Review Karbohidrat Kelompok VI Far A [PDF]

Citation preview

TUGAS KIMIA FARMASI KUANTITATIF



REVIEW: ANALISIS KARBOHIDRAT



OLEH: KELOMPOK VI FARMASI A ANDI AMALIA AKO



70100111006



AYU TRY SARTIKA



70100111016



FEBRIYANTI HASDAN SALEH 70100111026 ILHAM ARIDANI



70100111037



MUH. LUTHFI AZAM



70100111046



JURUSAN FARMASI FAKULTAS ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI ALAUDDIN MAKASSAR SAMATA-GOWA 2014



ANALISIS KARBOHIDRAT



Karbohidrat adalah salah satu bahan yang paling penting dalam makanan maupun sebagai bahan mentah. Karbohidrat mungkin terjadi secara alami atau ditambahkan ke produk makanan untuk menyediakan nutrisi serta untuk meningkatkan tekstur dan kualitas keseluruhan dari produk pangan. Polisakarida alami dalam makanan merupakan bagian intrinsik atau bawaan dari bahan baku. Misalnya, pati adalah zat karbohidrat terbanyak dalam produk makanan, diikuti oleh pektin, hemiselulosa dan bahan dinding sel. A. Analisis Kandungan Total Gula 1. Penyiapan Sampel Sebelum menganalisis untuk setiap kelas karbohidrat, apakah itu monosakarida atau bahan selulosa tidak larut, sampel harus dipersiapkan agar menghilangkan zat yang dapat mengganggu analisis. Untuk sampel yang sudah dasarnya larutan gula (jus, madu) sangat sedikit persiapan sampel diperlukan. Untuk sampel lainnya, seperti minyak biji, sereal atau makanan utuh, lemak, protein, pigmen, vitamin, mineral, dan berbagai senyawa lainnya harus dihilangkan sebelum analisis.



2. Uji Fenol-Asam Sulfat a. Teori Reaksi Pada asam kuat dan panas, karbohidrat menjalani serangkaian reaksi yang mengarah pada pembentukan turunan furan seperti furanaldehyde



dan



hydroxymethyl furaldehide. Reaksi awal, adalah reaksi dehidrasi diikuti dengan pembentukan turunan furan yang terkondensasi atau senyawa fenolik untuk menghasilkan warna gelap yang kompleks. Kompleks tersebut mengabsorpsi UVVI dan absorbansi setara dengan konsentrasi gula. Absorbansi maksimum pada 490 nm untuk heksosa dan 480 nm untuk pentose dan asam uronat dengan spektrofotometer UV-VI.



b. Prosedur Fenol, dalam



larutan 5 atau 80% ditambahkan ke tabung reaksi yang berisi



larutan sampel yang jernih. Asam sulfat pekat ditambahkan dalam aliran cepat langsung ke permukaan cairan dalam tabung reaksi. Campuran dilarutkan dan dicampur dengan bantuan Vortex dan waktu yang cukup untuk memungkinkan pengembangan warna. Solusi absorbansi dibaca pada 490 atau 480 nm menggunakan spektrofotometer, tergantung pada jenis gulanya. c. Kuantifikasi Kurva kalibrasi dibuat dengan menggunakan gula yang diuji. Stok 1mg/ml larutan gula standar digunakan untuk menyiapkan 5 atau 6 standar dengan range 10 hingga 100 µg/ml. Setiap standar diberi perlakuan sesuai prosedur yang diuraikan di atas, dipindahkan ke kuvet, dan absorbansi yang dibaca pada 480 atau 490 nm. Absorbansi kosong harus dikurangkan dari absorbansi standar manual, atau



kosong harus digunakan untuk spektrofotometer zero. Sebuah grafik absorbansi vs konsentrasi dibuat dan jumlah analit diturunkan dari kurva kalibrasi. d. Penerapan Metode fenol-sulfat banyak digunakan untuk menentukan konsentrasi total karbohidrat dalam sampel. Hal ini dapat digunakan pada ekstrak bebas lipid dari sereal, biji-bijian, dan tanaman. Selain itu, dapat digunakan untuk mengukur monosakarida, oligosakarida, dan polisakarida. Metode ini memberikan hasil yang paling akurat ketika diterapkan pada sampel yang mengandung hanya satu jenis karbohidrat.



3. Uji Anthron-Asam Sulfat a. Teori Reaksi Serupa dengan



uji asam fenol-sulfat, metode antron didasarkan pada



kondensasi dari furaldehide derivatif, yang dihasilkan oleh karbohidrat dengan adanya asam kuat, dengan reagen, yaitu anthron (9,10-dihidro-9-ozoanthracene), untuk menghasilkan senyawa berwarna. Reaksi karbohidrat dalam lingkungan asam kuat dengan hasil anthrone berwarna biru-hijau dan absorbansi dibaca pada 625 nm. b. Prosedur Campuran dingin dari 2% anthrone dalam asam sulfat pekat dicampur dengan sebuah aliquot dari larutan sampel yang jernih mengandung gula yang diuji. Setelah inkubasi dalam suhu yang dikendalikan dalam waktu tertentu untuk memungkinkan pengembangan warna, larutan dituangkan ke dalam yang sesuai kuvet spektrofotometri dan absorbansi diukur pada 625 nm. c. Kuantifikasi Serupa dengan uji asam fenol-sulfat, reaksi anthrone adalah nonstoikemetrik dan karena itu memerlukan pembangunan kurva standar untuk tujuan kuantitatif. d. Penerapan Metode anthrone-sulfat berlaku untuk larutan yang mengandung satu



jenis



heksosa karena gula dengan struktur serupa menghasilkan angka yang berbeda dan jumlah pembangunan warna. Gula lain, seperti pentosa dan asam heksuronat, juga akan bereaksi untuk menghasilkan senyawa berwarna yang menyerap pada panjang gelombang yang sama. Uji ini juga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif oligo-dan polisakarida yang hanya ada satu jenis dalam larutan.



4. Analisis Asam Uronat Metode kolorimetri untuk menentukan asam uronic mirip dengan fenol-asam sulfat dan uji anthrone didasarkan pada reaksi dari reagen dengan turunan karbohidrat yang terbentuk dalam asam pekat. a. Teori Reaksi – Metode m-Hydroxydiphenyl Sementara semua karbohidrat bereaksi asam pekat membentuk senyawa berwarna, asam uronic bereaksi dengan m -Hydroxydiphenyl dalam asam kuat lingkungan untuk membentuk kompleks berwarna pink. Pengukuran absorbansi dibaca pada 520 nm meningkat secara linear dengan konsentrasi asam uronat dari 0 sampai 100 μg / ml. b. Prosedur Operasi Sebuah solusi sampel dicampur dengan asam sulfat yang mengandung tetraborat dalam tabung reaksi dan ditempatkan dalam bak air mendidih selama 5 menit. Setelah pendinginan cepat dalam air es, m-Hydroxydiphenyl ditambahkan ke masing-masing sampel uji tabung dan di-vortex untuk memastikan pencampuran yang memadai. Absorbansi untuk setiap sampel dibaca setelah memungkinkan warna untuk mengembang selama 20 menit. Sebuah sampel blanko (yang mengandung pelarut sampel) harus disiapkan pada saat yang sama sebagai sampel. c. Kuantifikasi Suatu larutan standar asam uronat yang sesuai (yaitu, asam galakturonat) digunakan untuk menyiapkan beberapa pengenceran dan ini digunakan untuk mempersiapkan kurva standar. Sebuah grafik konsentrasi vs absorbansi dibuat dan pembacaan absorbansi sampel diplot sepanjang kurva untuk mendapatkan nilai konsentrasi. Kurva standar biasanya berkisar dari 10 hingga 100 µg/ml. d. Penerapan Uji m-Hydroxydiphenyl dapat mentolerir adanya gula asam nonuronat hingga ~ 200 μg / ml. Tetapi konsentrasi yang lebih tinggi dari gula netral mungkin meningkatkan pembacaan absorbansi. Selain itu, adanya protein dalam sampel dapat mengganggu absorbansi. Metode ini sesuai untuk kuantifikasi bahan pektik dalam buah-buahan dan sayuran dan telah diadaptasi untuk digunakan dengan micro-plate.



B. Analisis Monosakarida Metode



yang



paling



sering



digunakan



untuk



menentukan



konsentrasi



monosakarida dalam sampel adalah kromatografi gas (GC) dan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Tidak seperti metode enzimatik, yang cenderung lebih spesifik untuk satu jenis monosakarida saja, teknik kromatografi



memberikan informasi kualitatif dan



kuantitatif tentang satu atau beberapa monosakarida dalam sampel. Persiapan sampel secara sederhana dengan sampel yang relatif murni, yaitu sampel kering. Untuk analisis HPLC, sampel hanya perlu ditumbuk halus, dilarutkan, diencerkan jika diperlukan, dan disaring sebelum diinjeksi ke dalam kolom. Dalam beberapa kasus, terutama ketika menganalisis produk makanan yang kompleks, persiapan sampel menjadi agak lebih kompleks dan satu atau lebih langkah selanjutnya mungkin diperlukan. Senyawa larut lipid umumnya dihilangkan melalui ekstraksi dengan pelarut yang cocok, seperti eter atau heksan. Protein dapat



dihilangkan dari sampel secara enzimatik



menggunakan protease yang sesuai (papain). Keberadaan garam-garam anorganik negatif dapat mempengaruhi kolom . Ketika sampel awal adalah polisakarida dan analisis kuantitatif atau kualitatif analisis monosakarida penyusunnya diperlukan, sampel harus di-Depolimarisasi. Hal ini paling sering dilakukan. 1. Hidrolisis Asam Pada asam kuat dan panas, ikatan glikosidik antara



residu monosakarida



dalam polisakarida dipecah. Selama reaksi ini, satu molekul air yang dikonsumsi untuk setiap keterkaitan glikosidik dipecah.



Selama hidrolisis asam, dilepaskan



monosakarida yang rentan terhadap degradasi dengan adanya asam pekat panas. Asam sulfat dan asam trifloroasetat (TFA) biasanya digunakan untuk hidrolisis. Telah dilaporkan bahwa asam sulfat lebih unggul dari TFA untuk hidrolisis substrat berserat seperti dedak gandum, jerami, apel, dan mikrokristalin selulosa. Namun, asam sulfat bisa sulit untuk menghilangkan gangguan setelah analisis. TFA mudah menguap dan dapat dengan mudah dihilangkan sebelum analisis HPLC. Sesuai prosedur hidrolisis untuk gums polisakarida netral menggunakan TFA membutuhkan pemanasan ~ 10 mg bahan polisakarida dalam 1 ml 1M TFA pada 121° C selama 1 jam. Setelah pendinginan sampai suhu kamar, TFA dapat dipindahkan di bawah aliran nitrogen. Prosedur hidrolisis menggunakan asam sulfat untuk serat makanan larut air dalam makanan telah diuraikan. Hal ini membutuhkan pencampuran sampel dengan 1M asam sulfat dan pemanasan pada 100°C selama 2,5



jam.



Prosedur lain direkomendasikan untuk polisakarida netral melibatkan



pencampuran 2 sampai 5 mg sampel kering ditimbang dengan 0,1-0,25 ml HCl 2M dan pemanasan pada 100°C selama 2 sampai 5 jam.



Sampel yang mengandung residu gula asam seperti pektin dan jamur polisakarida tertentu



bisa sulit untuk menghidrolisis secara kuantitatif menggunakan metode



tradisional yang menggunakan TFA atau asam sulfat.



2. Kromatografi Gas Cair (KG) Kromatografi gas cair adalah teknik dimana komponen dalam campuran dipisahkan berdasarkan tingkat afinitasnya atau interaksi dengan cairan fase diam. Dalam kasus KG, komponen sampel dilarutkan dalam fase gas dan bergerak melalui lubang kolom yang sangat kecil, interior yang dilapisi dengan fase diam. Pemisahan ini terjadi pada tekanan tinggi dan suhu tinggi. Komponen dalam campuran sampel dengan afinitas tinggi untuk fase diam akan tinggal di kolom lama dan yang kurang afinitasnya untuk fase diam akan mengelusi. Tingkat afinitas atau interaksi dengan fase diam pada molekul telah diatur berdasarkan struktur, sifat, dan sifat kimia fase diam yang digunakan. Prasyarat sampel KG harus mudah menguap, mengingat bahwa monosakarida tidak mudah menguap, monosakarida harus diderivatisasi lebih dahulu untuk dianalisis.



a. Derivatisasi Monosakarida netral yang paling sering diderivatisasi menjadi alditol asetat lebih dahulu sebelum dianalisis dengan KG. Unsur-unsur penting dari prosedur derivatisasi ini



adalah reduksi gula netral menjadi alditol dan selanjutnya



diasetilasi. Asetat alditol yang dihasilkan kemudian dilarutkan dalam pelarut yang cocok dan disuntikkan ke dalam kolom KG. Gula Asam diperlakukan berbeda untuk menghasilkan trimetilsilil (TMS) derivatif. Proses derivatisasi ditunjukkan pada reaksi di atas. 1) Gula Murni Bahan awal harus sampel kering dari satu atau lebih monosakarida. Bahan polisakarida pertama harus dihidrolisis dan asam dihilangkan sebelum analisis. Asam trifloroasetat bekerja dengan baik untuk tujuan ini karena mudah menguap dan dapat dengan mudah dihilangkan dengan penguapan putar. Sampel kering yang mengandung sejumlah kecil monosakarida (~ 10mg) ditimbang secara akurat dan inositol heksaasetat (standar internal) dicampur dengan larutan natrium borohidrida dalam amonium hidroksida mengkonversi monosakarida menjadi alditols. Asam asetat ditambahkan untuk mengasamkan sampel dan menghancurkan kelebihan natrium borohidrida setelah reaksi. Campuran dikeringkan (dengan rotary evaporator atau dialiri nitrogen) dan



metanol ditambahkan dan dihilangkan dengan aliran nitrogen beberapa kali. Perlakuan dengan metanol menghilangkan ion borat sebagai metil borat yang volatil. Bila bagian akhir dari metanol telah dihilangkan dan sampel kering, yaitu campuran alditol diasetilasi dengan menambahkan anhidrida asetat dan pemanasan pada 121°C selama beberapa jam. Beberapa tetes air ditambahkan ke dalam vial untuk menghancurkan sisa reaksi anhidrida asetat dan seluruh campuran dikeringkan. Alditol asetat yang dihasilkan dilarutkan dalam metilen klorida dan dianalisis dengan KG. 2) Asam Gula Seperti polisakarida netral, polisakarida yang mengandung asam uronat harus dihidrolisis dan dikeringkan sebelum analisis. Sampel yang mengandung sejumlah kecil karbohidrat (~ 10 mg) ditimbang akurat, dilarutkan dalam natrium karbonat dan kemudian diperlakukan dengan natrium borohidrida. Asam asetat ditambahkan untuk menghancurkan kelebihan borohidrida dan ion borat dihilangkan dengan metanol seperti yang dijelaskan untuk monosakarida netral. Campuran yang dihasilkan dari asam aldonat dan aldosa (dari gula netral jika ada) dibuat menjadi turunan TMS dengan memperlakukan residu kering dengan campuran yang mengandung piridin, heksametildisilazane, dan asam trifloro asetat. Standar internal, seperti dokosan, dapat digunakan untuk kuantifikasi. b. Keuntungan/Kerugian Keuntungan analisis karbohidrat dengan KG adalah teknik yang baik dan banyak metode yang telah dioptimasi, membutuhkan ukuran sampel jumlah kecil dan sangat sensitif. Kerugian dari teknik ini terutama dari langkah-langkah persiapan. Jika salah pengurangan atau langkah-langkah asetilasi tidak dilanjutkan sampai selesai, jumlah diderivatisasi gula akan di bawah perkiraan.



3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Mirip dengan KG, HPLC adalah teknik pemisahan di mana senyawa dalam campuran dipisahkan pada fase diam. Dalam kasus ini, fase gerak (eluen) yang berisi sampel dan fase diam keduanya cairan. Kinerja tinggi anion kromatografi penukar (HPAEC), pilihan yang semakin populer untuk pemisahan karbohidrat, ditandai dengan fase diam anionik dan fase gerak dengan pH yang tinggi. Pada pH tinggi (10 sampai 14), karbohidrat gugus hidroksil



mengion dan pemisahannya didasarkan pada perbedaan afinitas untuk muatan berlawanan fase diam dan fase gerak. a. High Performance Anion Exchange Chromatography (HPAEC) Jenis kromatografi ini didasarkan pada kenyataan bahwa karbohidrat dalam lingkungan basa kuat akan mengioni, sehingga membuatnya bisa dipisahan pada kolom penukar ion. Kolom HPAEC digunakan untuk karbohidrat yang dilapisi dengan anion penukar resin. Sebagai contoh, Dionex (Sunnyvale, CA) kolom PA1, dioptimasi untuk pemisahan mono-, di-, oligo dan polisakarida BM rendah. Sistem HPAEC biasanya menggunakan natrium hidroksida sebagai eluen untuk memisahkan mono- dan disakarida, sementara eluen untuk molekul yang lebih besar sering termasuk natrium asetat untuk meningkatkan kekuatan ioniknya. Detektor untuk HPAEC adalah Pulse Amperometric Detector (PAD). Secara umum, amperometry mengukur perubahan arus yang dihasilkan dari oksidasi atau pengurangan senyawa pada elektroda. b. Kuantifikasi Menghitung jumlah setiap individu mono-, di-, oligo-atau polisakarida dari kromatogram HPAEC cukup sederhana yang disediakan 4 sampai 5 pengenceran standar yang sesuai dijalankan dengan satu set sampel. Perangkat lunak terkait dengan sistem HPLC akan mengintegrasikan puncak, menyediakan area peak / ketinggian, dan memberikan nilai konsentrasi yang disediakan standar dengan konsentrasi diketahui



telah dijalankan. Untuk heksosa memerlukan faktor



konversi 0,90 dan untuk pentosa 0,88. c. Keuntungan/Kerugian Keuntungan dari HPAEC untuk analisis karbohidrat adalah bahwa sampel tidak memerlukan derivatisasi dan cukup cepat. Kerugian dari HPLC berasal dengan sistem deteksi yang sebagian besar sangat tidak sensitif. Detektor indeks bias merupakan detektor yang dipilih karena lebih sensitif, misalnya UV atau detektor fluoresensi tidak cocok untuk menganalisis karbohidrat karena karbohidrat tidak mengandung gugus yang merespon sistem deteksi ini.



4. Analisis Enzimatik Metode



ini



digunakan



untuk



menentukan



kandungan



gula



yang



mempercayakan pada kemampuan enzim untuk mengkatalisis suatu reaksi spesifik dan menggunakan metode yang sesuai untuk memonitoring perkembangan reaksi atau



konsentrasi dari produk reaksi. Metode enzimatik sangat spesifik, biasanya cepat dan sensitif untuk konsentrasi gula yang rendah. a. Analisis Glukosa 1) Teori Reaksi Salah satu yang paling awal dan paling luas menggunakan enzim untuk penentuan kuantitatif glukosa adalah glukosa oksidase. Enzim yang spesifik yang dapat diperoleh dari Penicillium notatum dan Aspergillis niger, mengkatalisis



oksidasi



(kehilangan



2



atom



hidrogen)



dari



beta-D-



glukopiranosa menjadi D-glukono-1,5-lakton, yang merupakan spesies yang menghidrolisis menghasilkan asam D-glukonat. Reaksi dari glukosa dengan glukosa oksidase juga menghasilkan H2O2 dengan perbandingan 1:1. Metode awal untuk mendeteksi jumlah glukosa dalam sampel setelah diberi perlakuan dengan glukosa oksidase bergantung pada asam glukonat yang terbentuk saat titrasi secara volumetrik. Saat ini, metode kolorimetri berdasarkan penggunaan glukosa oksidase lebih umum. Dalam reaksi ini peroksidase



digunakan



dalam



kombinasi



dengan



kromogen



untuk



menghasilkan kompleks berwarna dengan adanya H2O2. Glukosa dioksidasi untuk menghasilkan asam glukonat dan peroksida dengan adanya glukosa oksidase dan peroksidase mengkatalisis oksidasi dari kromogen (contohnya odianisida) dengan adanya H2O2, dengan demikian penghitungan kuantitatif secara spektrofotometri ketika kurva standar yang tepat telah ditetapkan.



Heksokinase adalah enzim lain yang sering digunakan pada penentuan kuantitatif glukosa. Glukosa bereaksi dengan heksokinase dengan adanya adenosine trifosfat (ATP) membentuk glukosa-6-fosfat dan adensin difosfat (ADP). Glukosa-6-fosfat bereaksi dengan glukosa-6-fosfat dehydrogenase dengan adanya adenin nikotinamid dinukleotida (NAD) memproduksi 6fosfoglukonat



dan



NADH.



Konsentrasi



NADH



dihitung



secara



spektrofotometri pada 340 nm atau reaksi dimodifikasi dengan penentuan secara kolorimetri.



2) Prosedur (Glukosa Oksidase) Sampel dicampur dengan larutan buffer yang mengandung glukosa oksidase, peroksidase, dan kromogen dan diinkubasi pada suhu yang terkontrol dalam waktu tertentu sesuai dengan metode analisis yang dipilih. Setelah beberapa waktu untuk pengembangan warna, absorbansi dibaca pada panjang gelombang yang tepat. Sebagai contoh, ketika menggunakan o-dianisodin HCl sebagai kromogen dalam buffer asetat 0,1 M pH 5,5, larutan sampel diinkubasi pada suhu 30oC selama 5 menit dan absorbansinya pada 525 nm berlawanan dengan reagen blanko. 3) Kuantifikasi Sebuah kurva kalibari dibuat dengan memplot absorbansi vs konsentasi untuk 5 larutan glukosa berbeda. Kuantifikasi diperoleh menggunakan kurva kalibrasi. b. Analisis Galaktosa dan Laktosa D-galaktosa telah diuji secara enzimatik menggunakan galaktosa dehydrogenase dan glukosa oksidase. Adanya oksigen, galaktosa dioksidasi menjadi D-galaktoheksodialdo-1,5-piranosa oleh galaktosa oksidase. Reaksi ini menghasilkan hidrogen peroksida yang dapat diukur secara kolorimetri dengan adanya pendonor hidrogen. Secara terurut, D-galaktosa dioksidasi menjadi asam galaktonat oleh NAD ketika ada beta-galaktosa dehydrogenase dan hasil pembentukan NADH dapat dimoditor secara spektrofotometri. Laktosa dapat juga dideteksi sebagai galaktosa setelah perlakuan dengan beta-galaktosidase, sebuah enzim yang



mengkatalisis hidrolisis laktosa menjadi D-glukosa dan D-galaktosa. Galaktosa dan laktosa dapat ditentukan dalam sebuah sampel dengan mengkoreksi kandungan laktosa dari sampel yang diperoleh setelah pencernaan β-Galactosidase dengan mengurangi galaktosa bebas ditentukan dalam tidak adanya enzim. 1) Teori Reaksi Galaktosa dioksidasi menjadi asam galaktonat oleh NAD dengan adanya galaktosa dehydrogenase. NADH dihasilkan pada reaksi ini berada dalam larutan pada konsentrasi sebanding dengan kandungan galaktosa.



2) Prosedur Sampel yang mengandung galaktosa dicampur dengan buffer mengandung NAD, absorbansi awal pada 340 nm dan diukur kembali setelah inkubasi dengan galaktosa dehidrogenase. Laktosa yang mengandung sampel pertamatama harud diberi perlakuan dengan beta-galaktosidase untuk mengkonversi laktosa menjadi glukosa dan galaktosa dan diinkubasi dengan galaktosa dehidrogenase. Galaktosa dan laktosa dapat ditentukan dalam satu pengujian menggunakan kedua enzim ini. 3) Kuantifikasi Jumlah NADH yang terbentuk stoikiometri dengan jumlah galaktosa dalam sampel. Perbedaan absorpsi sampel dan blanko harus ditentukan dahulu dengan mengurangkan nilai absorbansi awal (sebelum penambahan galaktosa dehidrogenase) dari nilai absorbansi akhir (setelah penambahan galaktosa dehidrogenase). 4) Penerapan Uji ini berlaku untuk menentukan konsentrasi galaktosa dalam larutan yang bebas dari lemak dan protein. Sampel yang akan dianalisis harus jelas dan kurang dari 0,5 g / L total galaktosa dan laktosa. Sampel yang mengandung protein dapat diberi perlakuan dengan asam perklorat atau Carrez reagen, yang mengendapkan protein dan menyerap beberapa senyawa berwarna.



Uji enzimatik untuk laktosa dan galaktosa dapat digunakan untuk banyak produk makanan yang berbeda, termasuk daging, susu, dan produk roti, disediakan perlakuan sampel mencakup langkah-langkah untuk mengekstrak gula dan menghilangkan senyawa penganggu. Galaktosa dehidrogenase juga mengoksidasi L-arabinosa, oleh karena itu, kehadiran arabinosa akan mengganggu analisis. c. Analisis Fruktosa, Glukosa, dan Sukrosa 1) Teori Reaksi Fruktosa dapat diuji secara kuantitatif menggunakan heksokinase. Glukosa dan fruktosa dapat diuji bersama mennngunakan heksokinase, glukosa-6-fosfat dehydrogenase dan fosfoglukosa isomerase (PGI) untuk mengkatalisis reaksi spesifik. Adanya ATP dan heksokinase, glukosa dan fruktosa difosforilasi menjadi glukosa-6-fosfat dan fruktosa-6-fosfat (F-6-P). penambahan NAD dan glukosa-6-fosfat dehydrogenase mengoksidasi G-6-P menjadi glukonat-6fosfat dan menghasilkan NADH yang dapat diukur pada 340 nm. Penambahan fosfoglukosa isomerase mengubah F-6-P manjadi G-6-P yang kemudian dioksidasi menjadi glukonat-6-fosfat dengan adanya NAD dan membentuk NADH. Sukrosa jug adapt diuji dengan heksikinase atau glukosa oksidase yang terlebih dahulu diberi perlakuan dengan invertase untuk melepaskan glukosa dan fruktosa.



2) Prosedur Buffer, NAD, ATP, dan larutan sampel mengandung glukosa dan fruktosa dicampur dalam tabung uji. Campuran dari heksokinase dan glukosa-6-fosfat dehydrogenase ditambahkan dan setelah didiamkan beberapa saat, absorbansi larutan diukur pada 340 nm. Absorbansi diukur kembali setelah penambahan fosfoglukosa isomerase.



3) Kuantifikasi Glukosa diukur dari nilai absorbansi yang diperoleh setelah menambahkan heksokinase dan dehidrogenase glukosa-6-fosfat. Untuk mengukur fruktosa dalam sampel yang sama, nilai absorbansi dibaca setelah menambahkan fosfoglukosa isomerase yang dikoreksi untuk nilai absorbansi glukosa awal. Jumlah NADH yang dihasilkan stoikiometri dengan jumlah glukosa dan fruktosa. 4) Penerapan Metode ini sesuai untuk penentuan glukosa dan fruktosa dalam banyak varietas yang berbeda dari bahan makanan termasuk selai, madu, dan es krim, selama mereka telah diperlakukan untuk menghilangkan zat mengganggu seperti lipid dan protein. Sampel harus jelas, relatif tidak berwarna, dan bebas dari bahan endapan. Larutan yang keruh atau mengandung campuran materi penganggu dapat disaring atau diperlakukan dengan reagen Carrez. d. Analisis (13) (14)-ß-D-Glukan 1) Teori Reaksi (13) (14)-ß-D-Glukan merupakan dinding sel polisakarida yang ditemukan dalam jumlah yang banyak di sereal padi-padian seperti oats dan gandum, sedangkan jumlah yang sedikit ditemukan pada terigu dan dandum hitam. ßglukan dari sereal gandum telah diteliti lebih dari beberapa dekade berdasarkan manfaat kesehatan menurunkan kadar glukosa darah dan menurunkan kadar kolesterol serum. Analisis dari ß-glukan dapat menggunakan hidrolisis enzimatik



dengan



(1→3)(1→4)-β-D-glukan-4-glukanohidrolase



untuk



membentuk oligosakarida dan kemudia dihdrolisis dengan β-glukosidase. Pelepasan glukosa diuji dengan glukosa oksidase seperti tercantum pada sub Analisis Glukosa.



2) Prosedur Sampel kering ditimbang secara akurat (biasanya tepung atau gilingan) dicampur dengan buffer fosfat (pH 6,5), dididihkan dan diaduk. Campuran diinkubasi dengan lichenase kemurnian tinggi pada suhu 50oC, campur dengan buffer natrium asetat (pH 4,0) dan disentrifuge. Sejumlah supernatant diberi



perlakuan dengan glukosidase dan sisanya dengan buffer asetat sebagai blanko. Setelah inkubasi pada suhu 40oC dengan glukosidase, sampel dicairkan dan glukosa ditentukan secara enzimatik dengan metode glukosa oksidaseperoksidase. Standar mengandung 50 dan 100 µg/ml glukosa, reagen blanko (mengandung buffer asetat dan reagen glukosa oksidase-peroksidase) dan tepung kontrol dengan nilai ß-glukan yang diketahui disiapkan. 3) Kuantifikasi Nilai absorbansi dari standar glukosa yang digunakan untuk mengevaluasi persen glukosa dalam sampel. Ketika menghitung glukosa persen, penting untuk menyertakan faktor konversi 0,9 untuk memperhitungkan perbedaan berat molekul glukosa bebas vs glukosa dalam polisakarida. 4) Penerapan Uji ini cocok untuk digunakan dengan tepung kering dan fraksi penggilingan biji-bijian sereal seperti gandum, oat, barley, gandum, dan sereal tanpa pemanis memberikan semua hal di atas telah digiling dan melewati ayakan mesh 0,5 mm. Uji ini juga dapat digunakan untuk sampel yang mengandung gula sederhana dengan mengekstraksi sampel dengan 50% etanol untuk menghilangkan gula (yang dapat meningkatkan nilai glukosa yang diukur) terlebih dahulu deberi perlakuan lichenase. Untuk sampel yang berbeda, langkah ujinya telah dimodifikasi dan dioptimasi. e. Analisis Galaktomanan Galaktomanan adalah polisakarida yang terdiri dari ß-14 terikat substituen manosil diganti pada posisi C6 dengan α-galaktosa. Jumlah dari substituen yang diganti tergantung pada sumber galaktomanan, contohnya galaktomanan dari guar memiliki galaktosa:manosa (G:M) perbandingan 1:2 sementara perbandingan untuk locust bean gum (carob gum) adalah 1:4. Metode enzimatik secara kuantitatif untuk galaktoman dikembangkan berdasarkan pada perbandingan G:M yang diketahui. 1) Teori Reaksi Konsentrasi galaktoman dalam sampel ditentukan dari jumlah galaktosa yang dilepaskan oleh α-galaktosidase setelah pencernaan ß-mannanase. Galatosa dihitung secara spektrofotometri setelah perlakuan dengan NAD dan galaktose dehydrogenase.



2) Prosedur Sampel berupa tepung kering dari guar atau locust bean gum diekstraksi dengan etanol 80% untuk menghilangkan gula sederhana dan oligosakarida yang mungkin mengandung galaktosa. Galatomanan dilarutkan dengan pemanasan tepung dalam bufferdiikuti dengan inkubasi pada suhu 40oC dengan ß-mannanase. Campuran sampel disentrifugasi untuk memisahkan materi tak terlarutnya dan sejumlah supernatant diinkubasi dengan αgalaktosidase untuk melepaskan galaktosa dan sisa supernatant lainnya diberi perlakuan dengan buffer asetat sebagai dan dijadikan blanko. Galaktosa secara kuantitatif ditentukan dalam sampel setelah perlakuan dengan NAD dan galaktose dehidrogenase. 3) Kuantifikasi Nilai absorbansi blanko dikurangkan dari absorbansi sampel dan hasilnya digunakan untuk penentuan galaktosa secara kuantitatif. Rata-rata persentase galaktosa dalam guar dan locust bean gum adalah 38 dan 22%.



C. Analisis Oligosakarida Oligosakarida adalah karbohidrat yang terdiri dari dua dan sepuluh residu monosakarida yang terikat glikosidik. Sakarida dengan DP lebih besar dari 10 yang sering disebut sebagai oligosakaarida. Misalnya, inulin, rafinosa dan stachyose, tri-dan tetrasakarida terdiri dari galaktosa, glukosa, dan fruktosa yang ditemukan dalam kacangkacangan. Oligosakarida umum lainnya dalam makanan adalah dekstrin atau hidrolisat pati, maltodekstrin dan terutama digunakan untuk menambahkan massal untuk produk makanan serta mereka viskositas-memodifikasi dan pembentuk film. Analisis oligosakarida dilepaskan melalui hidrolisis asam parsial atau serangan enzimatik adalah teknik yang sering digunakan untuk memberikan informasi berharga tentang struktur molekul. Sebagai contoh, (1 → 4) yang terikat pada (1 → 3) unit glukosa dalam campuran terikat pada (1 → 3) (1 → 4)-β-D-glukan dipecah oleh (1 → 3) (1 → 4)β-D-glukan-4-glukanohidrolase (lichenase). Oligosakarida dibebaskan dari pencernaan lichenase dari β-glucan terutama 3-O-β-cellobiosyl dan 3-O-β-cellotriosyl-D-glukosa.



Analisis oligosakarida ini dengan demikian merupakan langkah penting dalam memahami sepenuhnya polisakarida induk. Metode untuk menganalisis oligosakarida mirip dengan metode untuk menganalisis monosakarida. Sebagai contoh, ekstraksi oligosakarida dari produk makanan dicapai seperti untuk monosakarida, dengan etanol 80% panas. Mereka dapat dihidrolisis dengan asam atau enzim untuk konstituen mereka monosakarida dan hidrolisat dikenakan analisis dengan kromatografi, kimia, atau metode enzimatik. Selain itu, teknik eksklusi ukuran dapat digunakan untuk memisahkan campuran oligosakarida berdasarkan ukuran. 1. Komposisi Monosakarida Komposisi monosakarida oligosakarida dapat ditentukan oleh hidrolisis (asam atau enzimatik) diikuti dengan metode yang cocok untuk mengidentifikasi monosakarida yang diursikan. Monosakarida Dirilis dapat diidentifikasi dengan menggunakan teknik kromatografi (HPLC, GC).



2. Size Exclusion Chromatography (SEC) Kromatografi ekslusi ukuran adalah teknik kromatografi dimana molekul dalam sampel dipisahkan berdasarkan ukuran mereka. Molekul dalam aliran eluan (biasanya buffer) diarahkan ke dalam kolom berisi dengan gel berpori. Molekul yang lebih kecil dalam sampel akan ditahan oleh pori, sehingga membutuhkan lebih banyak waktu melewati kolom dan elusinya lambat dibandingkan molekul yang lebih besar yang pada terelusi pada kolom lebih dulu. Detektor indeks bias sering digunakan sendiri atau dalam kombinasi dengan detektor hamburan cahaya dan/atau detektor viskosmetrik. Dekstrin, atau hidrolisat pati, dapat menjadi campuran yang agak rumit dari oligosakarida dengan ukuran dan proporsi oligomer linier dan bercabang bervariasi tergantung pada bahan awal (pati beras, pati jagung, dll) dan metode hidrolisis (enzim, asam) bahkan ketika DE adalah sama. Dekstrin dari DE berkisar 4-25 dianalisis pada sistem SEC dilengkapi dengan multi-sudut detektor cahaya-hamburan, memungkinkan perolehan informasi sehubungan dengan distribusi berat molekul. Dalam kombinasi dengan kinerja tinggi kromatografi pertukaran anion (HPAEC), yang memberikan informasi tentang terjadinya relatif oligosakarida individu, SEC ditambah dengan berat



detektor



sensitif



molekul



diperbolehkan



dekstrin



lebih



lengkap



profil sampel dari nilai DE saja (yang hanya mencerminkan jumlah mengurangi



ujungnya). Salah satu kelemahan dari sistem SEC adalah waktu yang diperlukan untuk menganalisis sering membutuhkan beberapa jam atau bahkan berhari-hari.



3. High Performance Anion Exchage Chromatography (HPAEC) Tidak seperti analisis monosakarida, di mana fase gerak biasanya natrium hidroksida saja, fase gerak untuk oligosakarida mengandung sodium asetat juga untuk meningkatkan kekuatan ionik dan untuk memastikan pendorongan oligosakarida dari kolom. Kolom Dionex Carbopac PA1 telah digunakan untuk memisahkan dekstrin hingga DP 3040 menggunakan kombinasi fase gerak dari 80% A dan 20% B pada waktu nol dengan gradien linier sampai 90% B dan 10% A (di mana A = 100 mM NaOH dan B = 100 mM NaOH mengandung 600 mM NaOAc). Dalam hal ini, dekstrin berupa sampel kering diencerkan dengan air secukupnya dan disaring (filter 0,45 um) sebelum injeksi. HPAEC juga telah digunakan sebagai teknik preparatif untuk memisahkan oligosaccharides dalam bir. Sekali lagi, menggunakan buffer NaOH / NaOAc. Oligosakarida (terdiri dari glukosa, galaktosa, dan xylose) diurai oleh aksi dari selulase pada biji xyloglukan dipisahkan pada kolom CarboPak PA100 (Dionex, Sunnyvale, CA) menggunakan gradien elusi dari natrium hidroksida dan natrium buffer asetat. Oligosakarida seperti isomaltose, kojibiose, gentiobiose, nigerose, dan maltosa dari berbagai varietas madu juga telah dipisahkan menggunakan HPAEC-PAD. Tidak terbatas pada pemisahan oligosakarida netral, asam oligogalakturonat dari



jus



gradient



strawberry natrium



telah



dipisahkan



hidroksida



pada



dan



sistem kolom



HPAEC



menggunakan



CarboPac



PA-100.



Asam oligogalaturonat hasil dari depolimerasi pektin enzimatik dipisahkan pada kolom Mono-Q anion exchange (Pharmacia, Upsala, Swedia) menggunakan pengelusi gradien (Na2SO4 dalam buffer fosfat) dan terdeteksi pada detektor fotodioda array. Kerugian utama menggunakan HPAEC-PAD untuk menganalisis oligosakarida adalah tidak adanya standar yang memadai untuk berbagai jenis oligosakarida (oligosakarida dari β-glucan, malto-oligosakarida lebih dari DP 7). Selain itu, detektor pulsed amperometric tidak sesuai untuk semua jenis sampel dan, pada kenyataannya, respon detektor menurun dengan kenaikan DP.



4. Analisis Enzimatik Hidrolisis enzimatik oligosakarida ditambah dengan pemisahan kromatografi dan identifikasi



penguraian



oligosakarida umumnya digunakan



untuk



mengukur



oligosakarida pada sistem makanan sederhana dan kompleks. Metode ini telah berhasil diterapkan untuk analisis frukto-oliosakarida dan inulin. Inulin dan oligofruktosa adalah fruktans, (2 → 1) terikat pada unit β-D-fructofuranosyl dengan atau tanpa glukosa terminal, ditemukan secara alami dalam sawi putih, Jeruselem artichoke, dan bawang. Kedua inulin dan oligofruktosa adalah campuran polydisperse dengan nilai masing-masing DP berkisar antara 2 sampai 60 dan 2 sampai 10. Kedua inulin dan oligofruktosa dalam produk pangan dapat diukur dengan menundukkan ekstrak air panas untuk perlakuan enzimatik yang memungkinkan penentuan fructan berdasarkan perbedaan (kadar gula sebelum dan sesudah perlakuan). Fruktosa dan sukrosa bebas ditentukan dalam sampel asli, glukosa bebas dan glukosa dari pati ditentukan setelah perlakuan amiloglukosidase, dan glukosa total dan fruktosa total yang ditentukan setelah hidrolisis fruktozim. HPAEC-PAD cocok untuk analisis hidrolisat enzim ini karena memungkinkan resolusi dasar dari semua gula dan memfasilitasi kuantifikasi langsung. Sebuah metode telah dikembangkan untuk ekstraksi, deteksi, dan kuantifikasi inulin dalam produk daging. Inulin diekstrak dari produk daging di pelarut air panas, diberi perlakuan dengan inulinase, dan menguraikan fruktosa diukur dengan HPLC dengan deteksi RI. Jumlah inulin dan oligofruktosa ditentukan dengan mengurangi jumlah fruktosa bebas (diperoleh dari blanko tanpa enzim) dari fruktosa total dalam sampel setelah perlakuan enzim. Fruktan dapat ditentukan sebagai glukosa dan fruktosa setelah hidrolisis enzim menggunakan



metode



kimia/spektrofotometri.



Metode



ini



menggunakan



p-



hidroksibenzoat asam hydrazide (PAHBAH) untuk mengukur fruktan sebagai gula reduksi setelah perlskusn dengan fruktanase. Fructans diekstraksi dalam air panas dan ekstrak diperlakukan dengan suksesi enzim untuk memecah sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa dan pati menjadi glukosa. Monosakarida yang dilepaskan direduksi menjadi gula alkohol untuk menghindari gangguan dalam uji fruktan. Fruktanase ditambahkan untuk melepaskan fruktosa dan glukosa dari fruktan dan sejumlah gula reduksi berada dalam larutan kemudian ditentukan dengan metode asam phidroksibenzoat hydrazide dimana warna yang dihasilkan oleh reaksi diukur pada 410 nm.



D. Analisis Dietary Fiber (Serat Makanan) 1. Defenisi Dietary Fiber Serat makanan adalah bahan dinding sel tanaman yang tahan terhadap enzim pencernaan. Definisi ini kemudian diperluas untuk mencakup semua polisakarida yang tidak dapat dicerna seperti gelatin, mucilago, selulosa yang dimodifikasi, oligosakarida, dan pektin. Definisi itu diperluas karena zat tambahan tersebut berperilaku



fisiologis dengan cara mirip dengan senyawa yang termasuk dalam



defenisi serat makanan tersebut, mereka dapat dimakan dan tidak dicerna dan diserap dalam usus kecil. Definisi AACC, tentang serat makanan adalah sebagai berikut: “Serat makanan adalah bagian yang dapat dimakan dari tanaman atau karbohidrat analog yang resisten terhadap pencernaan dan penyerapan di usus kecil manusia dengan fermentasi lengkap atau parsial pada usus besar. Serat makanan termasuk polisakarida, oligosakarida, lignin, dan tanaman yang mengandung zat serat makanan. Serat makanan memberikan efek fisiologis menguntungkan termasuk laksasi, atau penurunan kolesterol darah atau penurunan glukosa darah.”



2. Analisis Dietary Fiber a. Metode Uppsala Ada dua pendekatan yang berbeda secara fundamental untuk menganalisa serat makanan. Metode Uppsala untuk mengukur gula netral, asam uronat (bahan pektik), dan Klason lignin (serat makanan nonkarbohidrat termasuk lignin, tanin, dan



proteinatous)



dan



menjumlahkan



komponen-komponen



ini



untuk



mendapatkan nilai serat makanan. Sampel pertama-tama direaksikan dengan amilase dan amiloglukosinase untuk menghilangkan pati. Hidrolisat pati dan gula BM rendah dipisahkan dari serat larut menggunakan etanol 80% meninggalkan residu yang mengandung serat larut dan tidak larut. Gula netral ditentukan setelah derivitisasi sebagai asetat alditol dengan GC, asam uronat yang diuji secara kolorimetri, dan Klason lignin ditentukan secara gravimetri. b. Enzimatik/ Metode Gravimetri Metode kedua adalah pengukuran berdasarkan perbedaan di mana residu serat makanan diisolasi, dikeringkan, ditimbang, dan kemudian berat ini disesuaikan untuk nondietary bahan serat (yaitu, protein dan abu). Metode enzimatikgravimetri mereaksikan sampel untuk suksesi enzim (α-amilase, miloglukosidase, protease) untuk mengurangi material tercerna, langkah pengendapan etanol untuk mengisolasi polisakarida non pati, dan terakhir penentuan abu dan protein. Jumlah



protein dan abu dikurangi dari berat residu kering untuk mendapatkan total nilai serat makanan.