Revisi Novika Sari [PDF]

Citation preview

UJI TOKSISITAS EKSTRAK ETANOL HERBA PUGUNTANOH (PICRIA FEL TERRAE LOUR ) TERHADAP LARVA ARTEMIA SALINA LEACH DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT)



PROPOSAL



OLEH :



NOVIKA SARI SIREGAR 1601011152



PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI DAN KESEHATAN INSTITUT KESEHATAN HELVETIA MEDAN 2020



KATA PENGANTAR Puji dan syukur kami ucapkan ke Hadirat Allah SWT yang melimpahkan Rahmat dan Karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan Proposal ini. Adapun judul Proposal adalah : “Uji Toksisitas Ekstrak Etanol Herba Puguntanoh (Picria Fel TerraeLour) Terhadap Larva Artemia Salina Leach Dengan Metode Brine Shrimp LethalityTest (BSLT)”. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih kepada semua pihak yang telah memberikan bantuan dan bimbingan serta fasilitas sehingga Proposal ini dapat disusun, antara lain penulis sampaikan kepada : 1. Dr. dr. Hj. Razia Begum Suroyo, M.Sc., M.Kes., selaku Pembina Yayasan Helvetia Medan. 2. Dr. dr. Arifah Devi Fitriani, M.Kes., selaku ketua Yayasan Helvetia Medan. 3. Dr. H. Ismail Efendy, M.Si.,selaku Rektor Institut Kesehatan Helvetia Medan. 4. H. Darwin Syamsul, S.Si., M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi dan Kesehatan Institut Kesehatan Helvetia. 5. Adek Chan, S.Si., M.Si., Apt., selaku Ketua Program Studi S1 Farmasi Institut Kesehatan Helvetia. 6. Tetty Noverita Khairani S, S.Si., M.Si. selaku Pembimbing I yang senantiasa menyediakan waktudan tenaga dalam memberikan pengarahan, bimbingan serta memberikan masukan dan saran kepada penulis dalam menyelesaikan Proposal ini. 7. Chemayanti Surbakti,S.Farm., M.Si., Apt., selaku Pembimbing II yang telah meluangkan waktu dan memberikan pemikiran dalam membimbing penulis selama penyusunan Proposal ini. 8. Ruth Mayana Rumannti, S.Farm., M.Si., Apt. selaku Dosen Penguji III. 9. Teristimewa penulis ucapkan terima kasih yang tak terhingga kepada Ayahanda dan Ibunda serta abang serta keluarga besar yang tak pernah hentihentinya mendoakan dan memberikan dukungan kepada penulis baik secara moral maupun materil. 10. Rekan-rekan mahasiswa program Studi S1 Farmasi. Penulis menyadari bahwa Proposal ini masih jauh dari kata sempurna.Oleh karena itu, penulis menerima kritik dan saran demi kesempurnaan Proposal ini. Akhir kata penulis mengharapkan semoga tulisan ini dapat bermanfaat bagi kita semua. Medan, Februari 2020 Penulis



Novika Sari Siregar i



DAFTAR ISI Halaman HALAMAN PENGESAHAN KATA PENGANTAR............................................................................. DAFTAR ISI............................................................................................ DAFTAR GAMBAR...............................................................................



i ii iv



BAB I PENDAHULUAN........................................................................ 1.1. Latar Belakang.......................................................................... 1.2. Perumusan Masalah.................................................................. 1.3. Hipotesis.................................................................................... 1.4. Tujuan Penelitian...................................................................... 1.5. Manfaat Penelitian.................................................................... 1.6. Kerangka Pikir Penelitian.........................................................



1 1 4 4 4 4 5



BAB II TINJAUAN PUSTAKA............................................................. 6 2.1. Uraian Tumbuhan ..................................................................... 6 2.1.1. Sistematika Tumbuhan ................................................. 6 2.1.2. Morfologi Tumbuhan ................................................... 7 2.1.3. Nama Daerah dan Nama Asing Tumbuhan .................. 7 2.1.4. Sinonim ........................................................................ 7 2.1.5. Khasiat Tumbuhan Pungun Tanoh................................ 8 2.1.6. Kandungan Kimia ........................................................ 8 2.1.6.1............................................................................ Flavonoi d ........................................................................ 8 2.1.6.2............................................................................ Tanin ...........................................................................9 2.1.6.3............................................................................ Saponin ...........................................................................9 2.1.6.4............................................................................ Steroid ...........................................................................10 2.2. Simplisia ................................................................................... 10 2.3. Ekstraksi ................................................................................... 11 2.3.1. Metode Ekstraksi .......................................................... 11 2.3.1.1............................................................................ Ekstraksi Cara Dingin ...................................................... 11 2.3.1.2............................................................................ Ekstraksi Cara Panas ........................................................ 12 2.4. Uji Toksisitas ........................................................................... 13 2.4.1. Uji Toksisitas Akut Oral .............................................. 13 2.4.2. Uji Toksisitas Subkronik Oral ...................................... 14 2.4.3. Uji Toksisitas Kronik Oral ........................................... 14 2.5. Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)......................................... 15 2.6. Artemia Salina Leach ............................................................... 15



ii



2.6.1. 2.6.2. 2.6.3. 2.6.4.



Toksonomi Artemia Salina Leach ................................ Ekologi Spesies ............................................................ Deskripsi ...................................................................... Siklus Hidup .................................................................



iii



16 17 18 19



BAB III METODE PENELITIAN......................................................... 3.1. Jenis Penelitian.......................................................................... 3.2. Tempat dan Waktu Penelitian................................................... 3.3. Populasi dan Sampel................................................................. 3.3.1. Populasi ........................................................................ 3.3.2. Sampel .......................................................................... 3.3.3. Pengambilan Sampel .................................................... 3.4. Determinasi Tanaman .............................................................. 3.5. Alat dan Bahan ......................................................................... 3.5.1. Alat ............................................................................... 3.5.2. Bahan ............................................................................ 3.6. Prosedur Kerja .......................................................................... 3.6.1. Persiapan dan Pembuatan Simplisia ............................. 3.6.2. Pembuatan Ekstrak Herbal Puguntanoh........................ 3.6.3. Pembuatan Air Laut Buatan (ALB) ............................. 3.6.4. Penetasan Larva Udang ................................................ 3.6.5. Persiapan Larutan Sampel Yang Akan Diuji ............... 3.6.6. Prosedur Uji Toksisitas Dengan Metode BSLT ........... 3.7. Pengolahan dan Analisis Data ..................................................



21 21 21 21 21 21 21 22 22 22 22 22 22 23 24 24 25 26 26



DAFTAR PUSTAKA..............................................................................



27



iv



DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.1. Kerangka Pikir Penelitian .............................................................................................. .............................................................................................. 6 Gambar 2.1. Puguntanoh (Picriafel-terrae Lour) .............................................................................................. .............................................................................................. 8 Gambar 2.2. Artemia Salina Leach .............................................................................................. .............................................................................................. 18 Gambar 2.3. Siklus Hidup Artemia .............................................................................................. .............................................................................................. 20



v



BAB I



PENDAHULUAN 1.1



Latar Belakang Indonesia memiliki sekitar 30.000 spesies tanaman, 940 di antaranya



digunakan sebagai tanaman obat. Penggunaan tanaman obat sebagai pengobatan tradisional merupakan pilihan pengobatan yang kini makin diminati, terlebih lagi dengan kesadaran untuk kembali ke alam dan juga karena relatif aman dan murah, bahkan dengan perkembangan yang kini ada makin mendapat perhatian bagi alternatif pelayanan kesehatan. Dari berbagai penelitian, obat tradisional telah diakui keberadaannya oleh masyarakat, dengan demikian meningkatkan manfaat tanaman



bagi



kesehatan



dan



menciptakan



kondisi



yang



mendorong



pengembangan obat tradisional (1). Indonesia kaya akan pengetahuan mengenai pengobatan tradisional. Hampir setiap suku bangsa di Indonesia memiliki khasanah pengetahuan dan cara tersendiri mengenai pengobatan tradisional. Sebelum dituliskan ke dalam naskah kuno, pengetahuan tersebut diturunkan secara turun-temurun melalui tradisi lisan (2). Obat Tradisional adalah bahan atau ramuan bahan yang berupa bahan tumbuhan, bahan hewan, bahan mineral, sediaan galenik atau campuran dan bahan-bahan tersebut yang secara turun temurun telah digunakan untuk pengobatan.Saat ini semangkin banyak masyarakat yang menggunakan bahan alam sebagai obat, sehingga diperlukan penelitan lebih lanjut mengenai uji keamanan obat tradisional (2).



1



2



Penggunaan obat tradisional sebagai upaya kesehatan promotif, preventif, kuratif, dan rehabilitatif cenderung meningkat. Hal ini dikarenakan adanya back to nature dan kepercayaan masyarakat terhadap kelebihan obat tradisional dibandingkan dengan obat modern, antara lain: efek sampingnya relatif kecil bila digunakan secara benar dan tepat adanya efek komplementer dan atau sinergisme dalam ramuan obat tradisional/komponen bioaktif tanaman obat pada satu tanaman bisa memiliki lebih dari satu efek farmakologi serta obat tradisional lebih sesuai untuk penyakit-penyakit metabolik dan degeneratif (3). Salah satu tanaman yang berkhasiat sebagai obat itu puguntanoh ( picria fel terrae Lour ). Puguntanoh ( picria fel terrae Lour ) merupakan jenis tanaman yang termasuk dalam famili Scrophulariceae dan banyak dimanfaatkan sebagai obat untuk mengobati berbagai macam penyakit seperti rematik, asam urat. Tumbuhan ini digunakan secara tradisional sebagai hepatoprtektor dan agen antiinflamasi. Berdasarkan penelitian sebelumnya, puguntanoh diketahui memiliki efek farmakologis sebagai antielmintik, antidiabetes, antikanker, efek diuretik, antinflamasi dan efek kardioprotektif (4),(5). Menurut penelitian Surbakti Chemayanti (2018), skrining fitokimia menunjukan bahwa herba puguntanoh (picria fel terrae Lour) mengandung flavonoid,glikosida,saponin,tanin dan steroid (6). Menurut penelitian sebelumnya, puguntanoh (piria fel terrae Lour) telah digunakan secara tradisional sebagai stimulan, diuretik, antimalaria, demam, infeksi herpes, kanker dan peradangan (7), hiperglikemia (8), antihiperurisemia (9).



3



Metode skrining tumbuhan untuk membuktikan bahwa suatu tanaman bisa digunakan sebagai antikanker apabila tumbuhan tersebut mengandung senyawa yang bersifat sitotoksik. Uji toksisitas dilakukan dengan mengamati kematian hewan percobaan dan respon kematian ini dianggap sebagai pengaruh senyawa yang diuji. Menurut penelitian Alfiah Syari W (2007) uji toksisitas subkronik ekstrak etanol daun puguntanoh (piria fel terrae Lour) pada jantung tikus dengan dosis 500 mg/kg bb dan 1000 mg/kg bb sudah memberikan efek toksik. Uji toksisitas dimaksudkan untuk memaparkan adanya efek toksik dan untuk meneliti batas keamanan dalam kaitannya dengan penggunaan senyawa yang ada dalam tumbuhan tersebut (10),(11). Penelitian dengan menggunakan tumbuhan herba puguntanoh (piria fel terrae Lour) bertujuan untuk skrining awal senyawa aktif dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test yang pernah dilakukan oleh Meyer dkk pada tahun 1982 untuk mengetahui senyawa yang bersifat toksik terhadap Artemia salina Leach. Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) sering digunakan untuk praskrining terhadap senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak tumbuhan karena murah, cepat, mudah dan dapat dipercaya (12). OlehKarenaitu, peneliti tertarik untuk mengetahui lebih lanjut khasiat pada tanaman puguntanoh sebagai uji toksisitas dengan menggunakan ekstrak etanol herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour) terhadap Artemia Salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test ( BSLT).



4



1.2. a.



Rumusan Masalah Apakah ekstrak etanol herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour) memiliki toksisitas terhadap Artemia Salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test ( BSLT)?



b.



Berapakah nilai LC50 ekstrak etanol herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour) terhadap Artemia Salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test ( BSLT)?



1.3. a.



Hipotesis Ekstrak etanol herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour) mempunyai toksisitas terhadap larva udang (Artemia salina Leach)



b.



Ekstrak etanol bersifat toksik menurut metode BSLT karena memiliki LC50 kurang dari 1000 μg/ml.



1.4 a.



Tujuan Penelitian Menentukan data presentase kematian larva udang setelah pemberian ekstrak etanol herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour)



b.



Menentukan nilai LC50 ekstrak etanol herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour) terhadap Artemia Salina Leach



dengan metode Brine Shrimp



Lethality Test ( BSLT)? 1.5.



Manfaat penelitian Hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah sumber informasi bagi



masyarakat mengenai aktivitas toksisitas herba puguntanoh (Picria fel terrae



5



Lour) sebagai salah satu tanaman yang dapat digunakan secara luas oleh masyarakat. 1.6.



Kerangka pikir penelitian



Variabel bebas



Variabel terikat



Parameter



Herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour)



Ekstrak etanol Herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour)1000 ppm, 750ppm , 500 ppm



Sitotoksik terhadap Arthemia salina Leach dengan metode BSLT



% Kematian Larva Arthemia Salina Leach



Nilai LC50



Gambar 1.1. Kerangka pikir penelitian



BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1.



Uraian Tumbuhan Uraian tumbuhan meliputi morfologi tumbuhan, habitat, sistematika, nama



asing, nama daerah, manfaat, dan kandungan kimia. 2.1.1. Sistematika tumbuhan Kingdom



: Plantae



Divisi



: Spermatophyta



Subdivisi



: Angiospermae



Kelas



: Dicotyledonae



Subkelas



: Asteridae



Ordo



: Scrophulariales



Famili



: Linderniaceae



Genus



: Picria



Spesies



: Picria fel-terrae Lour.



2.1.2. Morfologi tumbuhan Herba puguntano merupakan herba tahunan yang tumbuh hingga setinggi 1 meter, meskipun kebanyakan tumbuh kurang dari 1 meter. Tumbuhan ini memiliki batang dengan cabang yang jarang, tegak atau melata, segiempat, berakar di buku-buku, berbulu halus yang padat. Daunnya tunggal berhadapan, bundar telur, pangkal daun membaji sampai membundar, ujung daun agak melancip, tepi daun beringgitan, berbulu halus. Pembungaan berupa tandan di ujung atau di batang, jumlah bunga 2-16, daun gagang kecil, melanset, mahkota



6



7



bunga menabung, berbibir rangkap, gundul bagian lur, bagian dalam ada kelenjar bulu, bibir atas berwarna coklat kemerah-merahan, bibir bagian bawah berwarna putih. Buah kapsul lonjong, padat, berkatup dua dengan beberapa biji. Biji membulat dengan diameter sekitar 0,6 mm (13).



Gambar2.1.PugunTanoh(Picriafel-terrae Lour.) 2.1.3 Nama Daerah dan Nama Asing Tumbuhan Nama lain tumbuhan ini yaitu Tamah Raheut (Sunda), daun Kukurang (Maluku), Papaita (Ternate). Nama asing tumbuhan ini yaitu Kong Saden (Laos), Hempedu Tanah, Gelumak Susu, Rumput Kerak Nasi (Malaysia), Thanh, M[aaj]t d[aas]t (Vietnam) (13). 2.1.4 Sinonim



amara



Curanga



amara



Juss.,



(Juss.)



Roxb.,



Curanga



melissiafolia A. Juss (14).



Curanga



torenioides



fel-terrae



(Lour.)



Steud.,



Gratiola



Merr.,



Curanga



8



2.1.5 Khasiat Tumbuhan Puguntanoh Masyarakat menggunakan tanaman puguntanoh sebagai obat cacing, obat sakit perut, serta mengatasi kudis, memar, bengkak, batuk rejan. Beberapa penelitian juga menyatakan bahwa daun puguntanoh dapat digunakan sebagai obat antiasma, antiinflamasi, diuretik,



antelmentik,



kardioprotektif,



antikanker



payudara (15), antibakteri (16) dan antidiabetes (17). 2.1.6. Kandungan Kimia (18) 2.1.6.1. Flavonoid Flavonoid adalah senyawa metabolit sekunder yg memiliki struktur inti C6-C3-C6 yaitu dua cincin aromatik yang dihibungkan dengan 3 atom C, biasanya dengan ikatan atam O yang berupa ikatan oksigen heterosiklik. Senyawa ini dapat dimasukkan sebagai senyawa polofenol karena mengandung dua atau lebih gugus hidroksil, bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Umumnya flavonoid ditemukan berkaitan dengan gula membentuk glikosida yang menyebabkan senyawa ini lebih mudah larut dalam pelarut polar, seperti metanol, etanol, butanol, etil asetat. Bentuk glikosida memiliki warna yang lebih pucat dibandinkan bentuk aglikon. Dalam bentuk aglikon, sifatnya kurang polar, cenderung lebih mudah larut dalam pelarut klorofom dan eter. Flavonoid



khususnya



dalam



bentuk



glikosida



akan



mengalami



dekomposisi oleh enzim jika dalam bentuk masih segar atau tidak dikeringkan. Untuk mengekstraksi flavonoid, harus diperhatikan polaritas dan tujuan yang dikehendaki. Beberapa flavonoid yang bersifat kurang polar (isoflavon, flavanon, flavon termetilasi, dan flavonol) dapat diekstraksi menggunakan pelarut dengan



9



polaritas rendah, seperti klorofom dan eter. Dalam tumbuhan biasanya flavonoid terdapat dalam bentk glikosida baik sebagai flavonoid O-glokosida atau flavonoid C-glikosida. 2.1.6.2 Tanin Tanin merupakan suatu senyawa polifenol yang tersebar luas



dalam



tumbuhan, dan pada beberapa tanaman terdapat terutama dalam jaringan kayu seperti kulit batang , dan jaringan lainnya, yaitu daun dan buah. Beberapa pustaka mengelompoka tanin dalam senyawa golongan fenol. Tanin berbentuk amorf yang mengakibatkan terjadinya koloid dalam air, memikiki rasa sepat, dengan protein memiliki endapan yang menghambat kerja enzim proteolitik, dan dapat digunakan dalam industri sebagai penyamak kulit hewan. Sifat tanin sebagai astrigen dapat dimanfaatkan sebagai antidiare, menghilangkan pendarahan, dan mencegah peradangan terutama pada mukosa mulut serta digunakan sebagai antidotum pada keracunan logam berat dan alkaloid. Tanin juga digunakan sebagai antiseptik karena adanya gugus fenol. 2.1.6.3. Saponin Saponin adalah suatu senyawa yang memiliki bobot molekul tinggi atau besar, tersebar dalam beberapa tumbuhan, merupakan bentuk glikosida dengan molukul gula yang terikat dengan aglikon triterpen atau steroid. Molekul gula biasanya terikat pada gugus OH terutama pada posisi C-3 atau pada 2 gugus OH atau pada satu gugus OH dan satu gugus COOH. Beberapa triterpen memiliki rasa pahit seperti limonin yang terdapat pada buah jeruk, terutama pada bagian kulit



10



kukurbitasin yang terdapat pada biji labu merah, sedangkan glisirizin yang terdapat dalam akar manis memiliki rasa manis. 2.1.6.4. Stroid Steroid merupakan senyawa metabolit sekunder dengan berbagai fungsi biologis yang penting dan tersebar luas baik dalam jaringan tumbuhan maupun hewan. Steroid yang terdapat pada hewan pada umumnya bertindak sebagai hormon, sedangkan steroid sintetik digunakan secara luas sebagai bahan obat Digitoksin merupakan senyawa steroid yang dapat memacu kerja jantung, contoh lain seperti kortison, kortisol dan prenidsone digunakan untuk mengobati peradangan karena alergi atau encok ( Rheumatoid arthilis) dan noretinodrel digunakan untuk menekan ovolasi sebagai metoda pembatasan kelahiran. Steroid merupakan senyawa yang terdapat pada tumbuh-tumbuhan, yang terdiri dari bermacam jenis. 2.2



Simplisia Simplisia adalah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai obat yang



belum mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dikatakan lain, berupa bahan yang telah dikeringkan. Simplisia dibedakan menjadi tiga yaitu, simplisia nabati, simplisia hewani dan simplisia pelikan (mineral).Simplisia nabati adalah simplisia yang berupa tumbuhan utuh, bagian tumbuhan atau eksudat tumbuhan. Eksudat tumbuhan ialah isi sel yang secara spontan keluar dari tumbuhan atau isi sel yang dengan cara tertentu dikeluarkan dari selnya, atau senyawa nabati lainnya yang dengan cara tertentu dipisahkan dari tumbuhannya dan belum berupa senyawa kimia murni .Proses pemanenan dan preparasi simplisia merupakan



11



proses yang dapat menentukan mutu simplisia dalam artian, yaitu komposisi kandungan senyawa, kontaminasi dan stabilitas bahan (19). 2.3.



Ekstraksi Menurut Farmakope Indonesia Edisi IV, ekstrak merupakan sediaan kental



yang diperoleh dengan cara mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati ataupun simplisia hewani dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan



sedemikian,



sehingga



memenuhi



baku



yang



telah



ditetapkan .Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan senyawa kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan menggunakan pelarut cair. Metode ekstraksi dengan menggunakan pelarut dapat dibagi menjadi dua cara, yaitu ekstraksi cara panas dan ekstraksi cara dingin (19), (20). 2.3.1



MetodeEkstraksi (19)



2.3.1.1 Ekstraksi Cara Dingin a.



Maserasi Maserasi adalah proses pengekstrasian simplisia dengan menggunakan



pelarut beberapa kali pengocokan atau pengadukan, pada temperatur ruangan (kamar). Pelarut yang biasa digunakan adalah etanol.Secara teknologi termasuk ekstraksi



dengan



prinsip



metode



pencapaian



konsentrasi



pada



saat



keseimbangan.Remaserasi merupakan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama dan seterusnya.



12



b.



Perkolasi Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai menjadi



sempurna yang umumya dilakukan pada temperatur ruangan. Proses ini terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahapan maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya



(penetesan/penampung



ekstrak)



secara



terus-menerus



sampai



diperoleh ekstrak perkolat. 2.3.1.2 Ekstraksi Cara Panas a. Refluks Refluks adalah ekstraksi menggunakan pelarut pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik umumnya dilakukan pengulangan peroses pada residu pertama sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk peroses



ekstraksi



sempurna. b. Sokletasi Sokletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru, pada umumnya dilakukan dengan alat yang khusus sehingga terjadi ekstraksi secara kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. c. Infundasi Infundasi adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur terukur selama waktu tertentu (15-20 menit). d. Digesti



13



Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur kamar (40-50°C). e. Dekoktasi Dekoktasi adalah infundasi dengan waktu yang lebih lama (30 menit) dan temperatur sampai titik didih air. 2.4.



Uji Toksisitas (21) Uji toksisitas adalah suatu uji untuk mendeteksi efek toksik suatu zat pada



sistem biologi dan untuk memperoleh data dosis-respon yang khas dari sediaan uji. Data yang diperoleh dapat digunakan untuk memberi informasi mengenai derajat bahaya sediaan uji tersebut bila terjadi pemaparan pada manusia, sehingga dapat ditentukan dosis penggunaannya demi keamanan manusia. Uji toksisitas menggunakan hewan uji sebagai model berguna untuk melihat adanya reaksi biokimia, fisiologik dan patologik pada manusia terhadap suatu sediaan uji. Hasil uji toksisitas tidak dapat digunakan secara mutlak untuk membuktikan keamanan suatu bahan/ sediaan pada manusia, namun dapat memberikan petunjuk adanya toksisitas relatif dan membantu identifikasi efek toksik bila terjadi pemaparan pada manusia. 2.4.1



Uji toksisitas akut oral Uji toksisitas akut oral adalah suatu pengujian untuk mendeteksi efek



toksik yang muncul dalam waktu singkat setelah pemberian sediaan uji yang diberikan secara oral dalam dosis tunggal, atau dosis berulang yang diberikan dalam waktu 24 jam.



14



Prinsip uji toksisitas akut oral yaitu, sediaan uji dalam beberapa tingkat dosis diberikan pada beberapa kelompok hewan uji dengan satu dosis per kelompok, kemudian dilakukan pengamatan terhadap adanya efek toksik dan kematian. Hewan yang mati selama percobaan dan yang hidup sampai akhir percobaan diotopsi untuk dievaluasi adanya gejala-gejala toksisitas. 2.4.2. Uji toksisitas subkronik oral Uji toksisitas subkronis oral adalah suatu pengujian untuk mendeteksi efek toksik yang muncul setelah pemberian sediaan uji dengan dosis berulang yang diberikan secara oral pada hewan uji. Prinsip dari uji toksisitas subkronis oral adalah sediaan uji dalam beberapa tingkat dosis diberikan setiap hari pada beberapa kelompok hewan uji dengan satu dosis per kelompok selama 28 atau 90 hari, bila diperlukan ditambahkan kelompok satelit untuk melihat adanya efek tertunda atau efek yang bersifat reversibel. Selama waktu pemberian sediaan uji, hewan harus diamati setiap hari untuk menentukan adanya toksisitas. 2.4.3



Uji toksisitas kronik oral Uji toksisitas kronis oral adalah suatu pengujian untuk mendeteksi efek



toksik yang muncul setelah pemberian sediaan uji secara berulang sampai seluruh umur hewan. Uji toksisitas kronis pada prinsipnya sama dengan uji toksisitas subkronis, tetapi sediaan uji diberikan selama tidak kurang dari 5- 12 bulan. Tujuan dari uji toksisitas kronis oral adalah untuk mengetahui profil efek toksik setelah pemberian sediaan uji secara berulang selama waktu yang panjang, untuk menetapkan tingkat dosis yang tidak menimbulkan efek toksik.



15



2.5.



Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) (12) Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) adalah salah satu metode untuk



menguji bahan-bahan yang bersifat toksik dan digunakan sebagai suatu bioassay yang pertama untuk penelitian bahan alam dan sebagai antitumor, pestisida, dan skrining ekstrak tumbuhan untuk aktivitas farmakologi. Metode ini menggunakan larva Artemia salina Leach sebagai hewan coba. Uji toksisitas dengan metode BSLT ini merupakan uji toksisitas akut dimana efek toksik dari suatu senyawa ditentukan dalam waktu singkat, yaitu rentang waktu selama 24 jam setelah pemberian dosis uji. Prosedurnya dengan menentukan nilai LC50 dari aktivitas komponen aktif tanaman terhadap larva Artemia salina Leach. Suatu ekstrak dikatakan toksik berdasarkan metode BSLT jika harga LC < 1000 μg/ ml. Teknik ini cepat, sederhana (tindakan aseptic tidak diperlukan), mudah, tidak mahal, dan menggunakan sejumlah material uji (2-20 mg atau kurang). BSLT digunakan untuk memprediksi aktivitas toksisitas dan peptisidal. Metode ini telah terbukti memiliki korelasi dengan aktivitas antikanker. BSLT menggunakan larva (nauplia) Artemia salina Leach digunakan sebagai hewan coba .Jumlah kematian larva dihitung setelah 24 jam perlakuan dan hasilnya dinilai sebagai LC50 atau LD50, dosis yang dibutuhkan untuk membunuh 50% larva. Tolak ukur atau parameter yang digunakan untuk menunjukkan adanya aktivitas biologi suatu senyawa pada Artemia salina Leach yaitu dengan menghitung jumlah kematian larva udang akibat pemberian senyawa dengan konsentrasi yang telah ditetapkan. Hasil uji dikatakan efektif



terhadap larva



Artemia salina Leach apabila ekstrak yang diujikan menyebabkan 50% kematian



16



pada kurang dari 1000 ppm. Apabila suatu ekstrak tanaman bersifat toksik menurut harga LC50 dengan metode BSLT, maka tanaman tersebut dapat dikembangkan sebagai obat antikanker. Hal ini disebabkan karena terdapat hubungan antara sitotoksis dan BSLT pada ekstrak tanaman yang diteliti. 2.6.



Artemia Salina Leach Artemia merupakan salah satu krustase yang banyak dimanfaatkan untuk



pakan alami hidup dalam pembenihan udang dan ikan, termasuk ikan hias. Krustase yang juga disebut Brine shrimp ini sangat populer dikalangan pembenihan udang karena dapat memacu pertumbuhan benih, mudah di cerna, dan kandungan nutrisinya yang tinggi, terutama karena kandungan proteinnya (40-60% berat total) dan kaya akan asam lemak ensesial. Bahkan, hingga saat ini artemia sebagai pakan alami untuk larva udang belum dapat digantikan dengan pakan lain tanpa harus mempengaruhi petumbuhan dan kelulusan hidupnya. Apalagi karena larva tersebut belum dapat memanfaatkan pakan buatan sebagai makanan. Biasanya, artemia yang digunakan untuk pakan larva udang dalam bentuk larva (terutama dalam tahap Nauplii) yang ditetaskan dari kista (telur) artemia. Sementara itu biomassanya banyak dimanfaatkan untuk pakan ikan, ikan hias, atau bahkan dapat dimanfaatkan untuk pangan (22). 2.6.1. ToksonomiArtemia Salina Leach Artemia adalah jenis Crustacea tingkat rendah dari phyilum Arthropoda yang banyak mengandung nutrisi terutama protein dan asam- asam amino. Dalam dunia hewan Artemia atau Brine shrimp adalah merupakan makrozoo plankton yang diklasifikasikandalam:



17



Kingdom



: Animalia



Philum



: Arthopoda



Kelas



: Crustacea



Sub kelas



: Branchiopoda



Ordo



: Anostraca



Famili



: Artemiidae



Genus



: Artemia



Species



: Artemia salina (23).



Gambar 2.2Artemia salina Leach Sumber : Dumitrascu M, 2011 2.6.2. Ekologi Spesies (23) Artemia salina hanya hidup di danau dan kolam dengan salinitas tinggi (antara 60-300 ppt). Spesies ini endemik di Mediterranean, tapi dapat ditemukan di seluruh benua. Dapat mentolerir garam dalam jumlah besar (300g/L air) dan dapat hidup dalam lautan yang berbeda dari air laut, seperti kalium permanganat dan perak nitrat, sedangkan yodium berbahaya bagi spesies ini. Hewan ini mampu mengurangi tekanan osmotik hemolimf hiptonik dengan eksresi NaCl melawan



18



gradien konsentrasi. Keadaan ini bertujuan untuk menjaga hemolimf hipotonik ekstrim dalam konsentrasi garam yang ekstrim. Pertahanan lain dilakukan Artemia salina dalam air dengan defisiensi oksigen yang tinggi. Konsentrasi minimum oksigen untuk Artemia salina dewasa sangat rendah (0,5 mg/L) dan untuk nauplia kurang dari 0,3 mg/L. 2.6.3. Deskripsi (23) Tubuhnya dibagi menjadi 3 segmen : kepala, thorax, dan abdomen. Hewan jantan dewasa mempunyai panjang 8-10 mm, sedangkan pada betina 10-12 mm. Aretmia salina dewasa mempunyai 3 mata dan 11 pasang kaki. Dalam kondisi alami, pangan Artemia salina berupa algae, protozoa, dan detrius. Partikel yang kurang dari 40-60 mm akan dilepaskan oleh filter aktif non-selektif yang dimiliki oleh Artemia salina. Artemia salina jantan memiliki 2 organ reproduksi. Uterus dari Artemia salina betina berisi hingga 200 telur, baik pada spesies ovipar maupun ovovivar. Mereka memproduksi telur, yang mengapung dalam air dan dapat berkembang menjadi nauplia (larva) atau kista jika lingkungan tidak menguntungkan (kekeringan air). Kista adalah bentuk dorman dari hewan ini, yang akan bertahan lama dalam keadaan kering. Kista akan menetas menjai nauplia jika kondisi lingkungan memungkinkan. 2.6.4. Siklus hidup (24) Berdasarkan cara perkembang biakannya artemia dikenal dengan duagolongan, yaitu jenis biseksual dan jenis partenogenetik. Perkembangbiakan



19



padajenis biseksual harus melalui proses perkawinan antara induk betina dengan induk jantan, sedangkan pada jenis partenogenetik tidak ada perkawinan. Reproduksi pada artemia dapat terjadi secara ovovivipar maupun ovipar. Pada ovovivipar, yang keluar dari induknya itu sudah langsung hidup sebagai artemia muda, sedangkan pada cara ovipar, yang keluar dari induknya berupa telur yang bercangkang tebal, yang dinamakan kista. Ovoviviparitas biasanya terjadi apabila keadaan lingkungannya cukup baik, dengan kadar garam (salinitas) kurang dari 150 permil dan kandungan oksigennya cukup, sedangkan oviparitas akan terjadi apabila keadaan lingkungannya memburuk, dengan kadar garam lebih dari 150 permil dan kandungan oksigennya rendah. Telur yang bercangkang tebal itu memang disiapkan untuk menghadapi keadaan lingkungan yang buruk, bahkan juga kekeringan. Sementara itu embrio yang berada di dalam cangkang telurnya beristirahat (diapauze).



Gambar 2.3. Siklus hidup artemia



20



Apabila kista direndam di dalam air laut dengan tingkat salinitas 30-35 ppt maka akan terjadi hidrasi, setelah 24 jam, membran luar akan pecah dan kista menetas menjadi embrio, beberapa jam kemudian, embrio berkembang menjadi nauplius dan mampu berenang bebas di dalam air. Individu yang baru ditetaskan ini dikenal dengan instar I. Instar I ini akan berganti kulit menjadi instar II, demikian seterusnya sampai 15 kali. Setiap tahap pergantian kulit dinamai nomor instar pada tahap tersebut hingga pergantian kulit yang terakhir disebut instar XV, selanjutnya artemia berkembang menjadi individu dewasa dengan ukuran 10-20 mm. Perkembangan artemia dari proses penetasan sampai menjadi individu dewasa membutuhkan waktu sekitar 7-10 hari. Pada saat telah menjadi dewasa, artemia siap untuk melakukan proses perkawinan. Proses perkawinan pada artemia ditandai dengan penempelan individu jantan pada tubuh individu betina (riding position). Keadaan seperti ini berlangsung hingga telur masak.



BAB III METODELOGI PENELITIAN 3.1.



Jenis Penelitian Jenis



penelitian



ini



merupakan



penelitian



eksperimental



dengan



pendekatan post test-only control group design untuk menguji toksisitas akut ekstrak etanol herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour) terhadap larva udang Artemia salina Leach menggunakan metode BSLT. 3.2.



Tempat dan waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi dan Farmakologi



Fakultas Farmasi Institut Kesehatan Helvetia Medan. Penelitian dimulai pada bulan Januari s/d April 2020. 3.3.



Populasi dan Sampel



3.3.1. Populasi Populasi pada penelitian ini adalah tumbuhan herba puguntanoh(Picria fel terrae Lour) yang berasal dari Kota Pancur Batu, Provinsi Sumatera Utara. 3.3.2. Sampel Sampel yang digunakan yaitu dari tumbuhan herba puguntanoh ( Picria fel terrae Lour) 3.3.3. Pengambilan Sampel Cara pengambilan sampel pada penelitian ini adalah dengan purposive random sampling yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan serupa dari



21



22



daerah lain.Sampel yang digunakan diambil dari Kota Pancur Batu, provinsi Sumatera Utara. 3.4.



Determinasi Tanaman Identifikasi terhadap herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour) untuk



mengetahui identitas taksonominya dilakukan di Herbarium Medanese (MEDA) Universitas Sumatera Utara. 3.5.



Alat dan Bahan



3.5.1. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah gelas ukur, beaker gelas, tabung reaksi, erlenmeyer, blender, timbangan analitik, rotary evaporator, pipet tetes, bejana kaca maserasi, batang pengaduk, spatula, kertas saring, lampu pijar, ayakan 65 mesh, desikator, oven, seperangkat alat penetasan larva (wadah plastik, lakban hitam, sterofom, aluminium foil, lampu) 3.5.2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan adalah ekstrak herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour) etanol, aquadest, air laut buatan, telur larva Artemia salina Leach, DMSO. 3.6.



Prosedur Kerja



3.6.1. Persiapan dan Pembuatan Simplisia Herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour)



diambil



pada



pagi



hari



sebanyak 3kg, kemudian dilakukan sortasi basah untuk memisahkan kotoran – kotoran atau bahan asing lainya dan ditimbang. Selanjutnya dilakukan pencucian



23



untuk menghilangkan tanah dan pengotoran lainya yang melekat pada bahan simplisia dan dirajang. Setelah itu proses pengeringan dilemari pengering untuk mendapatkan simplisia yang tidak mudah rusak, sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama, kemudian diblender untuk mendapatkan serbuk simplisia (25). 3.6.2. Pembuatan Ekstrak Herba Puguntanoh Metode yang digunakan adalah maserasi. Dengan perbandingan 1 : 10 serbuk simplisia dimaserasi selama 5 hari, sebanyak 500 gr simplisia dimasukan kedalam bejana kaca kemudia direndam dengan 3.700 ml pelarut etanol 96% ditutup dengan alumunium foil selama 3 hari (sesekali diaduk) lalu disaring menggunakan kertas saring dan diperoleh fitrat I dan residu. Residu direndam ulang dengan menggunakan 1.250 ml pelarut etanol 96% selama 2 hari (sesekali diaduk ) kemudian disaring menggunakan kertas saring dan diperoleh fitrat II dan residu. Dimasukan fitrat I dan II lalu dievaporasi dengan menggunakan rotary evaporator dengan suhu 400C sampai diperoleh ekstrak kental (26). 3.6.3. Pembuatan Air Laut Buatan ( ALB) Air Laut Buatan (ALB) disiapkan dengan cara melakukan 15 gr NaCl kedalam 1 liter aquadest. Kemudian air Laut tersebut terlebih dahulu diukur pH nya menggunakan pH meter, diperoleh pH nya 8-9 (27). 3.6.4.



Penetasan Larva Udang Penetasan larva udang dilakukan didalam wadah



plastik.Sebelumnya wadah plastik dibagi menjadi bagian terang dan gelap, lalu diberi pembantas berupa sterofoam yang tepi bawahnya telah dilubangi agar telur



24



yang menetas bisa keluar dari lubang tersebut.Wadah kemudian diisi dengan air laut hingga kedua lubang pada sterofoam tersebut terendam.Pada ruang gelap diisi 1 sendok telur, kemudian ditutup dengan menggunakan lakban hitam dan aluminium foil. Pada ruang terang diberi penerangan menggunakan cahaya lampu neon untuk merangsang penetasan. Kemudian pada ruang terang dipasang aerator untuk memberikan oksigen pada telur yang menetas menjadi larva dan berpindah keruang terang. Setelah telur menrtas menjadi larva yang berusia 24 jam, lalu dipindahkan kewadah lain hingga berusia 48 jam. Larva yang berusia 48 jam dapat dijadikan hewan uji pada percobaan metode BSLT (12). 3.6.5. Persiapan Larutan Sampel yang Akan Diuji Untuk menentukan konsentrasi ektrak yang efektif untuk membunuh Artemia salina Leach. Uji ini bertujuan untuk menentukan presentase kematian hewan uji dengan konsentrasi 1000 ppm, 750 ppm, 500 ppm. Larutan induk dibuat dari 200 mg ekstrak yang telah ditimbang lalu dilarutkan dengan DMSO 2 mL dan ditambah aquadest hingga volumenya mencapai 100 mL sehingga didapatkan konsentrasi larutan induk 2000 ppm (28). Setelah didapatkan larutan induk 2000 ppm, dilakukan pengenceran untuk mendapatkan larutan uji dengan konsentrasi 1000 ppm, 750 ppm, 500 ppm. Rumus pengenceran sebagai berikut: V1M1 = V2M2 Keterangan : V1 = volume awal V2 = volume akhir



25



M1 = konsentrasi awal M2 = konsentrasi akhir



3.6.6. Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT Larutan uji dengan konsentrasi 1000 ppm, 750 ppm, 500 ppm. Masing-masing dipipet sebanyak 10 mL dimasukkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ekor larva udang Artemia Salina Leach yang telah berumur 48 jam. Setiap konsentrasi dilakukan 3 kali pengulangan dan dibandingkan dengan kontrol negatif. Dihitung jumlah larva yang mati setelah 24 jam pada masing – masing tabung reaksi. Perhitungan dilakukan dengan menggunakan lup, digital colony counter, atau dibawah penerangan lampu. Larva yang mati diketahui dari tidak adanya pergerakan selama pengamatan (29). Tabel 3.1 Jumlah Masing-Masing Konsentrasi Ekstrak Pada Tabung Uji Tabung Uji I Tabung Uji II Tabung Uji III Tabung Uji IV 10 larva Artemia 10 larva Artemia 10 larva Artemia 10 larva Salina + Larutan Salina + Larutan Salina + Larutan Artemia Salina+ konsentrasi 1000 konsentrasi ppm + air laut



3.7.



ppm + air laut



750 konsentrasi



500 Air laut



ppm + air laut



Pengolahan dan Analisis Data Untuk menentukan presentase kematian larva



untuk setiap konsentrasi dengan cara sebagai berikut: % Mortalitas=



Jumlahlarva yang mati ×100 % Jumlah larvauji Pada metode analisis probit manual, nilai probit



diketahui dengan mengkonversi nilai persen kematian larva tiap konsentrasi ke



26



nilai probit dalam tabel. Dilanjutkan dengan menentukan log konsentrasi dan membuat persamaan garis lurus y = mx+b, dengan y adalah nilai probit dan x adalah log konsentrasi. Metode



analisis



dapat



juga



menggunakan



Microsoft Office Excel dengan membuat grafik persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan log konsentrasi. Nilai LC50 dapat dihitung dari persamaan garis lurus dengan memasukkan nilai 5 sebagai y. Nilai 5 didapatkan berdasarkan nilai probit 50 % kematian hewan uji. Sehingga dihasilkan nilai x sebagai log konsentrasi. Nilai LC50 merupakan antilog nilai x tersebut (28).



DAFTAR PUSTAKA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21.



Hendrawati A. Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Daun Kemangi (OCimum sanctum Linn) Terhadap Artemia Salina Leach dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). 2009; Parwita A. Jurusan Kimia Laboratorium Kimia Organik FMIPA Universitas Udayana. 2016; Sari. Pemanfaatan Obat Tradisional dengan Pertimbangan Manfaat dan Keamanannya. Maj Ilmu Kefarmasian. 2009;III. Juwita N. Karakteristik Simplisia dan Uji Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Puguntanoh (Curanga Fel-Terrae Merr) Terhadap Mencit Jantan. 2009; Huang Y. Biological Activities of Picriafel-terrae Lour. Pharmceutical World Sci. 1994;16. Surbakti C. Pengaruh Kombinasi Ekstrak Daun Pirdot (Saurauiavulcani Korth) dan Herba Puguntanoh (Picria fel terrae Lour) Terhadap Kadar SOD, HbA1c, Ekspresi Insulin Pada Tikus Hiperglikemia. 2018; Lestari P. Combinational Effects of nhexana extract of puguntanoh leaves (picriafel terrae lour) with doxorubicin on MCF-7 breast cancer cells. 2015; Pakpahan YK. Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Herba Puguntano (Picria fel0terrae Lour) Terhadap Proliferasi Sel Pada Aorta Tikus Hiperglikemia Melalui Ekspresi Ki-67. 2018; Ardiyanti R. Efek Antihiperurisemia Ekstrak Etanol Herba Puguntanoh (Picria fel-terrae Lour) Terhadap Tikus Jantan. 2018; Cassaret, Doull. Toxikology the Basic Science of Poison. New York: Macmilan Publishing CO Inc; 1975. Alfiah. Uji Toksisitas Subkronik Ekstrak Etanol Daun Puguntanoh (Picriafel terrae Lour) pada Jantung Tikus. 2017; Meyer B. Brine Shrimp: a Convenient General Biossay for Active Plant Constituents. Planta Med. 1982; Anonim. Sagai-Uak. 2015. Anonin. Picriafel-terrae Lour. 2012. Harahap U. Hepatoprtective Activity Fromethanol Extract of Pugun Tanoh Leave (Curangafel-terrae Lour) MERR. Asian J Pharm Clin Res. 2017;10. Mustika N. Pembuatan Nanopartikel dari Ekstrak Etanol Daun Puguntanoh (Picriafel-terrae Lour) dan Uji Aktivitas Antibakteri Terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia Coli. 2018; Harfina F. The Effect of Puguntano Leaf Powder (Curanga fel-terrae Merr) on Patients with Diabetes Mellitus. 2012; Hanani E. Buku Analisis Fitokimia. Jakarta: Buku Kedokteran EGC; 2014. Departemen Kesehatan RI. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Direktorat Pengawasan Obat Tradisional; 2000. 3–11 p. Ditjen POM. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta; 1995. BPOM RI. Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia Nomor 7 Tahun 2014 Tentang Pedoman Uji Toksisitas Non



27



28



22. 23. 24. 25. 26. 27.



28. 29.



Klinik Secara InVivo. Jakarta; 2014. Wibowo S. Artemia. Jakarta: Penebar Swadaya; 2013. Dumiratscu M. Artemia asalina. Balneo-Research Jorunal. 2011;4. Harefa F. Pembudidayaan Artemia Untuk Pakan Udang dan Ikan. Jakarta: Penebar Swadaya; 1997. Depkes RI. Cara Pembuatan Simplisia. Jakarta; 1985. Ditjen POM. Farmakope Indonesia Edisi Ke-III. Jakarta; 1979. Wulandari F. UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL DAUN MAHKOTA DEWA ( Phaleria macrocarpa [ Scheff .] Boerl .) TERHADAP LARVA Artemia salina Leach DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST ( BSLT ). 2014. Hanifah NZ. Uji Toksisitas Akut Metanol Daun Sirsak (Annona muricata L) Terhadap Larva Artemia salina Leach Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). 2015; Smith J, Runtuwene MRJ. Uji Toksisitas Ekstrak Daun Benalu Langsat ( Dendrophthoe petandra ( L ) Miq ) dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test ( BSLT ) LC 50. 2015;4(2):157–60.