%GC) dan umumnya dilakukan pada suhu 50C di bawah suhu Tm primer. Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik adalah bahwa primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung 50 – 60 % G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45 detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya.



3. Elongasi (ekstensi rantai DNA) Tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 720C diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan demikian untuk produk PCR dengan panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda. c. Reverse transcriptase PCR Polymerase Chain Reaction dapat digunakan untuk mengamplifikasi DNA atau RNA. Proses PCR untuk mengamplifikasi RNA dikenal dengan Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Dalam RT-PCR, untai RNA pertama-tama di transkrip balik menjadi DNA komplemen (complementary DNA, atau cDNA) menggunakan enzim reverse transcriptase, dan cDNA yang dihasilkan akan menjadi DNA cetakan yang digandakan seperti halnya PCR pada umumnya. RT-PCR menggunakan sepasang primer yang berkomplemen dengan sekuens dari masing-masing dua untai cDNA. Primer tersebut kemudian diperpanjang dengan bantuan enzim DNA polymerase dan akan menghasilkan sebuah untai gandaan pada setiap siklusnya. RT-PCR meliputi tiga tahap utama. Tahap pertama adalah reverse transcription (RT) atau transkripsi balik dimana RNA ditranskrip balik menjadi cDNA menggunakan enzim reverse transcriptase dan primer. Tahap ini sangat penting dalam kaitannya dengan performa PCR untuk amplifikasi cDNA dengan bantuan DNA polymerase sebab DNA polymerase hanya dapat bekerja pada templet yang berupa DNA. Tahapan RT (Reverse Transcripsion) dapat dilakukan dalam tabung yang sama dengan PCR (one-step PCR) atau pada tabung yang terpisah (two-step PCR) menggunakan suhu berkisar 40°C sampai 50°C, tergantung pada karakteristik reverse transcriptase yang digunakan. Tahap berikutnya adalah denaturasi dsDNA pada 95°C, pada tahap ini dua untai DNA akan terpisah dan primer dapat mengikat pada untai tersebut jika temperaturnya diturunkan yang kemudian akan dimulai rantai reaksi baru. Selanjutnya suhu diturunkan hingga mencapai suhu annealing yang bervariasi tergantung primer yang digunakan, konsentrasi, probe dan konsentrasinya jika digunakan, dan juga konsentrasi kation. Tahap akhir adalah Amplifikasi PCR yang merupakan proses dimana dilakukannya perpanjangan DNA menggunakan primer yang memerlukan Taq DNA polymerase yang termostabil, biasanya pada suhu 72°C, suhu optimal untuk aktivitas enzim polymerase. Lamanya masa inkubasi tiap temperatur, perubahan suhu dan jumlah siklus dikontrol secara terprogram menggunakan programmable thermal cycler. Manfaat RT-PCR antara lain meneliti ekspresi RNA dalam sel, untuk cDNA library, deteksi kanker, identifikasi virus RNA, dan lain-lain 7) Apa yang dimaksud DNA probe dan apa gunanya? Jawaban: Molekul DNA utas tunggal yang digunakan untuk mendeteksi DNA utas tunggal yang komplementer disebut probe (pelacak). Molekul ini memiliki marka radioaktif atau marka kimia sehingga bisa dideteksi. DNA probe memiliki kisaran ukuran 15 – ribuan nukleotida. Melibatkan reaksi hibridisasi yang sangat sensitif dan selektif yang dapat mendeteksi keberadaan sekuen komplementer dalam konsentrasi rendah (1 molekul per sel). Hibrid (kombinasi probe-target) dapat terlihat ketika pelabelan dan deteksi sistem digunakan. DNA probe digunakan dalam berbagai blotting dan teknik in situ untuk mendeteksi asam nukleat tertentu. Dapat digunakan untuk menentukan jumlah salinan molekul DNA dalam suatu sampel DNA juga untuk mencari



gen sejenis (walau tidak identik) dan dapat digunakan mencari suatu gen dalam organisme yang genomnya belum disekuen secara keseluruhan. 8) Apa yang dimaksud dengan pustaka DNA dan jelaskan cara penapisannya! Jawaban: Pustaka genom merupakan sekumpulan sekuens (urutan) DNA dari suatu organisme yang masing-masing telah diklon ke dalam vektor tertentu untuk memudahkan pemurnian, penyimpanan, dan analisisnya. Deteksi pustaka gen dapat ditentukan dengan: (a) DNA probe. Prosedur ini dinamakan hibridisasi DNA dan tergantung pada stabilitas pasangan basa antara probe dan sekuens target. (b) Uji imunologi. Digunakan untuk DNA klon yang ditranskripsi dan ditranslasi menghasilkan suatu protein. Sampel setiap koloni ditransfer ke matriks, protein dilepaskan dan menempel pada matriks. Matriks yang ada protein terikat dengan antibodi pertama setelah interaksi protein target dengan antibodi pertama, antibodi yang terikat dibersihkan dan diberi antibodi kedua. (c) Aktivitas protein. Jika gen target adalah enzim, uji aktivitas protein dengan metode plate yang mana memplate pustaka genom pada E.coli pada medium yang ditambah substrat spesifik dan menggunakan pewarnaan selektif untuk identifikasi koloni yang mampu memanfaatkan substrat. 9) Pilih salah satu: a. Jelaskan cara isolasi DNA faga b. Jelaskan prinsip real time PCR c. Jelaskan cara pemekatan DNA faga sebagai vektor Jawaban: a. Faga yang umum digunakan adalah faga λ dan faga M13. - Pembiakan sel karena faga disekresikan, maka faga diperoleh dari medium kultur. - Faga diendapkan (sentrifugasi kecepatan tinggi/ultrasentrifugasi) untuk memisahkan suspensi faga dengan sel inang. Faga berada di bagian supernatan. - Supernatan diendapkan dengan PEG/polietilenglikol dan NaCl lalu disentrifugasi kembali untuk memperoleh resuspensi faga. - Faga dimurnikan (penghilangan protein atau sentrifugasi CsCl). Penghilangan protein dilakukan dengan penambahan fenol:kloroform (1:1) sehingga terbentuk 3 lapisan dan protein akan mengendap (fenol, protein, DNA faga berturut-turut dari dasar tabung). Selanjutnya lapisan DNA faga ditambahkan etanol dan disentrifugasi hasilnya akan terbentuk DNA faga benang kusut (pemekatan DNA) b. Prinsip qPCR qPCR/real time PCR merupakan pengembangan PCR konvensional. Real Time PCR (juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction (Q-PCR/qPCR) atau kinetic polymerase chain reaction) adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Real Time PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuantifikasi (sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisis. Cara kerja Real Time PCR mengikuti prinsip umum reaksi PCR, utamanya adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai. Terdapat 2 (dua) metode kuantifikasi yang umum digunakan antara lain : o Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai ganda (dsDNA) misalnya SyBr Green o Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen, misalnya probe



FRET (Hybridisasi) dan probe TaqMan. Dalam setiap pengamatan proses PCR, sinyal fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional setiap siklus PCR telah berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya produk DNA (DNA hasil amplifikasi) yang dihasilkan c. Pemaketan DNA faga sebagai vektor Pemaketan in vitro: DNA faga rekombinan dipaket kedalam bentuk partikel faga untuk meningkatkan efisiensi pemasukan faga kedalam sel. Pemaketan in vitro: - Sintesis protein kapsid oleh sel E. coli yang membawa faga λ yang mengalami mutasi pada situs cos (defective coc sites);



-



Sintesis protein kapsid yang jenisnya tidak lengkap oleh dua strain E. Coli



-



Campuran lisat sel menghasilkan protein kapsid yang jenisnya lengkap dan dapat digunakan untuk pemaketan molekul DNA λ.



10) Jelaskan beberapa cara diagnosis patogen dan jelaskan keunggulan cara molekuler! Jawaban: a. PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan metode molekuler untuk amplifikasi DNA secara in vitro menggunakan enzim dan sepasang primer yang bersifat spesifik terhadap DNA target. Hasil amplifikasi dilakukan analisis lanjutan menggunakan elektroforesis yang akan memisahkan DNA berdasarkan kecepatan migrasi di bawah pengaruh medan listrik. Hasil fragmen yang telah divisualisasi dibandingkan dengan standar. Jika fragmen DNA sampel sama dengan fragmen DNA standar maka sampel positif mengandung patogen. b. RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) merupakan metode amplifikasi cDNA (complementary DNA), yaitu DNA hasil proses transkripsi balik menggunakan RNA sebagai template selanjutnya melakukan teknik PCR. Diagnosis misalnya dilakukan pada deteksi virus avian influenza. Bagan deteksi dan analisis dapat dilihat pada gambar berikut.



Keunggulan diagnosis patogen cara molekuler: 1. Mencegah penularan penyakit 2. Diagnosis lebih akurat dan cepat 3. Tidak membutuhkan sampel dalam jumlah yang banyak 4. Dapat menentukan jenis patogen dan jumlahnya 5. Metode konvensional cenderung mahal, prosesnya lama dan membutuhkan keahlian yang tinggi.