Herba Poguntano Novika [PDF]

Citation preview

PENGARUH EKSTRAK ETANOL HERBA PUGUNTANO (Picria fel-terrae Lour.) TERHADAP KADAR SOLUBLE RECEPTOR ADVANCED GLYCATION END PRODUCT PADA TIKUS HIPERGLIKEMIA



SKRIPSI Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara



OLEH: NOVIKA ASNIMAN 151524096



PROGRAM STUDI EKSTENSI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2018



Universitas Sumatera Utara



PENGARUH EKSTRAK ETANOL HERBA PUGUNTANO (Picria fel-terrae Lour.) TERHADAP KADAR SOLUBLE RECEPTOR ADVANCED GLYCATION END PRODUCT PADA TIKUS HIPERGLIKEMIA



SKRIPSI Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara



OLEH: NOVIKA ASNIMAN 151524096



PROGRAM STUDI EKSTENSI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2018



Universitas Sumatera Utara



PENGESAHAN SKRIPSI PENGARUH EKSTRAK ETANOL HERBA PUGUNTANO (Picria fel-terrae Lour.) TERHADAP KADAR SOLUBLE RECEPTOR ADVANCED GLYCATION END PRODUCT PADA TIKUS HIPERGLIKEMIA



OLEH: NOVIKA ASNIMAN NIM 151524096 Dipertahankan di Hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara Pada Tanggal: 22 Desember 2017



Pembimbing,



Panitia Penguji,



Dr. Panal Sitorus, M.Si., Apt. NIP 195310301980031002



Dr. Marline Nainggolan, M.S., Apt. NIP 195709091985112001



Dr. Panal Sitorus, M.Si., Apt. NIP 195310301980031002



Dra. Herawaty Ginting, M.Si., Apt. NIP 195112231980032002



Medan, Januari 2018 Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara Dekan,



Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt. NIP 195707231986012001



Universitas Sumatera Utara



KATA PENGANTAR



Puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan karunia yang berlimpah sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan skripsi yang berjudul “Pengaruh Ekstrak Etanol Herba Puguntano (Picria fel-terrae Lour.) terhadap Kadar Soluble Receptor Advanced Glycation End Product pada Tikus Hiperglikemia”. Skripsi ini diajukan untuk melengkapi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Pada kesempatan ini, dengan segala kerendahan hati penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi yang telah menyediakan fasilitas kepada penulis selama perkuliahan di Fakultas Farmasi. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Panal Sitorus, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah mengarahkan penulis dengan penuh kesabaran dan tanggung jawab, memberikan petunjuk dan saran-saran selama penelitian hingga selesainya skripsi ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ibu Dr. Marline Nainggolan, M.S., Apt., selaku ketua penguji dan Ibu Dra. Herawaty Ginting, M.Si., Apt., selaku anggota penguji yang telah memberikan saran dan arahan untuk menyempurnakan skripsi ini, dan Ibu T. Ismanelly Hanum, S.Si., M. Si., Apt., selaku dosen penasehat akademik yang telah banyak membimbing penulis selama masa perkuliahan hingga selesai. Ucapan terima kasih juga kepada Bapak dan Ibu staf pengajar Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara yang telah mendidik dan memberi arahan serta bimbingan kepada penulis selama masa perkuliahan. iv Universitas Sumatera Utara



Terima kasih sebesar-besarnya kepada keluarga tercinta, Ayahanda Akmal, Ibunda Asnita, Adikku Aldi dan Anissa, serta sahabat hidupku tercinta atas limpahan kasih sayang, semangat dan doa yang tak ternilai dengan apa pun. Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya di bidang farmasi.



Medan, Januari 2018 Penulis,



Novika Asniman NIM 151524096



v Universitas Sumatera Utara



vi Universitas Sumatera Utara



PENGARUH EKSTRAK ETANOL HERBA PUGUNTANO (Picria fel-terrae Lour.) TERHADAP KADAR SOLUBLE RECEPTOR ADVANCED GLYCATION END PRODUCT PADA TIKUS HIPERGLIKEMIA ABSTRAK Puguntano (Picria fel-terrae Lour.) merupakan tanaman dari suku Linderniaceae, di Sumatera Utara umumnya digunakan sebagai obat diabetes melitus. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol herba puguntano terhadap penurunan kadar glukosa darah (KGD), penurunan kadar soluble receptor advanced glycation end product (sRAGE) dan mengamati hasil gambaran histologi pankreas pada tikus jantan yang diinduksi streptozotosin (STZ). Herba puguntano diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 96% dan ekstrak dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 40 ºC. Pengujian dilakukan terhadap 25 tikus jantan, yang dibagi menjadi 5 kelompok. Kelompok 1 sebagai kontrol negatif diberikan Na-CMC 1%, kelompok 2, 3, 4 sebagai kelompok perlakuan diberikan ekstrak etanol herba puguntano (EEHP) dosis 100 mg/kg BB, 200 mg/kg BB dan 400 mg/kg BB, kelompok 5 sebagai kontrol positif yang diberikan metformin dosis 45 mg/kg BB. Ekstrak etanol herba puguntano memiliki rendemen sebanyak 15,89% dan hasil analisis statistik menunjukkan bahwa pemberian EEHP menunjukkan efek penurunan kadar glukosa darah dan sRAGE tikus yang bermakna dibandingkan kelompok kontrol negatif Na-CMC 1% (p < 0,05). Dosis terbaik ditunjukkan kelompok perlakuan 200 mg/kg BB dengan penurunan KGD (metformin 69,20 mg/dL; p400 79,80 mg/dL; p200 81,00 mg/dL; p100 119,60 mg/dL; Na-CMC 1% 384,20 mg/dL), sRAGE (metformin 18,722225 pg/mL; p200 23,09725 pg/mL; p400 27,819450 pg/mL; p100 28, 305550 pg/mL; Na-CMC 1% 169,069450 pg/mL) dan mencegah kerusakan lebih lanjut pada pankreas. Kata kunci: Herba, puguntano, streptozotosin, kadar pankreas, kadar sRAGE.



gula darah, histologi



vii Universitas Sumatera Utara



THE EFFECT OF ETHANOL EXTRACT OF PUGUNTANO (Picria fel-terrae Lour.) HERBS TOWARDS LEVEL OF SOLUBLE ADVANCED GLYCATION END PRODUCT IN HYPERGLYCEMIC RATS ABSTRACT Puguntano (Picria fel-terrae Lour.) is a plant from family Linderniaceae in north Sumatera generally used it as a diabetes melitus medicine. The purpose of this study ware to determined the effect of the extracts from ethanol herbs puguntano to decrease blood glucose levels (BGL), level of soluble receptor advanced glycation end products (sRAGE) and observe the results of histology of pancreas in male rats which induced by streptozotocin (STZ). Puguntano herbs was extracted by maceration using 96% ethanol solvent and extract concentrated with rotary evaporator at 40 ºC. The test were conducted with 25 male rats, which divided into 5 groups. 1st group as a negative control was given Sodium-CMC 1%, group 2nd, 3rd, 4th were given with ethanol extract of puguntano herbs (EEPH) at dose of 100, 200 and 400 mg/kg BW and 5th group ware given metformin at dose 45 mg/kg BW. Puguntano herbs ethanol extract had a rendemen of 15,89% and the results of statistical analysis showed that EEHP administration of the value of BGL and sRAGE were showed a significanly decreased effect in BGL and rat sRAGE compared to the negative control group of Sodium-CMC 1% (p 200 mg/dL) mengawali terjadinya patogenesis komplikasi vaskular diabetik melalui deaarrangement glukosa. Di sisi lain peningkatan glukosa ini dapat juga meningkatkan terbentuknya beberapa tipe Advanced Glycation End product (AGE) yang menstimulasi produksi reseptor AGE (RAGE) (Huebschmann dkk., 2006; Brownlee dkk., 2005). Reseptor Advanced Glycation End product (RAGE) terdiri dari RAGE bentuk tidak terlarut yang berada pada jaringan termasuk sel otot polos dan bentuk terlarut (sRAGE) yang berada pada sirkulasi (Yamagishi dan Matshui, 2010., Yamagishi, dkk., 2008). Kadar sRAGE dalam sirkulasi manusia meningkat pada penderita penyakit vaskular, sehingga dapat dijadikan sebagai biomarker pada penyakit komplikasi kardiovaskuler diabetik (Kojima, dkk., 1998). Pengukuran kadar sRAGE dapat dilakukan dengan berbagai cara dimana salah satunya menggunakan metode 2 Universitas Sumatera Utara



Enzym Linked Immunosorbent Assay yang merupakan reaksi ikatan antara antigen dan antibodi dengan bantuan enzim sebagai penanda (Crowther, 2001). Streptozotosin (STZ) adalah N-mehyl-N-nitrosoureido D-glucosamine yang bersifat toksik terhadap sel β pankreas dan berfungsi untuk mensekresi insulin, sehingga banyak digunakan untuk menginduksi diabetes pada hewanhewan percobaan (Pathak, dkk., 2008). Metformin adalah obat hipoglikemik oral yang termasuk kedalam golongan biguanida, mekanisme kerjanya meliputi stimulasi glikolisis, mengurangi glukoneogenesis hati dan memperlambat absorbsi glukosa dari saluran pencernaan (Handoko, dkk., 2004). Berdasarkan latar belakang diatas maka pada penelitian ini dilakukan pengujian pengaruh ekstrak etanol herba puguntano terhadap kadar sRAGE pada tikus yang diinduksi streptozotosin. Penelitian ini meliputi karakterisasi simplisia, uji pendahuluan, pembuatan ekstrak dilanjutkan dengan pengujian aktivitas hipoglikemik dengan beberapa konsentrasi dosis dan gambaran histopatologi pankreas untuk melihat efek ekstrak dalam menghambat kerusakan pankreas tikus setelah diinduksi streptozotosin.



1.2 Perumusan Masalah Berdasarkan latar belakang di atas maka dapat diambil perumusan masalah sebagai berikut: a. Apakah ekstrak etanol herba puguntano memiliki aktivitas hipoglikemik pada tikus yang diinduksi streptozotosin? b. Apakah ekstrak etanol herba puguntano dapat mencegah kerusakan lebih lanjut gambaran histopatologi pankreas tikus diabetes yang diinduksi dengan streptozotosin? 3 Universitas Sumatera Utara



c. Apakah pemberian ekstrak etanol herba puguntano menurunkan kadar soluble RAGE pada tikus yang diinduksi streptozotosin?



1.3 Hipotesis Berdasarkan perumusan masalah di atas maka dibuat hipotesis analisis sebagai berikut: a. Ekstrak etanol herba puguntano memiliki aktivitas dalam menurunkan kadar gula darah tikus yang diinduksi streptozotosin. b. Ekstrak etanol herba puguntano dapat mencegah kerusakan lebih lanjut gambaran histopatologi kelenjar pankreas tikus diabetes yang diinduksi dengan streptozotosin. c. Pemberian ekstrak etanol herba puguntano dapat menurunkan kadar soluble RAGE pada tikus yang diinduksi streptozotosin.



1.4 Tujuan Adapun tujuan dari penelitian ini adalah: a. Mengetahui aktivitas hipoglikemik ekstrak terstandar herba puguntano pada tikus yang diinduksi streptozotosin. b. Mengamati efek pemberian ekstrak etanol herba puguntano pada gambaran histopatologi kelenjar pankreas tikus diabetes melitus yang diinduksi streptozotosin. c. Mengetahui kadar soluble RAGE pada tikus yang diinduksi streptozotosin setelah pemberian ekstrak terstandar herba puguntano.



4 Universitas Sumatera Utara



1.5 Manfaat Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang pengaruh ekstrak etanol herba puguntano (Picria fel-terrae Lour.) terhadap kadar soluble Receptor Advanced Glycation End product (sRAGE) pada tikus hiperglikemia.



5 Universitas Sumatera Utara



1.6 Kerangka Pikir Penelitian Serbuk simplisia



Karakterisasi meliputi:  Makroskopik Penetapan:  Kadar air  Kadar sari yang larut air  Kadar sari yang larut etanol  Kadar abu total  Kadar abu yang tidak larut asam



     



Flavonoid Alkaloid Saponin Tanin Glikosida Steroid/Triterpenoid



Ekstrak etanol



Skrining fitokimia



Variabel bebas



Variabel terikat



Normal



Penurunan kadar gula darah



EEHP 100 mg/kg BB EEHP 200 mg/kg BB



Pembuatan ekstrak



Skrining fitokimia



Tikus yang telah diinduksi STZ 35 mg/kg BB



EEHP 400 mg/kg BB Metformin 45 mg/kg BB



Parameter



KGD tikus mg/dL



Kadar soluble RAGE



Kadar sRAGE pg/mL



Kerusakan pulau langerhans pankreas



Histopatologi pankreas tikus



Suspensi Na-CMC 1% Gambar 1.2 Kerangka pikir penelitian



6 Universitas Sumatera Utara



BAB II TINJAUAN PUSTAKA



2.1 Uraian Tumbuhan 2.1.1 Habitat Herba puguntano ini umumnya dapat ditemui di lereng hutan atau di tepi hutan yang teduh dan di daerah yang ketinggiannya sampai 900 meter di atas permukaan laut (Anonim, 2014). 2.1.2 Morfologi Herba puguntano merupakan herba tahunan yang tumbuh hingga setinggi 1 meter, meskipun kebanyakan tumbuh kurang dari 1 meter. Tumbuhan ini memiliki batang dengan cabang yang jarang, tegak atau melata, segiempat, berakar di buku-buku, berbulu halus yang padat. Daunnya tunggal berhadapan, bundar telur, pangkal daun membaji sampai membundar, ujung daun agak melancip, tepi daun beringgitan, berbulu halus. Pembungaan berupa tandan di ujung atau di batang, jumlah bunga 2-16, daun gagang kecil, melanset, mahkota bunga menabung, berbibir rangkap, gundul bagian lur, bagian dalam ada kelenjar bulu, bibir atas berwarna coklat kemerah-merahan, bibir bagian bawah berwarna putih. Buah kapsul lonjong, padat, berkatup dua dengan beberapa biji. Biji membulat dengan diameter sekitar 0,6 mm (Prohati, 2015). 2.1.3 Nama daerah dan nama asing tumbuhan Tumbuhan ini memiliki nama lain di beberapa daerah dan negara, seperti pugun tana, pogon tanoh (Dairi), tamah raheut (Sunda), daun kukurang (Maluku), parang rintek (Minahasa), ai laun ujin (Ambon) dan papaita (Ternate) (Heyne, 1987), sedangkan di negara lain tumbuhan ini dikenal dengan nama curanja 7 Universitas Sumatera Utara



(Inggris), kong saden (Laos), sagai-uak (Filipina), hempedu tanah, gelumak susu, rumput kerak nasi (Malaysia) dan thanh (Vietnam) (Stuartxchange, 2015). 2.1.4 Sinonim Puguntano memiliki beberapa sinonim yaitu Curanga amara Vahl., Curanga amara Juss., Curanga melissifolia A. Juss., Curanga torenioides Steud., Gratiola amara Roxb., Gratiola amara Vahl., Curanga fel-terrae Lour. dan Torenia cardiosepala Benth (Anonim, 2009). 2.1.5 Klasifikasi tumbuhan Kingdom



: Plantae



Divisi



: Spermatophyta



Subdivisi



: Angiospermae



Kelas



: Dicotyledonae



Subkelas



: Asteridae



Ordo



: Scrophulariales



Famili



: Linderniaceae



Genus



: Picria



Spesies



: Picria fel-terrae Lour.



2.1.6 Kegunaan Puguntano digunakan sebagai obat kolik (mulas mendadak dan hebat), malaria, diuretik, demam, amenorrhea, dan gangguan pada kulit (Perry, 1980). Puguntano di Cina Selatan biasanya digunakan untuk pengobatan demam, infeksi herpes, kanker, dan inflamasi (Zhong, dkk., 1979). Daun puguntano di Sumatera Utara umumnya digunakan sebagai obat penghilang rasa sakit di badan, meningkatkan daya tahan tubuh, antiaging (Harfina, 2012) dan untuk mengobati diabetes mellitus (Sitorus, dkk., 2014). 8 Universitas Sumatera Utara



2.1.7 Kandungan kimia Berdasarkan penelitian Juwita, (2009) diketahui bahwa tumbuhan puguntano mengandung senyawa kimia golongan glikosida, flavonoid, tannin dan steroid/triterpenoid. Penelitian yang dilakukan oleh Hasibuan, dkk., (2016) menyatakan bahwa di dalam Picria fel-terrae Lour. terdapat Picfeltarraenin IA dan IB yang merupakan senyawa glikosida steroid. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Sitorus, dkk., (2014) berhasil mengisolasi senyawa kimia dari ekstrak n-hexane daun puguntano yaitu 24-ethyl-5α-cholest-5-en-3β-ol (β-sitosterol). Flavonoid merupakan fenol bioaktif dengan berat molekul rendah dan memiliki peran dalam sintesis sel. Adapun hipotesis yang diajukan terhadap flavonoid antara lain menurunkan enzim aldoctase – reductase, regenerasi sel pankreas, meningkatkan pelepasan insulin dan meningkatkan uptake ion Ca2+ (Fernandez, dkk., 2006). Studi lain menemukan bahwa flavonoid merupakan komponen fenol dengan aktifitas biologi yang luas dan memiliki efek pada diabetes melalui inhibisinya pada enzim α – glukosidase atau pencegahan absorpsi glukosa dan atau memperbaiki toleransi glukosa (Patra, dkk., 2010).



2.2 Simplisia Simplisia merupakan bahan yang berasal dari alam yang adapat digunakan sebagai obat dimana bahan alam tersebut belum diolah dan masih berupa bahan yang telah dikeringkan. Simplisia dapat dibedakan menjadi 3 yaitu simplisia nabati, simplisia hewani, dan simplisia pelican (mineral). Simplisia nabati merupakan simplisia berupa tumbuhan utuh, bagian tumbuhan ataupun eksudat tumbuhan. Eksudat adalah isi sel dari tumbuhan yan secara spontan keluar dari 9 Universitas Sumatera Utara



tumbuhan atau isi sel yang dengan cara tertentu dipisahkan dari tumbuhannya dan belum berupa senyawa kimia murni (Depkes RI, 2000).



2.3 Ekstraksi Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut. Senyawa aktif yang terdapat dalam simplisia dapat digolongkan ke dalam golongan minyak atsiri, flavonoid, alkaloid dan lain-lain. Pemilihan pelarut akan lebih mudah bila senyawa aktif yang dikandung simplisia diketahui. Simplisia yang lunak seperti rimpang dan daun tidak perlu diserbuk sampai halus, tetapi simplisia yang keras seperti biji, kulit kayu dan kulit akar sulit untuk ditembus oleh pelarut, karena itu perlu diserbuk sampai halus (Depkes RI, 2000). 2.3.1 Cara dingin a. Maserasi Maserasi adalah cara penarikan simplisia dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari dengan beberapa kali pengadukan pada temperatur kamar tanpa terkena sinar matahari, sedangkan remaserasi merupakan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan pengeringan maserat pertama (Depkes RI, 2000). b. Perkolasi Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai terjadi penyarian sempurna yang umumya dilakukan pada temperatur kamar. Proses ini terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahapan maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan/penampung ekstrak) secara terus menerus sampai diperoleh perkolat (Depkes RI, 2000). 10 Universitas Sumatera Utara



2.3.2 Cara panas a. Refluks Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik (Depkes RI, 2000). b. Sokletasi Sokletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru, yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik (Depkes RI, 2000). c. Digesti Digesti adalah proses penyarian dengan pengadukan kontinu pada temperatur lebih tinggi daripada temperatur kamar, yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-50 ⁰C (Depkes RI, 2000). d. Infundasi Infundasi adalah proses penyarian dengan menggunakan pelarut air pada temperatur 90 ⁰C selama 15 menit (Depkes RI, 2000). e. Dekoktasi Dekoktasi adalah proses penyarian dengan menggunakan pelarut air pada temperatur 90 ⁰C selama 30 menit (Depkes RI, 2000). 2.3.3 Ekstrak Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair dibuat dengan menyari simplisia nabati atau hewani menurut cara yang cocok, diluar pengaruh cahaya matahari langsung, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian (Depkes RI, 1979). 11 Universitas Sumatera Utara



2.4 Diabetes Melitus 2.4.1 Pengertian diabetes melitus Diabetes melitus merupakan penyakit gangguan metabolisme kronis ditandai dengan kadar glukosa yang tinggi dalam darah disertai gangguan metabolisme karbohidrat, lipid, dan protein sebagai akibat insufisiensi fungsi insulin. Daya kerja insulin akan berkurang dikarenakan gangguan atau defisiensi produksi insulin oleh sel-sel beta langerhans kelenjar pankreas, atau disebabkan oleh kurangnya sensitivitas sel-sel tubuh terhadap insulin (Depkes RI, 2005). Meningkatnya kadar glukosa darah ini disebabkan karena tubuh kekurangan hormon insulin baik absolut maupun relatif. Absolut berarti tidak dapat menghasilkan insulin sama sekali, sedangkan relatif berarti sel β-pankreas masih dapat menghasilkan insulin akan tetapi daya kerjanya kurang maksimal (Umniyah, 2007). Diabetes melitus merupakan suatu keadaan dimana kadar glukosa darah dalam keadaan meningkat diatas normal (hiperglikemia). Keadaan tersebut perlahan namun pasti akan merusak jaringan dalam tubuh jika tidak ditangani secara tepat (Nurkhozin, dkk., 2011) 2.4.2 Klasifikasi diabetes melitus Menurut Soegondo (2008) diabetes dibagi menjadi 4 yaitu : a. Diabetes melitus tipe 1 Kebanyakan diabetes tipe 1 adalah anak-anak dan remaja yang pada umumnya tidak gemuk. Setelah penyakit diketahui mereka harus langsung menggunakan insulin. Pankreas sangat sedikit atau bahkan sama sekali tidak menghasilkan insulin. Bila insulin tidak ada, maka glukosa dalam darah tidak dapat masuk ke dalam sel dengan akibat kadar glukosa dalam darah meningkat. Keadaan inilah yang terjadi pada diabetes mellitus tergantung insulin. 12 Universitas Sumatera Utara



b. Diabetes melitus tipe 2 Diabetes ini sering terjadi pada orang dewasa atau berusia lanjut, walaupun akhir-akhir ini sudah mulai banyak ditemukan pada anak dan remaja. Seorang yang baru saja terkena diabetes tipe 2 masih dapat diatasi dengan makan teratur karena pada tahap awal insulin yang dihasilkan masih cukup banyak untuk mencukupi kebutuhan. Pada diabetes tipe 2 dengan berat badan lebih atau obesitas penurunan berat badan masih dapat mengendalikan diabetes tanpa harus menggunakan obat atau insulin. Penderita diabetes yang tidak gemuk peningkatan konsentrasi glukosa darah disebabkan oleh produksi insulin yang relative terlalu sedikit untuk dapat mempertahankan konsentrasi glukosa darah dalam batas-batas normal, sehingga kadar glukosa darah akan meningkat. Perjalanan penyakit diabetes tipe 2 tubuh pada mulanya tidak dapat menggunakan insulin secara efektif dan kemudian terjadi gangguan kemampuan sel β pankreas untuk menghasilkan hormon insulin atau terdapat gangguan terhadap kedua-duanya, ketika insulin tidak cukup atau tidak dapat berfungsi dengan benar, glukosa akan menetap dalam darah. Setelah cukup lama, glukosa akan bertambah banyak di dalam darah dan bila konsentrasi glukosa darah naik melebihi 160-180 mg/dL maka sebagian glukosa dikeluarkan melalui air seni (urin) dan terjadilah peningkatan glukosa didalamnya. c. Diabetes gestasional (kehamilan) Diabetes ini hanya terjadi pada saat kehamilan dan menjadi normal kembali setelah persalinan. d. Diabetes melitus tipe lain Kelainan pada diabetes tipe lain akibat kerusakannya atau kelainan fungsi kelenjar pankreas yang dapat disebabkan oleh bahan kimia dan obat-obatan. 13 Universitas Sumatera Utara



2.4.3 Penatalaksanaan diabetes melitus Penatalaksanaan diabetes melitus terdiri dari terapi tanpa obat dan terapi obat. a.



Terapi tanpa obat



i.



Pengaturan diet Pada penderita diabetes sangat perlu ditekankan keteraturan makan dalam



hal ini jadwal makan, jenis dan jumlah makanan. Bagi penderita diabetes tidak cocok disebut diet diabetes melainkan meal planning (Soegondo, 2008). ii.



Olah raga Kegiatan fisik dan olah raga teratur sangatlah penting selain untuk



menghindari kegemukan, juga untuk mencegah dan mengobati diabetes. Olahraga dapat membantu penurunan berat badan, karena dengan berolahraga penggunaan tenaga (energi/kalori) bertambah. Pada waktu bergerak otot-otot memakai lebih banyak glukosa (gula) dari pada waktu tidak bergerak, dengan demikian konsentrasi glukosa darah akan turun. Mulai olahraga atau aktivitas fisik insulin akan bekerja lebih baik, sehingga glukosa dapat masuk ke dalam otot untuk dibakar (Soegondo, 2008). b. Terapi obat i.



Terapi insulin Terapi insulin merupakan satu keharusan bagi penderita DM tipe 1 karena sel-sel β langerhans kelenjar pankreas penderita rusak, sehingga tidak lagi dapat memproduksi insulin. Penderita DM Tipe 1 harus mendapat insulin eksogen untuk membantu metabolisme karbohidrat di dalam tubuhnya dapat berjalan normal. Walaupun sebagian penderita DM Tipe 2 tidak memerlukan terapi insulin, namun 30% ternyata memerlukan terapi insulin disamping terapi hipoglikemik oral. 14 Universitas Sumatera Utara



ii.



Obat antidiabetik oral (ADO) 



Golongan sulfonilurea



Dikenal dua generasi sulfonilurea, generasi pertama terdiri dari tolbutamid, tolazamid, asetoheksimid dan klorpropamid, generasi kedua yang potensi hipoglikemik lebih besar adalah gliburid (=glibenklamid), glipizid, gliklazid dan glimepirid. Mekanisme kerjanya merangsang sekresi insulin dari granul sel-sel β langerhans pankreas (Suherman dan Nafrialdi, 2012). 



Meglitinid



Golongan meglitinid terdiri dari repaglinid dan nateglinid yang mekanisme kerjanya sama dengan sulfonilurea tetapi struktur kimianya sangat berbeda (Suherman dan Nafrialdi, 2012). 



Biguanida



Golongan biguanida: fenformin, buformin, dan metformin, tetapi fenformin telah ditarik dari peredaran karena sering menyebabkan asidosis laktat. Sekarang yang banyak digunakan adalah metformin. Mekanisme kerja biguanida sebenarnya bukan obat hipoglikemik tetapi suatu antihiperglikemik, tidak menyebabkan rangsangan sekresi insulin dan umumnya tidak menyebabkan hipoglikemia.



Metformin



menurunkan produksi



glukosa



di



hepar



dan



meningkatkan sensitivitas jaringan otot dan adiposa terhadap insulin,banyak data yang menunjukkan bahwa efeknya terjadi akibat penurunan glukoneogenesis (Suherman dan Nafrialdi, 2012). 



Tiazolidinedion



Farmakologisnya



luas



dan



berupa



kadar



glukosa



dengan



jalan



meningkatkan kepekaan bagi insulin dari otot, jaringan lemak dan hati, sebagai efeknya penyerapan glukosa ke dalam jaringan lemak dan otot meningkat . Begitu 15 Universitas Sumatera Utara



juga menurunkan kadar trigliserida/asam lemak bebas dan mengurangi glukoneogenesis dalam hati. Zat ini tidak mendorong pankreas untuk meningkatkan pelepasan insulin seperti sulfonilurea (Tjay dan Rahardja, 2002). 



Penghambat enzim α-glikosidase



Penghambat



enzim



α-glikosidase



dapat



memperlambat



absorpsi



polisakarida (starch), dekstrin, dan disakarida di intestin. Penghambat kerja enzim α-glikosidase di intestin, dapat mencegah peningkatan glukosa plasma pada orang normal dan pasien DM, karena kerjanya tidak mempengaruhi sekresi insulin, maka tidak akan menyebabkan efek samping hipoglikemia (Suherman dan Nafrialdi, 2012).



2.5 Streptozotosin Streptozotosin (STZ) adalah N-mehyl-N-nitrosoureido D-glucosamine yang bersifat toksik terhadap sel β pankreas dan berfungsi untuk mensekresi insulin, sehingga banyak digunakan untuk menginduksi diabetes pada hewanhewan percobaan (Pathak, et al., 2008). STZ mudah larut dalam air, sedikit larut dalam alkohol dan keton. Obat ini mempunyai spesifitas yang tinggi terhadap selβ. Penyuntikan secara intraperitonial dosis 55 mg/kg BB, dosis tunggal akan menyebabkan hiperglikemia secara cepat (Mc Neill, 1999). Streptozotosin dapat digunakan untuk menginduksi DM tipe 1 dan tipe 2 yang diaplikasikan pada saat hewan percobaan masih pada tahap neonatal. Setelah bermur 8-10 minggu, tikus yang diinjeksi dengan streptozotosin pada saat neonatal tersebut akan menunjukkan gejala hiperglikemia ringan dan hilangnya sensitivitas sel β terhadap glukosa (Szkudelski, 2001). Mekanisme kerja yang ditimbulkan dari streptozotosin bersifat toksik terhadap sel β pankreas, struktur 16 Universitas Sumatera Utara



streptozotosin sangat mirip dengan molekul glukosa sehingga akan ditranspor ke dalam sel oleh glucose transporter 2 (GLUT2) (Schnedl, et al., 1994), sedangkan GLUT2 itu sendiri akan memperantarai sel β dalam mengambil glukosa dalam darah, sehingga streptozotosin akan ikut diambil melalui proses pengambilan glukosa tersebut (Szkudelski, 2001).



2.6 Metformin Metformin adalah obat hipoglikemik oral yang termasuk kedalam golongan biguanida (Katzung, 2007). Kerjanya dalam menurunkan glukosa darah tidak menyebabkan ransangan sekresi insulin. Mekanisme kerjanya meliputi stimulasi glikolisis dan tidak langsung pada jaringan perifer dengan peningkatan pengeluaran glukosa dari darah, mengurangi glukoneogenesis hati, memperlambat absorbsi glukosa dari saluran pencernaan, pengurangan kadar glukagon plasma dan meningkatkan pengikatan insulin pada reseptor insulin. Mekanisme kerja tidak melalui perangsangan sekresi insulin tetapi langsung terhadap organ sasaran. Efek utama metformin adalah menurunkan “hepatic glucose output” dan menurunkan kadar glukosa puasa (Handoko, dkk., 2004). Metformin mengurangi output glukosa hati sebagian besar dengan menghambat glukoneogenesis hati, penyerapan gula pada usus lambat dan meningkatkan serapan glukosa, termasuk otot rangka (Cvetko, dkk., 2007). Metformin diabsorbsi dengan lambat dan tidak mengalami metabolisme dan dibersihkan dari tubuh dengan sekresi tubular dan diekskresikan lewat urin dalam bentuk yang tidak berubah. Metformin dikontraindikasikan untuk orang-orang dengan kondisi yang dapat meningkatkan resiko asidosis laktat (metabolik), termasuk kelainan ginjal (kadar kreatinin lebih dari 150 μmol/L), kelainan paru17 Universitas Sumatera Utara



paru dan hepar. Kegagalan jantung kongestif juga meningkatkan resiko asidosis laktat dengan metformin. Efek samping yang paling sering pada metformin yaitu kelainan pada gastrointestinal, termasuk diare, mual, muntah dan peningkatan flatus. Pontensial yang paling serius dari efek samping penggunaan metformin adalah asidosis laktat, meskipun begitu ini sangat jarang dan kebanyakan kasus berkaitan dengan kondisi komorbid (Katzung, 2007).



2.7 Histologi Pankreas Histologi (Yun. Histo, jaringan, + logos, ilmu) adalah ilmu tentang jaringan tubuh dan cara jaringan ini menyusun organ-organ. Prosedur paling umum yang dipakai untuk mengamati jaringan adalah dengan membuat sediaan histologi yang dapat dipelajari dengan bantuan mikroskop cahaya. Di bawah mikroskop cahaya, jaringan diamati melalui transiluminasi (berkas cahaya yang menembus jaringan). Jaringan dan organ biasanya terlalu tebal untuk ditembus cahaya, sehingga jaringan tersebut harus diiris menjadi lembaran-lembaran tipis yang translusens (Junqueira dan Carneiro, 2003). Pankreas merupakan organ kelenjar penting dalam tubuh yang terdiri dari jaringan eksokrin dan endokrin (Sherwood, 2001). Bagian eksokrin terdiri atas sel asinar pankreas yang mensekresikan enzim melalui saluran ke dalam duodenum. Sementara, bagian endokrin yang terdiri dari pulau Langerhans mengekskresikan enzim langsung ke dalam darah (Luo, 2011). Menurut Tortora dan Derrickson (2012), setiap pulau pankreas mempunyai empat jenis sel yang mensekresi hormon : a) alpha atau sel A merupakan sekitar 17% dari sel-sel islet pankreas dan mengeluarkan glukagon 18 Universitas Sumatera Utara



b) beta atau sel B merupakan sekitar 70% dari sel-sel islet pankreas dan mensekresi insulin c) delta atau sel D merupakan sekitar 7% dari sel islet pankreas dan mengeluarkan somatostatin d) sel F merupakan sisa sel islet pankreas dan mensekresi polipeptida pankreas



2.8 Metode ELISA Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) atau penetapan kadar imunosorben taut-enzim merupakan uji serologis yang umum digunakan di berbagai laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai pelapor (Lequin, 2005). Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui dimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA). Antibodi adalah senyawa protektif dari sistem kekebalan yang bertugas menetralisasi benda asing atau yang disebut antigen (patogen) yang masuk kedalam tubuh. Sistem imun adaptif (SIA) akan berusaha merespon terhadap adanya patogen yang masuk kedalam tubuh. Enzim yang dikonjugasi pada antibodi dapat digunakan untuk mengidentifikasi antigen spesifik dalam spesimen jaringan (Warsito, 2014). 19 Universitas Sumatera Utara



Tes ELISA ini memiliki 2 teknik dan 4 tipe yaitu: a) teknik kualitatif adalah berdasarkan bahwa tiap antibodi berikatan pada antigen yang spesifik. b) teknik kuantitatif berdasarkan jumlah ikatan antigen-antibodi yang ditentukan dengan nilai absorbansi. Teknik ini menggabungkan spesifitas antibodi dengan kepekaan uji enzimatis dengan spektrofotometer biasa (Marfianti, 2009). Tipe ELISA, sebagai berikut : 1. direct ELISA, biasanya digunakan dengan kompetisi dan inhibisi ELISA. Digunakan untuk deteksi antigen. Teknik ini untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen tetapi metode ini mempunyai beberapa kelemahan yaitu immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan enzim, penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu, tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim, larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum digunakan dan mahal. 2. indirect ELISA, antigen terikat pada plate, digunakan untuk deteksi antibodi. Enzim bertindak sebagai penanda, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang. 3. sandwich ELISA, antibodi terikat pada plate, digunakan untuk deteksi antigen. Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen 20 Universitas Sumatera Utara



yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. 4. capture ELISA, antihuman antibodi terikat pada plate. Digunakan untuk deteksi antibodi (Marfianti, 2009). Pemeriksaan ELISA dapat dipakai untuk pengujian antigen lewat cara persaingan atau cara antibodi ganda. Cara persaingan, campuran dari antigen yang dilekatkan pada enzim yang diketahui jumlahnya dengan antigen tanpa enzim yang belum diketahui jumlahnya, direaksikan dengan antibodi yang dilekatkan pada permukaan padat. Setelah reaksi selesai membentuk kompleks lalu dicuci, kemudian ditambahkan substrat yang cocok untuk enzim dan aktivitas enzim diukur. Sejumlah antigen yang belum diketahui jenisnya direaksikan 16 dengan antibodi tertentu yang dilekatkan pada permukaan padat, dicuci dan direaksikan dengan antibodi berenzim. Setelah dicuci lagi, ditambahkan substrat enzim khusus. Aktivitas enzim yang diuji dengan cara biasa menunjukkan jumlah antigen yang ada (Marfianti, 2009). Reseptor Advanced Glycation End product terdiri dari RAGE bentuk tidak terlarut yang berada pada jaringan termasuk sel otot polos dan bentuk terlarut (sRAGE) yang berada pada sirkulasi, kadar sRAGE dalam sirkulasi manusia meningkat pada penderita penyakit kardiovaskular, sehingga dapat dijadikan sebagai biomarker pada penyakit komplikasi kardiovaskuler diabetik. Komplikasi vaskuler diabetik dapat terjadi pada mikrovaskular seperti retinopati, neuropati dan nefropati serta makrovaskular seperti aterosklerosis, gagal jantung dan stroke yang bersifat irreversible (Sato, dkk., 2006). Jalur utama penyebab kondisi ini 21 Universitas Sumatera Utara



adalah adanya interaksi antara produk glikasi akhir (AGE) dengan reseptornya (RAGE) (Yamagishi dan Matsui, 2010; Yamagishi, dkk., 2008). Interaksi AGE-RAGE menginduksi peradangan dan stres oksidatif, yang menyebabkan pembentukan AGE dan akumulasi, maka RAGE berlebih pada pasien diabetes (Yamagishi, dkk., 2012). Terapi untuk menurunkan kadar AGE, seperti aminoguanidin, karnosin, dan piridoksamin harus dikonsumsi terusmenerus dalam jangka panjang. Hal ini memerlukan biaya besar untuk dapat mengontrol komplikasi vaskuler diabetes seumur hidup, tentu akan berdampak pada kehidupan ekonomi dan psikososial penderitanya (Al-farabi, 2013). Menurut Cook, dkk., (2005) obat hipoglikemik oral kemungkinan efektif untuk kontrol glikemik setidaknya pada tahap awal diabetes, namun menjadi tidak sepenuhnya efektif dalam pencegahan kerusakan organ yang diperantarai ROS. Dalam mengatasi hal ini dapat digunakan obat herbal sebagai alternative pengobatan komplikasi vaskuler dari diabetes. Salah satu sumber bahan alam yang memiliki aktivitas antihipoglikemik dan potensial dikembangkan adalah tanaman puguntano (Picria fel-terrae Lour.) mengandung senyawa flavonoid (Febby, 2017; Harahap, dkk., 2013) dimana senyawa ini diduga berperan pada proses penurunan jumlah AGE yang ditandai dengan penurunan Soluble Receptor Advanced Glycation End product (sRAGE). Menurut penelitian Hamandez, dkk., (2009) menyatakan flavonoid yang hadir dalam berbagai jenis sayuran, teh, dan anggur merah efektif dalam menangkap radikal bebas, struktur utama dari flavonoid (tiga cincin benzena dengan satu atau lebih gugus hidroksil) adalah faktor yang menentukan kapasitas antioksidan. Aktivitas antioksidan (Terao, dkk., 2008) melibatkan kemampuan 22 Universitas Sumatera Utara



flavonoid untuk mengikat radikal bebas dan ion logam transisi. Aktivitas antioksidan flavonoid telah dibuktikan dalam banyak sistem lipid, oleh sebab itu flavonoid dapat mencegah aterosklerosis. Cyminum Cuminum, umumnya dikenal sebagai Jeera, ditemukan mengandung 51,87% b/b flavonoid, yang berperan antiglycation. Pengobatan tikus diabetes melitus yang diinduksi streptozotosin dengan Cyminum Cuminum mengurangi akumulasi stres dan AGE oksidatif pada ginjal dengan meningkatkan pertahanan antioksidan dan mengurangi radikal bebas yang disebabkan peroksidasi lipid. Aktivitas antioksidan superoksida dismutase dan katalase meningkat dengan pemberian Cyminum Cuminum. Percobaan lebih lanjut menunjukkan bahwa efek antihiperglikemik dari Cyminum Cuminum dengan melindungan sel β pankreas, dan meningkatkan sekresi insulin dan penyimpanan glikogen (Jagtar dan Patil, 2010). Kuersetin adalah contoh lain dari flavonol aglikon yang ditemukan dalam buah jeruk dan bawang. Banyak peneliti meneliti kemampuan kuersetin untuk mencegah kerusakan protein (pembentukan AGE) secara in vivo. Kuersetin dan kaempferol bersama-sama dengan kaempferol-3-O-rutinosida sebagai polifenol dalam ekstrak Cassia auriculata dapat menurunkan kadar gula darah dan menghambat kerusakan pada protein. Fraksi etil asetat dari tanaman obat ini menunjukkan aktivitas antioksidan dan penghambatan peroksidasi lipid. Ekstrak daun jambu juga merupakan sumber yang sangat baik dari senyawa fenolik. Senyawa fenolik dari ekstrak daun jambu biji secara signifikan menurunkan kadar glukosa darah puasa pada tikus diabetes melitus yang diinduksi streptozotosin, penurunan produk glikasi, peroksidasi lipid dan meningkatkan status antioksidan (Lee, dkk., 2008., Kim, dkk., 2011). 23 Universitas Sumatera Utara



BAB III METODE PENELITIAN



Metode penelitian yang digunakan adalah eksperimental (Experimental research). Penelitian eksperimental dimaksudkan untuk mengetahui aktivitas hipoglikemik dan pengaruh terhadap sRAGE. Tahap penelitian meliputi pengumpulan bahan, identifikasi bahan, pengolahan bahan, pembuatan ekstrak etanol 96% dan pengujian KGD, sRAGE serta histologi pankreas pada tikus.



3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada. Penelitian dilaksanakan setelah mendapat persetujuan Komite Etik Penelitian Bidang Kesehatan Universitas Sumatera Utara. Waktu penelitian dilakukan selama bulan Mei sampai Agustus 2017.



3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Alat-alat yang digunakan meliputi alat bedah hewan, alat destilasi, alatalat gelas (Iwaki Pyrex), blender (Philips), centrifuse, conical tube, elisa reader (Bio Tech), glucometer (EasyTouch®GCU), glucotest strip (EasyTouch®GCU strip test), kandang hewan, lemari pengering, mikroskop, mortir dan stamfer, neraca kasar (Home Line), neraca analitik (Boeco), oven (Dynamic), penangas air, rotary evaporator (Stuart), seperangkat alat PK air, tanur (Nabertherm). 24 Universitas Sumatera Utara



3.2.2 Bahan Bahan yang digunakan adalah herba puguntano (Picria fel-terrae Lour.), etanol 96%,



akuades, akuabides, asam klorida, asam klorida 0,9%, ketamin



(Bernofarm), streptozotosin (Nacalay), tablet metformin (Hexpharm Jaya), Natrium carboxy methyl cellulose, besi (III) klorida, timbal (II) asetat, kristal natrium hidroksida, asam sulfat pekat, raksa (II) klorida, kalium iodida, α-naftol, asam nitrat 0,5 N, bismut (III) nitrat, asam nitrat pekat, serbuk magnesium, amil alkohol, toluen, α-naftol dan sRAGE Kit fine test.



3.3 Pembuatan Pereaksi 3.3.1 Pereaksi besi (III) klorida 1% Sebanyak 1 g besi (III) klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air secukupnya hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995). 3.3.2 Pereaksi timbal (II) asetat 0,4 M Sebanyak 15,17 g timbal (II) asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida sebanyak 100 mL (Depkes RI, 1995). 3.3.3 Pereaksi natrium hidroksida 2 N Sebanyak 8 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dengan air suling sebanyak 100 mL (Depkes RI, 1995). 3.3.4 Pereaksi asam klorida 2 N Sebanyak 17 mL larutan asam klorida pekat ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995). 3.3.5 Pereaksi asam sulfat 2 N Sebanyak 5,5 mL larutan asam sulfat pekat ditambahkan air suling sampai 100 mL (Depkes RI, 1995). 25 Universitas Sumatera Utara



3.3.6 Pereaksi Mayer Sebanyak 1,4 g raksa (II) klorida ditimbang kemudian dilarutkan ke dalam air suling hingga 60 mL, pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida kemudian dilarutkan ke dalam 10 mL air suling. Larutan pertama dan kedua dicampurkan kemudian ditambahkan dengan air suling hingga diperoleh larutan sebanyak 100 mL (Depkes RI, 1995). 3.3.7 Pereaksi Mollish Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 mL (Depkes RI, 1995). 3.3.8 Pereaksi Dragendorff Sebanyak 0,8 g bismut (III) nitrat ditimbang, masukkan kedalam erlenmeyer kemudian dilarutkan dalam 20 mL asam nitrat pekat, pada wadah lain ditimbang 27,2 g KI, dilarutkan dalam 50 mL air suling, kemudian kedua larutan dicampurkan, aduk homogen dan didiamkan sampai memisah. Larutan yang jernih diambil dan diencerkan dengan air suling hingga volume larutan 100 mL (Depkes RI, 1995). 3.3.9 Pereaksi Bouchardat Sebanyak 4 g KI ditimbang, masukkan kedalam erlenmeyer ditambahkan air suling secukupnya dan aduk homogen, tambahkan 2 g iodium kemudian ditambahkan air suling hingga 100 mL (Depkes RI, 1995). 3.3.10 Pereaksi Liebermann-burchard Sebanyak lima bagian volume H2SO4 pekat dicampurkan dengan 50 bagian volume etanol 96%, kemudian ditambahkan dengan hati-hati 5 bagian volume asam asetat anhidrida ke dalam campuran tersebut, aduk homogen dan dinginkan (Depkes RI,1995). 26 Universitas Sumatera Utara



3.4 Penyiapan Bahan Uji Penyiapan bahan uji meliputi pengumpulan dan identifikasi tumbuhan serta pembuatan simplisia. 3.4.1 Pengumpulan bahan tumbuhan Pengumpulan



bahan



uji



dilakukan



secara



purposif



yaitu



tanpa



membandingkan dengan bahan yang sama dengan daerah lain. Tumbuhan puguntano diambil dari Desa Tiga Lingga, Kabupaten Dairi, Provinsi Sumatera Utara. 3.4.2 Identifikasi tumbuhan Identifikasi tumbuhan dilakukan oleh Satria (2016) di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Jalan Raya Jakarta-Bogor Km. 46 Cibinong 16911 BogorIndonesia. 3.4.3 Pembuatan simplisia Simplisia herba puguntano dibuat di Laboratorium Farmakognosi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Tumbuhan puguntano dibersihkan dari bagian akar, dikumpulkan dalam wadah dan dicuci hingga bersih pada air mengalir lalu ditiriskan, kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan, selanjutnya ditimbang beratnya. Bahan dimasukkan di dalam lemari pengering dengan temperatur 40 ºC hingga kering yang ditandai apabila dipatahkan telah rapuh, kemudian ditimbang berat keringnya. Simplisia selanjutnya dihaluskan dengan menggunakan blender menjadi serbuk hingga agak halus lalu dimasukkan ke dalam wadah tertutup, beri label sebagai penanda dan disimpan di tempat kering agar terjaga mutu simplisia (Prasetyo dan Entang Inoriah, 2013). 27 Universitas Sumatera Utara



3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari larut air, penetapan kadar sari larut etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu tidak larut asam (WHO, 1992). 3.5.1 Pemeriksaan makroskopik Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, tekstur dan ukuran serta pemeriksaan organoleptik dengan mengamati warna, rasa dan bau dari tumbuhan segar, simplisia dan serbuk simplisia herba puguntano. 3.5.2 Penetapan kadar air Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung dan pendingin, tabung penyambung dan penerima 10 ml. Cara kerja: a. Penjenuhan toluena Sebanyak 200 mL toluen dan 2 mL air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 mL. b. Penetapan kadar air simplisia Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, dimasukkan kedalam labu yang berisi toluena jenuh tersebut, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian 28 Universitas Sumatera Utara



tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 mL. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen (v/b) (WHO, 1998). 3.5.3 Penetapan kadar sari yang larut dalam air Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dengan 100 mL air-kloroform (2,5 mL kloroform dalam air suling sampai 1 liter) dalam labu bersumbat, dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan atau didiamkan selama 18 jam, kemudian disaring. Sejumlah 20 mL filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 ºC sampai bobot tetap. Kadar dalam persen dari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 1995). 3.5.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol Sebanyak 5 g serbuk simplisia di maserasi selama 24 jam dalam 100 mL etanol 96% di dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama dibiarkan selama 18 jam, setelah itu disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol, 20 mL filtrat diuapkan dalam cawan penguap dan ditara sampai kering. Sisa yang diperoleh dipanaskan pada suhu 105 ºC sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 96% dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 1995). 3.5.5 Penetapan kadar abu total Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada 29 Universitas Sumatera Utara



suhu 60 0C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap, dimana kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 1995). 3.5.6 Penetapan kadar abu tidak larut asam Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 mL asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring, dipijarkan, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan (Depkes RI, 1995).



3.6 Pembuatan Ekstrak Etanol Herba Puguntano Pembuatan ekstrak dilakukan secara maserasi menggunakan pelarut etanol 96%. Sebanyak 600 g serbuk simplisia herba puguntano dimasukkan ke dalam sebuah bejana, dituangi dengan 4,5 liter (75 bagian) etanol 96%, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil berulang-ulang diaduk lalu diserkai, ampas diperas dan dicuci dengan etanol 96% sebanyak 1,5 liter hingga diperoleh 100 bagian. Sari dipindahkan kedalam bejana tertutup, dibiarkan ditempat sejuk dan terlindung dari cahaya selama 2 hari. Dienaptuangkan dan disaring. Pemekatan ekstrak dilakukan dengan alat rotary evaporator pada suhu 40 ºC sampai diperoleh ekstrak kental (Depkes RI, 1979).



3.7 Skrining Fitokimia Skrining



fitokimia



pemeriksaan senyawa



serbuk



simplisia



triterpenoid/steroid,



alkaloid,



dan



ekstrak,



glikosida,



meliputi flavonoid,



saponin dan tannin (Harbone, 1987; Depkes RI, 1995; Farnsworth, 1966). 30 Universitas Sumatera Utara



3.7.1 Pemeriksaan flavonoid Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambah air panas, dididihkan 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, kemudian dipipet 5 ml filtrat dan masukkan kedalam tabung reaksi ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 mL asam klorida pekat dan 1 mL amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna merah kekuningan atau jingga pada lapisan amil alkohol (Farnsworth, 1966). 3.7.2 Pemeriksaan alkaloid Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 mL asam klorida 2 N dan 9 mL air suling, dipanaskan selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk uji alkaloid: diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalamnya dimasukkan 0,5 mL filtrat. Pada masing-masing tabung reaksi : a. ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer b. ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat c. ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada paling sedikit dua dari tiga percobaan di atas (Depkes RI, 1995). 3.7.3 Pemeriksaan saponin Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 mL air kemudian dipanaskan diatas penangas air dan didinginkan setelah itu dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin (Depkes RI, 1995). 31 Universitas Sumatera Utara



3.7.4 Pemeriksaan tanin Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 2 menit dalam 100 mL air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi (III) kolrida 1%. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin (Farnsworth, 1966). 3.7.5 Pemeriksaan glikosida Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 2 g, lalu disari dengan 20 mL campuran etanol 95% dengan air (7:2) dan 10 mL asam klorida 2N, direfluks selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 mL air suling dan 25 mL timbal (II) asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 mL campuran isopropanol dan kloroform (2:2), dilakukan berulang kali sebanyak 2 kali. Sari air dikumpulkan dan diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 ºC. Sisanya dilarutkan dalam 2 mL metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 mL larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi dan diuapkan di atas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 mL air dan 5 tetes pereaksi Molisch, kemudian secara perlahanlahan ditambahkan 2 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya glikosida (Depkes RI, 1995). 3.7.6 Pemeriksaan steroid/triterpenoid Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 mL n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan beberapa tetes pereaksi Liebermann-Burchard. Terbentuk warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroid sedangkan warna merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid (Harborne, 1987). 32 Universitas Sumatera Utara



3.8 Tahap Persiapan Percobaan 3.8.1 Pembuatan larutan streptozotosin (STZ) Streptozotosin dilarutkan dengan akuabides, kemudian disuntikkan secara intraperitonial dengan dosis 35 mg/kg BB (Zulkarnain, 2013; Hikmah, 2014; Firdaus, dkk., 2016) 3.8.2 Penggunaan glucose test meter”easytouch®GCU” Kadar glukosa darah diukur dengan alat glucometer menggunakan tes strip yang bekerja secara enzimatis. Glucometer ini secara otomatis akan hidup ketika tes strip dimasukkan dan akan mati setelah beberapa menit tes strip dicabut, dicocokkan kode nomor yang muncul pada layar dengan yang ada pada vial tes strip EasyTouch®GCU. Tes strip yang dimasukkan pada glucometer pada bagian layar akan tertera angka yang sesuai dengan kode vial tes strip dan setelah itu pada layar akan muncul tanda siap untuk diteteskan darah. Caranya dengan menyentuh 1 tetes darah yang keluar ke tes strip kemudian darah akan ditarik sendirinya melalui aksi kapiler. Ketika wadah terisi penuh oleh darah maka alat akan mulai mengukur kadar glukosa darah. Diamkan beberapa saat, jika telah terukur akan muncul angka kadar glukosa darah pada layar dalam satuan mg/dL (Rahmawati, 2014). 3.8.3 Pembuatan suspensi ekstrak etanol herba puguntano Timbang EEHP dosis 100 mg/kg BB, 200 mg/kg BB, dan 400mg/kg BB



dengan gelas arloji, kemudian dimasukkan kedalam lumpang berbeda dan masing-masing tambahkan suspensi Na-CMC 1%, gerus homogen. Tambahkan



sebagian akuades gerus homogen. Tuangkan suspensi yang terbentuk kedalam botol 10 ml, cukupkan dengan akuades sampai garis tanda dan kocok homogen. 33 Universitas Sumatera Utara



3.8.4 Pembuatan suspensi Na-CMC 1% Lumpang dan alu dipanaskan. Ditimbang Na-CMC sebanyak 1 g, kemudian masukkan 20 bagian air panas kedalam lumpang, taburkan Na-CMC diatasnya dan diamkan selama 15 menit hingga diperoleh massa yang transparan, lalu digerus sampai homogen, diencerkan dengan air suling, kemudian dihomogenkan, dimasukkan kedalam botol, dan dicukupkan dengan air suling hingga 100 mL. 3.8.5 Pembuatan suspensi metformin Dosis metformin untuk manusia 500 mg (Nolthe dan karam, 2010) Maka dosis untuk tikus (BB = 200g) dikonversikan = 500 mg x 0,018 x 1000 / 200g = 45 mg/kg BB. Timbang serbuk tablet metformin setara 45 mg. Dimasukkan kedalam lumpang dan ditambahkan suspensi Na-CMC 1% sedikit demi sedikit sambil digerus sampai homogen, tambahkan akuades kemudian gerus hingga homogen. 3.8.6 Pembuatan larutan wash buffer Sebanyak 30 ml wash buffer pekat diencerkan dengan 750 mL akuades (1:25), kemudian diaduk perlahan sampai kristal terlarut sempurna atau homogen (Wuhan Fine BioTech). 3.8.7 Pembuatan larutan standar Sebanyak 1 mL larutan buffer standar dimasukkan kedalam tube dan tambahkan Lyophilized standart untuk menghasilkan 1000 pg/mL, pipet 0,3 mL dari mikro tube 1000 pg/mL masukkan kedalam tube yang telah berisi 0,3 mL larutan buffer standar untuk menghasilkan 500 pg/mL, lakukan pengenceran selanjutnya menghasilkan 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62,5 pg/mL, 31,25 pg/mL dan 15,6 pg/mL (Wuhan Fine BioTech). 34 Universitas Sumatera Utara



3.8.8



Pembuatan larutan antibodi biotin Preparasi 1 jam sebelum pengujian kemudian hitung volume yang



dibutuhkan untuk larutan pengujian: 0,1 mL / sumur x jumlah sumur (volume total ± 0,1 – 0,2 mL). Dilarutkan larutan deteksi antibodi biotin dengan larutan buffer antibodi 1:100 dan aduk homogen (Wuhan Fine BioTech). 3.8.9 Pembuatan larutan HRP-streptavidin conjugate (SABC) Preparasi 30 menit sebelum pengujian, hitung total volume yang dibutuhkan untuk larutan pengujian: 0,1 mL / sumur x jumlah sumur (volume total ± 0,1 – 0,2 mL). Dilarutkan larutan HRP-Streptavidin Conjugate (SABC) dengan larutan buffer SABC 1:100 dan aduk homogen (Wuhan Fine BioTech).



3.9 Penyiapan Hewan Percobaan Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus putih jantan dengan berat badan 180-200 gram sebanyak 25 ekor yang dibagi dalam 5 kelompok dimana masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus putih jantan dengan kondisi sehat. Sebelum percobaan, terlebih dahulu dipelihara selama 2 minggu dalam kandang yang baik untuk menyesuaikan lingkungannya, yaitu dengan penerimaan cahaya 12 jam gelap dan 12 jam terang (Ditjen POM, 1997).



3.10 Pengujian Efek Penurunan Kadar Glukosa Darah 3.10.1 Penginduksian larutan streptozotosin (STZ) pada tikus Tikus dipuasakan selama lebih kurang 18 jam. Kemudian berat badan ditimbang dan diukur KGD normal dengan GlucoDr, kemudian diberikan larutan STZ secara intra peritoneal (ip), KGD tikus diukur pada hari ke-3. Hewan yang memiliki KGD lebih tinggi dari 200 mg/dL dipisahkan dan dijadikan hewan uji. 35 Universitas Sumatera Utara



Hewan dengan KGD lebih rendah dari 200 mg/dL, diinduksi kembali. Jika pada hari ke-3 KGD hewan uji telah lebih dari 200 mg/dL, maka hewan telah dapat diberikan bahan uji (Chen, dkk., 2014). 3.10.2 Pengujian aktivitas antidiabetes ekstrak etanol herba puguntano Tikus yang telah dipuasakan ditimbang berat badannya, ditentukan KGD puasa, kemudian masing-masing tikus diinduksi dengan STZ dosis 35 mg/kg BB secara intraperitoneal (Daud, 2013). Tikus diberi makan dan minum seperti biasa, diamati tingkah laku dan kemudian dicek kadar gula darahnya pada hari ke-3 dan hari ke-7. Tikus dianggap menderita diabetes apabila KGD puasa ≥ 200 mg/dL dan telah dapat digunakan untuk pengujian (Suharmiati, 2003). Selanjutnya hewan uji disebut sebagai tikus diabetes. Tikus diabetes dikelompokkan secara acak menjadi 5 kelompok yang terdiri dari 5 ekor tikus yaitu : Kelompok 1



: suspensi Na-CMC 1%



Kelompok 2



: EEHP dosis 100 mg/kg BB



Kelompok 3



: EEHP dosis 200 mg/kg BB



Kelompok 4



: EEHP dosis 400 mg/kg BB



Kelompok 5



: suspensi metformin dosis 45 mg/kg BB



Suspensi diberikan selama 14 hari berturut-turut secara oral. Lalu diukur KGD tikus pada hari ke-3, 5, 7, 9, 11, 13, dan 15. Pada hari ke-15 hewan uji dibedah, diambil darah jantung untuk memperoleh serum yang digunakan untuk uji sRAGE dan bagian organ pankreas digunakan untuk uji histologi untuk melihat ekstrak yang diberikan dapat mencegah kerusakan pankreas akibat penginduksian STZ atau tidak (Siregar, 2013). 36 Universitas Sumatera Utara



3.11 Histologi Pankreas Diambil pankreas kemudian dicuci dengan larutan fisiologis 0,9% kemudian dimasukkan dalam larutan dapar formaldehida 10%. Pembuatan preparat histologi dilakukan di rumah sakit Murni Teguh. Hasilnya dapat dilihat dengan mengamatinya di bawah mikroskop. 3.11.1 Pembuatan preparat blok parafin Pembuatan blok parafin (Junqueira dan Carneiro, 2003), pankreas yang direndam dalam larutan formalin 10% selanjutnya dilakukan proses dehidrasi dengan alkohol bertingkat yaitu diawali dengan alkohol 70%, kemudian berturutturut alkohol 80%, alkohol 95%, dan alkohol absolut. Pada masing-masing proses dilakukan selama 30 menit sampai 1 jam. Tahap selanjutnya adalah pencucian dengan menggunakan larutan xylol yaitu 1, 2, 3 selama 1-2 jam. Proses penanaman, caranya: sampel direndam dalam campuran xylol dan parafin cair pada suhu 60–70 oC, dengan xylol: parafin berturut-turut 3:1, 1:1, dan 1:3 masingmasing selama 2 jam, dilakukan pencetakan dan dibiarkan membeku, kemudian blok parafin dipotong dengan menggunakan alat mikrotom dengan ketebalan irisan 5-7 μm. 3.11.2 Pewarnaan hematoxylin eosin Pewarnaan HE dimulai dengan melakukan deparafinisasi dengan memasukkan preparat ke dalam seri larutan xylol 1, 2, 3. Tahapan selanjutnya adalah fiksasi dengan memasukkan preparat ke dalam larutan alkohol 96% untuk mengeluarkan air dari dalam sel. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan direndam dalam akuades. Preparat direndam dalam hematoxylin selama 5 menit lalu dicuci dengan air mengalir selama 3 menit, kemudian preparat dicelup ke dalam larutan acid alcohol 1% sebanyak 1-2 celupan untuk membantu 37 Universitas Sumatera Utara



mempercepat pewarnaan hematoxylin dan dicuci kembali dengan air mengalir selama 3 menit. Setelah itu preparat diwarnai menggunakan eosin 1% dan dicuci lagi dengan air mengalir selama 3 menit, kemudian dilakukan proses dehidrasi dengan alkohol bertingkat (alkohol 80%, 95% dan 99%) selama 3 menit serta penjernihan (clearing) dengan menggunakan xylol. Sediaan dilakukan mounting dan ditutup dengan cover glass (Junqueira dan Carneiro, 2003).



3.12 Penetapan Kadar soluble RAGE Disiapkan alat dan bahan, dicuci plate dengan wash buffer 2 kali, kemudian ditambahakan 100 µl standar, sampel dan kontrol nol kedalam masingmasing sumur, pasang penutup dan diinkubasi selama 90 menit pada suhu 37 ºC. Dicuci plate dengan wash buffer 2 kali kemudian tambahkan 100 µl biotin solution kedalam masing-masing sumur dan diinkubasikan selama 60 menit pada suhu 37 ºC. Dicuci plate dengan wash buffer 3 kali. Ditambahkan 100 µl larutan SABC masukkan kedalam masing-masing sumur, pasang penutup kembali dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 ºC, terlindung dari cahaya. Dicuci plate dengan wash buffer 5 kali kemudian ditambahkan 90 µl TMB substrat pada masing-masing sumur dan diinkubasikan 15-30 menit pada suhu 37 ºC, terlindung dari cahaya. Diamati perubahan warna yang terjadi dimana beberapa larutan didalam sumur akan berubah menjadi warna biru sesuai dengan konsentrasi sRAGE, kemudian ditambahkan 50 µl stop solution pada masing-masing sumur agar konsentrasi yang diperoleh tidak terlalu besar kemudian diamati perubahan warna dengan munculnya warna kuning. Dibaca serapan dengan Microplate Reader pada panjang λ 450 nm. Dihitung kadar sRAGE (Wuhan Fine BioTech). 38 Universitas Sumatera Utara



3.13 Analisis Data Data hasil penelitian di analisis dengan menggunakan program SPSS versi 22. Data dianalisis dengan menggunakan metode Kolmogorov Smirnov dan Shapiro-Wilk untuk menentukan homogenitas dan normalitasnya, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan metode One Way ANOVA untuk menentukan perbedaan rata-rata di antara kelompok. Jika terdapat perbedaan dilanjutkan dengan menggunakan uji Posh Hoc dan Tukey HSD untuk melihat perbedaan nyata antara perlakuan.



39 Universitas Sumatera Utara



BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN



4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan Hasil identifikasi tumbuhan yang dilakukan oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Bogor-Pusat Penelitian Biologi adalah termasuk jenis Picria fel-terrae Lour., suku Linderniaceae. Hasil pemeriksaan dapat dilihat pada Lampiran 2 halaman 66.



4.2 Hasil Pemeriksaan Karakteristik Simplisia Herba Puguntano 4.2.1 Hasil pemeriksaan makroskopik Hasil pemeriksaan makroskopik herba puguntano (Picria fel-terrae Lour.) adalah daun berwarna hijau muda sampai hijau tua, berbentuk bulat telur, tepi daun beringgit, ukuran daun 2x4 cm, dengan tekstur permukaan daun kasar, berkerutkerut dan berbulu, dengan batang berwarna coklat muda hingga coklat tua, ukuran batang 20-30 cm serta batang bercabang tunggal. Hasil pemeriksaan makroskopik dapat dilihat pada Lampiran 3 halaman 67. 4.2.2 Hasil pemeriksaan karakteristik simplisia herba puguntano Hasil karakterisasi simplisia puguntano meliputi penetapan kadar air, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol, kadar abu total dan kadar abu yang tidak larut asam. Standarisasi simplisia menurut Depkes RI (2000) adalah pemenuhan terhadap persyaratan sebagai bahan obat dan menjadi penetapan nilai untuk berbagai parameter produk sehingga dapat terjamin mutu dalam penyimpanan, Hasil karakterisasi dapat dilihat pada Tabel 4.1 dan perhitungan karakterisasi dapat dilihat pada Lampiran 6 halaman 70. 40 Universitas Sumatera Utara



Tabel 4.1 Hasil pemeriksaan karakteristik simplisia herba puguntano No.



Uraian



Simplisia(%)



1



Kadar air



5,54



2



Kadar sari yang larut air



18,51



3



Kadar sari yang larut etanol



7,19



4



Kadar abu total



8,43



5



Kadar abu yang tidak larut asam



0,57



Berdasarkan tabel 4.1 hasil penetapan kadar air simplisia herba puguntano adalah 5,54%, jika dilihat standarisasi kadar air simplisia secara umum memenuhi syarat yaitu tidak lebih dari 10% (Depkes RI, 1985). Penetapan kadar air dilakukan untuk memberikan batasan minimal kandungan air yang masih dapat ditolerir di dalam ekstrak karena tingginya kandungan air menyebabkan ketidakstabilan sediaan obat, bakteri dan jamur cepat tumbuh dan bahan aktif yang terkandung didalamnya dapat terurai. Kadar air yang melebihi 30% dapat menjadi media yang baik untuk pertumbuhan jamur. Perubahan senyawa kimia berkhasiat akibat aktivitas enzim karena enzim tertentu dalam sel masih dapat bekerja menguraikan senyawa aktif setelah sel mati dan selama ekstrak masih mengandung jumlah air tertentu. Penetapan kadar sari yang larut dalam air dan etanol dilakukan untuk mengetahui banyaknya senyawa polar yang larut dalam air dan etanol. Hasil penetapan kadar sari yang larut air dan kadar sari yang larut etanol adalah 18,51% dan 7,19%. Penetapan kadar abu total dan kadar abu tidak larut asam ditetapkan untuk melihat kandungan mineral ekstrak. Zat-zat ini dapat berasal dari senyawa oksidaoksida anorganik. Kadar abu total yang tinggi sebagian mungkin berasal dari pengotoran. Kadar logam berat yang tinggi dapat membahayakan kesehatan, sehingga perlu dilakukan penetapan kadar abu total dan kadar abu tidak larut asam untuk memberikan jaminan bahwa ekstrak tidak mengandung logam berat tertentu 41 Universitas Sumatera Utara



melebihi nilai yang ditetapkan karena berbahaya bagi kesehatan. Hasil penetapan kadar abu total dan kadar abu tidak larut asam pada simplisia herba puguntano adalah 8,43% dan 0,57%.



4.3 Hasil Skrining Fitokimia Herba Puguntano Pemeriksaan golongan senyawa kimia simplisia dan ekstrak herba puguntano dilakukan untuk mendapatkan informasi golongan senyawa metabolit sekunder yang terdapat di dalamnya. Hasil skrining fitokimia dapat dilihat pada Tabel 4.2 Tabel 4.2 Hasil skrining fitokimia simplisia dan EEHP No. 1 2 3 4 5 6



Pemeriksaan Alkaloid Flavonoid Tanin Saponin Glikosida Steroida/triterpenoid



Keterangan:



Simplisia + + +



EEHP + + +



+ +



+ +



(+) positif: mengandung golongan senyawa (-) negatif: tidak mengandung golongan senyawa



Hasil skrining menunjukkan bahwa simplisia dan ekstrak herba puguntano mengandung senyawa golongan flavonoid, tanin, saponin, glikosida dan steroid/triterpenoid.



4.4 Hasil Pengujian Aktivitas Antidiabetes Ekstrak Etanol Herba Puguntano Hasil pengukuran kadar gula darah tikus setelah puasa selama 18 jam sebelum



tikus diinduksi STZ dosis 35 mg/kg BB, dilakukan pengukuran untuk memperoleh data KGD normal kemudian dilakukan pembagian kelompok sebelum penginduksian karena respon fisiologis tubuh tikus berbeda-beda, maka tikus dikelompokkan menjadi 5 kelompok yang terdiri dari 5 ekor tikus. Data 42 Universitas Sumatera Utara



KGD (mg/dL) masing-masing tikus pada semua kelompok antar individu dihitung, kemudian dianalisis secara statistik menggunakan ANOVA dilanjutkan uji Post Hoc dan Tukey HSD untuk melihat beda signifikan antar perlakuan, ditunjukkan pada tabel 4.3 Tabel 4.3 Hasil pengukuran KGD tikus sebelum diinduksi STZ 35 mg/kg BB (Mean, n=5) Kel.



Tikus



Rata-rata KGD puasa (mg/dL)



1.



Kelompok kontrol



87,6



2.



Kelompok uji



88,0



3.



Kelompok uji



93,8



4.



Kelompok uji



92,8



5.



Kelompok pembanding



93,2



Hasil uji normalitas diperoleh nilai signifikan 0,200 pada α = 0,05 yang menunjukkan tidak terdapat perbedaan yang signifikan di antara kelompok kontrol, kelompok uji dan kelompok pembanding. Hal ini menunjukkan bahwa hewan coba yang digunakan dalam kondisi fisiologis yang homogen, yakni dalam KGD yang normal sehingga dapat digunakan sebagai hewan uji. Tikus kemudian diinduksi dengan larutan STZ dosis 35 mg/kg BB secara intraperitoneal, kemudian diukur KGD pada hari ke-3 hingga hari berikutnya sampai menunjukkan kenaikan KGD, lalu pisahkan bagian tikus yang telah mencapai KGD ≥ 200 mg/dL dipisahkan dan yang belum mencapai maka dilakukan penginduksian kembali sehingga tikus mulai dapat digunakan dalam pengujian. Tikus yang telah memiliki KGD ≥ 200 mg/dL disebut tikus hiperglikemia dan jika berlangsung lama menjadi tikus diabetes. Hasil rata-rata dari peningkatan KGD ditunjukkan pada Tabel 4.4



43 Universitas Sumatera Utara



Tabel 4.4 Hasil pengukuran KGD tikus setelah diinduksi STZ 35 mg/kg BB (Mean, n=5) Kel.



Tikus



Rata-rata KGD puasa (mg/dL)



1.



Kelompok kontrol



513,2



2.



Kelompok uji



495,8



3.



Kelompok uji



505,2



4.



Kelompok uji



512,8



5.



Kelompok pembanding



509,6



Berdasarkan Tabel 4.4 terlihat bahwa pemberian STZ dosis 35 mg/kg BB untuk semua hewan percobaan menghasilkan KGD ≥ 200 mg/dL. Hal ini menunjukkan bahwa tikus yang digunakan untuk percobaan dalam keadaan hiperglikemia. Hasil tes homogenitas diperoleh p = 0,200 pada α = 0,05 yang menunjukkan tidak terdapat perbedaan yang signifikan di antara kelompok kontrol, kelompok uji, dan kelompok pembanding. Hal ini menunjukkan bahwa tikus sudah dalam kondisi diabetes sehingga dapat digunakan sebagai hewan uji. Pemberian perlakuan dimulai setelah tikus positif diabetes (hari ke-1), setiap hari diberi sediaan uji selama 2 minggu, dan dilakukan pengukuran KGD pada hari ke3, 5, 7, 9, 11, 13, dan 15. Hasil KGD rata-rata tikus setelah perlakuan dimana kelompok kontrol negatif diberi suspensi Na-CMC 1%, kelompok uji diberi suspensi ekstrak dengan dosis 100 mg/kg BB, 200 mg/kg BB dan 400 mg/kg BB, kelompok pembanding (kontrol positif) diberi suspensi metformin dosis 45 mg/kg BB, selama pengujian tikus diberi makanan dan minum yang diletakkan dalam wadah khusus yang telah disediakan untuk masing-masing kandang dengan takaran yang sesuai. Makanan yang diberikan tidak berlebihan karena dapat mempengaruhi pengukuran. Hasil pengukuran KGD rata-rata tikus setelah perlakuan dapat dilihat pada Tabel 4.5 44 Universitas Sumatera Utara



Tabel 4.5



Hasil KGD rata-rata tikus setelah perlakuan (Mean, n=5) KGD rata-rata setelah perlakuan (mg/dL)



Kelompok Perlakuan



hari ke-3



hari ke-5



hari ke-7



hari ke-9



hari ke-11



Hari ke-13



hari ke-15



Suspensi Na-CMC 1%



503,8



486,2



439



421,6



404,8



394,2



378,8



EEHP 100 mg/kg BB



468,6



414



373,2



315,6



276,2



191,4



119,6



EEHP 200 mg/kg BB



362,8



331,6



298,4



260



184



117,8



79,8



EEHP 400 mg/kg BB



334



296,2



277,6



252,4



164



106,6



79,80



Metformin 45 mg/kg BB



269,2



189



125,4



108,8



98



81



69,2



Berdasarkan Tabel 4.5 dapat dilihat seluruh kelompok yang telah diberi perlakuan mengalami penurunan KGD jika dibandingkan dengan KGD setelah diinduksi, pada hari ke-3 dan hari ke-5 sudah menunjukkan penurunan KGD namun belum menunjukkan efek perbedaan yang nyata menurut statistik jika dibandingkan dengan kelompok Na-CMC 1%. Hasil pengukuran KGD hari ke-7 pemberian EEHP dosis 100 mg/kg BB, 200 mg/kg BB dan 400 mg/kg BB mengalami penurunan dibandingkan pada hari sebelumnya tetapi belum menunjukkan efek yang menyerupai kelompok pembanding metformin dosis



45 mg/kg BB, pada



kelompok hewan coba yang diberikan suspensi Na-CMC 1% mengalami penurunan KGD disebabkan oleh fisiologis dari hewan coba, KGD hari ke-9 pemberian EEHP dosis 100 mg/kg BB, 200 mg/kg BB, 400 mg/kg BB mengalami penurunan dibandingkan hari ke-7 tetapi masih terdapat perbedaan yang signifikan dibandingkan dengan kelompok metformin dosis 45 mg/kg BB. 45 Universitas Sumatera Utara



Hasil pengukuran KGD rata-rata hari ke-11 menunjukkan bahwa kelompok hewan coba yang diberikan metformin dosis 45 mg/kg BB mengalami penurunan dan tikus dalam KGD normal dimana KGD rata-rata tikus 98 mg/dL, pemberian EEHP dosis 100 mg/kg BB, 200 mg/kg BB, 400 mg/kg BB masih menunjukkan efek berbeda nyata menurut statistik jika dibandingkan dengan kelompok pembanding metformin 45 mg/kg BB. Hasil pengukuran KGD rata-rata hari ke-13 kelompok tikus diberi EEHP dosis 200 mg/kg BB dan 400 mg/kg BB mengalami penurunan



tetapi



masih



menunjukkan



perbedaan



yang



signifikan



jika



dibandingkan dengan kelompok tikus yang diberi metformin dosis 45 mg/kg BB. Hasil pengukuran KGD rata-rata hari ke-15 menunjukkan kelompok tikus yang diberi EEHP dosis 200 mg/kg BB dan 400 mg/kg BB mengalami penurunan dan jika dibandingkan dengan kelompok tikus diberi metformin dosis 45 mg/kg BB tidak terdapat perbedaan yang signifikan. Berdasarkan hasil di atas dapat disimpulkan bahwa pemberian EEHP dosis 100 mg/kg BB, 200 mg/kg BB, dan 400 mg/kg BB telah dapat menurunkan KGD tikus yang diinduksi STZ. Hal ini dapat terjadi diduga karena adanya senyawa saponin pada herba puguntano. Berdasarkan penelitian Debasis, dkk., (2011) menunjukkan bahwa ekstrak biji mahoni (S. mahagoni) dapat menurunkan kadar glukosa darah tikus diabetes yang diinduksi streptozotosin. Menurut penelitian Nugraha (2012), mahoni mengandung senyawa 1,4-bis-(3,4,5-trimetoksi-fenil)tetrahidro-furo(3,4-c) furan yang berdasarkan strukturnya merupakan golongan saponin yang terbukti memiliki aktivitas antihiperglikemik dan mampu meningkatkan jumlah sel beta yang mensekresi insulin pada tikus diabetes. Menurut Osorio, dkk., (2016) ekstrak Carica papaya L. dapat menurunkan kadar glukosa darah tikus diabetes yang diinduksi streptozotosin. Menurut penelitian 46 Universitas Sumatera Utara



A’yun dan Laily (2015) hasil analisis fitokimia Carica papaya L. positif mengandung saponin. Menurut El Barky, dkk., (2017) dan Lavle, dkk., (2016) saponin terbukti memiliki potensi sebagai obat alternatif dalam menurunkan kadar glukosa darah pasien yang menderita diabetes dengan mengaktivasi sintesis glikogen, menekan aktivitas disakarida, memodulasi sinyal insulin, meregenerasi kerja insulin, meningkatkan pelepaskan insulin dari sel beta, menghambat glukoneogenesis, menghambat aktivitas α-glucosidase, dan meningkatkan ekspresi GLUT4. Menurut Fuangchana, dkk., (2011), ekstrak buah, biji, dan daun Momordica charantia (M. charantia) atau pare mengandung senyawa bioaktif yang dapat menurunkan KGD pada hewan diabetes. Oishi, dkk., (2007) menyatakan bahan aktif utama dari M. charantia yang ada dalam fraksi butanol dan berkaitan dengan efek antidiabetes adalah saponin. Saponin dapat mengurangi peningkatan kadar glukosa darah dengan menghambat enzim yang memecah disakarida menjadi monosakarida. Hasil skrining fitokimia dari Anabasis articulata (A. articulata) juga menujukkan adanya saponin. Segal (1969) telah mengidentifikasi jenis saponin yang diisolasi dari A. articulata sebagai saponin triterpen, dan dari penelitian Metwally (2012) pemberian fraksi saponin dari ekstrak etanol A. articulata secara oral dengan dosis 400 mg/kg BB per hari selama 30 hari pada tikus yang diinduksi STZ menunjukkan kontrol glikemik yang menguntungkan dan berperan dalam mencegah berbagai gangguan metabolism. Aktivitas antidiabetesnya dikaitkan dengan saponin dan aktivitas antihiperglikemiknya melalui peningkatan pelepasan insulin dari pankreas. Berdasarkan hasil skrinning fitokimia, ekstrak etanol herba puguntano (EEHP) positif mengandung saponin. Menurut penelitian Harahap, dkk., (2013) dan Febby 47 Universitas Sumatera Utara



(2017) menyatakan hasil skrinning ekstrak etanol daun puguntano dan ekstrak air herba puguntano positif mengandung saponin. Data dari hewan coba selama perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.1, dimana pada garis ordinat menunjukkan KGD dan pada garis absis menunjukkan tanda saat tikus dilakukan pengukuran KGD, 0 menunjukkan KGD tikus yang telah dipuasakan selama 18 jam dan belum diinduksi STZ, 1 menunjukkan KGD tikus setelah dilakukan penginduksian dan mulai diberikan perlakuan, tanda 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 menunjukkan KGD tikus yang telah diberi perlakuan dimulai pada hari ke-3 sampai hari ke-15.



600



KGD (mg/dL)



500 EEHP 100



400



EEHP 200



300



EEHP 400



200



Metformin



100



Na-CMC



0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Waktu (hari ke-) Gambar 4.1 kurva linier pengukuran KGD dengan perlakuan penginduksian STZ pada α = 0,05; n =5; Rata-rata



4.5 Hasil Pemeriksaan Histologi Jaringan Pankreas Tikus Pemeriksaan histologi jaringan pankreas tikus dilakukan dengan pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE). Hematoxylin bersifat basa akan mewarnai unsur



jaringan yang bersifat asam (basofilik), yaitu inti sel, sedangkan eosin bersifat asam sehingga berfungsi mewarnai sitoplasma yang bersifat basa (asidofilik) (Djajakirana, 2009). 48 Universitas Sumatera Utara



Hasil pemeriksaan histologi pankreas dapat dilihat pada gambar 4.2 sebagai berikut: -



Pankreas tikus normal



A



B



Keterangan: A: pulau langerhans perbesaran 10x, B: beberapa pulau langerhans perbesaran 40x Kelompok tikus normal keadaan pulau langerhansnya masih baik, dimana pulau langerhans tikus kelompok normal menunjukkan batas-batas yang jelas antara sel, berbentuk bulat beraturan dan tidak terlihat terjadinya kerusakan seperti



piknosis, karioreksis dan kariolisis. Gambar B menunjukkan beberapa pulau langerhans dengan besar masing-masing pulau berbeda yang tersebar diseluruh pankreas. Pulau langerhans terdapat tiga jenis sel endokrin yaitu sel α sebagai penghasil hormon glukagon yang terletak sepanjang jaringan perrifer pada pulau langerhans dan mempunyai inti yang tidak teratur dan beberapa granula sekretori, sel β yang berfungsi sebagai hormon penghasil insulin yang terletah ditengah dan memiliki inti besar dan bulat, 10 % sel delta pada pulau langerhans digunakan untuk mensekresikan hormon somatostatin yang dapat menurunkan dan berfungsi menghambat aktivitas sekretorik sel α dan sel β melalui pengaruh lokal di dalam insula pancreatica, keempat sel F mensekresi polipeptida pankreas yang dapat menghambat pembentukan enzim pankreas dan sekresi alkali (Kurt, 1994). 49 Universitas Sumatera Utara



-



Pankreas tikus diabetes yang diberikan Na-CMC 1% a



b c



A



B



Keterangan: A: pulau langerhans perbesaran 10x, B: beberapa pulau langerhans perbesaran 40x, a: piknosis, b: karioreksis, c: kariolisis Kelompok tikus diabetes STZ yang diberi suspensi Na-CMC 1% terlihat susunan sel tidak beraturan dan sangat jauh berbeda dengan kelompok normal. Disini terlihat bahwa STZ menyebabkan degenerasi jika dibandingkan kelompok normal. Terlihat adanya nekrosis berupa piknosis, karioreksis, dan kariolisis pada sel pankreas. Hal ini disebabkan karena STZ merupakan suatu senyawa yang secara selektif dapat menghancurkan sel beta pankreas melalui GLUT2 di dalam sel beta. Senyawa pada sel beta tersebut menginduksi produksi radikal superoksida, hydrogen peroksida, dan radikal hidroksil yang dapat menyebabkan penghancuran sel beta secara cepat. Senyawa ini juga melepaskan sejumlah racun oksida nitrat yang menghambat aktivitas aconitase dan berkontribusi pada kerusakan DNA (Szkudelski, 2001), pemeriksaan histologi ini tidak dapat menunjukkan kerusakan terjadi pada sel beta atau bukan. Karena metode pemeriksaan jaringan dengan pewarnaan menggunakan Haematoxylin Eosin (HE) hanya dapat mewarnai dengan cara inti yang bersifat asam akan menarik zat/larutan yang bersifat basa sehingga akan berwarna biru. Sitoplasma bersifat basa akan menarik zat/larutan yang bersifat asam sehingga berwarna merah dan hasil yang diperoleh hanya berupa struktur umum jaringan (Sudiana, 2005). 50 Universitas Sumatera Utara



-



Pankreas tikus diabetes yang diberikan Metformin



a b



B A Keterangan: A: pulau langerhans perbesaran 10x, B: beberapa pulau langerhans perbesaran 40x, a: piknosis, b: karioreksis Kelompok tikus diabetes yang diberi suspensi metformin terlihat pada pulau langerhans susunan sel tidak beraturan, terjadi nekrosis berupa piknosis, karioreksis, dan kariolisis. Hal ini menunjukkan bahwa suspensi metformin tidak dapat memperbaiki kerusakan sel pada pulau langerhans akan tetapi metformin dapat menurunkan KGD tikus diabetes yang diinduksi STZ. ini dapat terjadi karena metformin merupakan obat antidiabetika oral golongan biguanid, dengan mekanisme kerja tidak melalui perangsangan sekresi insulin tetapi langsung terhadap organ sasaran. Efek utama metformin adalah menurunkan “hepatic glucose output” dan menurunkan kadar glukosa puasa (Handoko, dkk., 2004). Metformin mengurangi output glukosa hati sebagian besar dengan menghambat glukoneogenesis hati, penyerapan gula pada usus dan meningkatkan serapan glukosa oleh periferaL (Cvetko, dkk., 2007). Menurut Cook, dkk., (2005) obat hipoglikemik oral kemungkinan efektif untuk



kontrol glikemik, namun menjadi tidak sepenuhnya efektif dalam pencegahan kerusakan organ yang diperantarai ROS, dalam hal ini seperti kerusakan yang disebabkan oleh STZ, ketika masuknya larutan STZ kedalam pankreas langsung merusak inti sel sehingga tidak dapat menghasilkan insulin. 51 Universitas Sumatera Utara



-



Pankreas tikus diabetes yang diberikan EEHP dosis 100 mg/kg BB c



a



b



A -



B



Pankreas tikus diabetes yang diberikan EEHP dosis 200 mg/kg BB



c a



-



B A Pankreas tikus diabetes yang diberikan EEHP dosis 400 mg/kg BB a c



A



B



Keterangan: A: pulau langerhans perbesaran 10x, B: beberapa pulau langerhans perbesaran 40x, a: piknosis, b: karioreksis, c: kariolisis Kelompok tikus yang diberi EEHP dosis 100 mg/kg BB, 200 mg/kg BB dan 400 mg/kg BB, tampak bahwa EEHP dosis 400 mg/kg BB memberikan gambaran yang paling baik dan mendekati normal. Terlihat dari banyaknya sel normal serta bentuk pulau langerhans, hal ini menunjukkan adanya pencegahan kerusakan lebih lanjut, sedangkan kelompok EEHP dosis 100 mg/kg BB dan dosis 200 mg/kg BB juga menunjukkan adanya sel normal walaupun masih terdapat degranulasi sitoplasma pada kebanyakan sel jika dibandingkan dengan kelompok



52 Universitas Sumatera Utara



normal. Hal ini dapat terjadi karena adanya senyawa flavonoid dalam herba puguntano. Flavonoid cukup penting dalam penanganan diabetes karena kemampuannya untuk menghentikan radikal bebas dan mengurangi stres oksidatif, sehingga dapat mencegah kerusakan lebih lanjut yang disebabkan oleh STZ. Selain itu, flavonoid dapat memberi efek menguntungkan pada diabetes dengan



meningkatkan



sekresi



insulin



dan



mengurangi



apoptosis



dan



mempromosikan proliferasi sel beta pankreas, mengurangi resistensi insulin, peradangan, dan stres oksidatif pada otot dan lemak, serta peningkatan serapan glukosa pada otot rangka dan jaringan adipose (Lavle, dkk., 2016).



4.6 Hasil Penetapan Kadar soluble RAGE dengan Metode ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan reaksi ikatan antara antigen yang tidak dikenal dengan antibodi dan digunakan bantuan enzim sebagai penanda. ELISA merupakan teknik laboratorium yang digunakan untuk mendeteksi adanya antibodi atau antigen dalam sampel (Crowther 2001; Hartaningsih dkk., 1994). Hasil pengukuran serum diperoleh kadar Soluble Receptor Advanced Glycation End product (sRAGE) yang dapat dilihat pada Tabel 4.6. Hasil uji normalitas diperoleh nilai signifikan p > 0,05 yang menunjukkan tidak terdapat perbedaan yang signifikan diantara kelompok kontrol, kelompok uji dan kelompok pembanding. Data pengukuran sRAGE masing-masing tikus pada semua kelompok perlakuan



antar individu dihitung kadar rata-ratanya, kemudian



dianalisis secara statistik menggunakan Analysis of Variance (ANOVA) dan dilanjutkan uji Post Hoc dan Tukey HSD untuk melihat perbedaan antar perlakuan dan kelompok mana yang lebih mendekati efektifitas metformin. 53 Universitas Sumatera Utara



Tabel 4.6 Hasil kadar sRAGE tikus setelah perlakuan (Mean ± SEM, n=4) Kelompok Perlakuan



Kadar sRAGE setelah perlakuan ± SEM



Suspensi Na-CMC 1%



169,0694 ± 4,36



EEHP 100 mg/kg BB



28,30555 ± 1,38



EEHP 200 mg/kg BB



23,0972 ± 1,04



EEHP 400 mg/kg BB



27,8194 ± 1,68



Metformin 45 mg/kg BB



18,7222 ± 0,68



Berdasarkan uji Post Hoc diperoleh p = 0,000 pada (α = 0,05) yang menunjukkan kelompok tikus yang diberi perlakuan EEHP dosis 100 mg/kg BB, 400 mg/kg BB dan pembanding Na-CMC 1% menunjukkan perbedaan yang nyata secara statistik dibandingkan dengan kelompok metformin 45 mg/kg BB. Sedangkan kelompok tikus yang diberikan perlakuan EEHP dosis 200 mg/kg BB diperoleh nilai p= 0,093 (α = 0,05) yang menunjukkan tidak terdapat perbedaan yang nyata secara statistik dibandingkan kelompok metformin 45 mg/kg BB. Hal ini menunjukkan bawah pemberian EEHP dosis 200 mg/kg BB merupakan dosis terbaik dalam menghambat terbentuknya sRAGE. Kadar glukosa darah yang tinggi dalam jangka panjang pada penderita DM memicu terjadinya proses glikasi lipid dan protein yang mengakibatkan peningkatan Advanced Glycation End Product (AGE), AGE memegang peran yang cukup signifikan dalam proses terjadinya berbagai komplikasi pada diabetes. AGE merupakan produk yang dihasilkan dari reaksi glikasi non-enzimatik dari protein, lemak dan asam nukleat glikooksidasi. Proses pembentukan AGE yang disebut sebagai reaksi Maillard, di mana karbohidrat bereaksi dengan protein dengan cara non-enzimatik, sebuah proses yang disebut glikasi. Reaksi ini memulai pembentukan reversibel dari Schiff base antara karbohidrat dan 54 Universitas Sumatera Utara



kelompok amino protein, yang menjadi stabil antara amina keto dengan produk amadori. AGE pasti berikatan dengan reseptornya yaitu RAGE. Interaksi antara AGE dalam sirkulasi dengan RAGE (receptor for advanced glycation end product) akan meningkatkan produksi ROS (reactive oxygen species), selanjutnya membentuk banyak AGE melalui jalur NADPH oksidase dan mengaktivasi serta menginduksi inflamasi. Jalur katabolisme AGE bergantung pada degradasi jaringan dan eliminasi ginjal, pada tingkat jaringan dikenal reseptor AGE yaitu RAGE yang dapat memicu dan memastikan kelangsungan aktifasi sel dan menyebabkan kerusakan sel melalui peningkatan stress oksidatif. Stres oksidatif didefinisikan sebagai kelebihan produksi spesies oksigen reaktif atau penurunan mekanisme pertahanan antioksidan. Proses oksidatif menyebabkan resistensi insulin, intoleransi glukosa dan disfungsi sel mitokondria, yang juga mendorong perkembangan komplikasi vascular diabetes (Bos, dkk., 2011; Al-farabi, 2013; Mulyati, 2016).



55 Universitas Sumatera Utara



BAB V KESIMPULAN DAN SARAN



5.1 Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan didapat kesimpulan sebagai berikut: a. EEHP



memiliki aktivitas hipoglikemik pada tikus yang diinduksi



streptozotosin dan dosis 200 mg/kgBB memberikan hasil yang paling signifikan. b. EEHP dapat mencegah kerusakan lebih lanjut gambaran histopatologi pankreas tikus diabetes melitus yang diinduksi dengan Streptozotosin. c. EEHP dapat menurunkan kadar soluble RAGE pada tikus diabetes melitus yang diinduksi dengan streptozotosin dan dosis 200 mg/kgBB memberikan hasil yang paling signifikan.



5.2 Saran Sebaiknya untuk penelitian selanjutnya peneliti melakukan isolasi dan identifikasi terhadap jenis senyawa yang terkandung dalam EEHP yang memiliki kemampuan menurunkan kadar glukosa darah.



56 Universitas Sumatera Utara



DAFTAR PUSTAKA



Anastasia, G. (2016). Uji In Vitro Aktivitas Antelmintik Ekstrak Etanol Daun Pugun Tanoh [Curanga fel-terrae (Lour.) Merr.]. Universitas Sumatera Utara. Anonim. (2009). Picria fel-terrae Lour. Diunduh http://www.proseanet.org/prohati2/ browser.php?doosid=459. tanggal 2 Desember 2017.



dari Pada



Anonim. (2014). Picria fel-terrae http://tropical.theferns.info/viewtropical. tanggal 2 Desember 2017.



dari Pada



Lour. Diunduh php?id=picria+felterrae.



A’yun, Q., Laily, A.N. (2015). Analisis Fitokimia (Carica Papaya L.) Di Balai Penelitian Tanaman Aneka Kacang dan Umbi, Kendalpayak, Malang. Universitas Islam Negeri Maulana Malang. Bos, D. C.; de RANITZ-GREVEN, W. L.; de VALK, H. W. (2011). Advanced glycation end products, measured as skin autofluorescence and diabetes complications: a systematic review. Diabetes Technol Ther, v.13, p.773-9 Brownlee, M. (2005). The Pathobiology of Diabetic Complications: a unifying mechanism. Diabetes. 54:1615-25. Chen, G., Wang, H., Zhang, X., Yang, S.T. (2014). Nutraceuticals and Functional Foods in the Management of Hyperlipidemia.Food Science and Nutrition. 54: 1180-1201. Cook, M.N., Girman, C.J., Stein, P.P., Alexander, C.M., Holman, R.R. (2005). Glycemic control continues to deteriorate after sulfonylureas are added to metformin among patients with type 2 diabetes. Diabetes Care, 28:9951000. Cvetko, M., and Plosker, G.L. (2007). Exanatide in type 2 diabetes mellitus (as an adjunct to metformin and/or a sulphonylurea): Drugs Journal, 67;6:93554. Daud, N. (2013). Aktivitas Antidiabetes Ekstrak Daun Ubi Jalar (Ipomoea batatas L) pada mencit yang diinduksi Streptozotocin. Tesis. Pascasarjana Universitas Sumatera Utara. De, Debasis., Kausik, C., Kazi, M.A., Taushar, K.B., Debidas, G. (2011). Antidiabetic Potentially of the Aqueous-metanolic Extract of Seed of Swietenia mahagoni (L) Jacq. In Streptozotocin-induced Diabetic Male Albino Rat. Evid.Based Comp. Alter. Med. 1-11. Depkes RI. (1985). Cara Pembuatan Simplisia. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Halaman 10. 57 Universitas Sumatera Utara



Depkes RI. (1986). Sediaan Galenik. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Halaman 10-12. Depkes RI. (1995). Materia Medika Indonesia. Jilid VI. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Halaman 297-326, 333-340. Depkes RI. (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Halaman 5, 10-11. Depkes RI. (2005). Pharmaceutical Care Untuk Penyakit Diabetes Mellitus Jakarta: Direktorat Jenderal Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan. Halaman 1, 7, 11-12, 25-27, 32. Depkes RI. (2007). Riset Kesehatan Dasar Tahun 2007. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Departemen Kesehatan RI Derrickson, B. (2012). Principles of Anatomy and Physiology. Edisi XIII. USA: John Wiley & Sons. Djajakirana, S.H. (2009). Gambaran Imunohistokimia Antioksidan Superoksida Dismutase pada Jaringan Hati Tikus Diabetes Melitus yang Diberi Virgin Coconut Oil (VCO). Skripsi. Bogor. Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. El Barky, A.R., Hussein, S.A., Alm-Eldeen, A.E., Hafez, Y.A., Mostafa T.M. (2017). Saponins and Their Potential Role in Diabetes Mellitus. Review. Diabetes Management. 7(1),148-158. Farnsworth, N.R. (1966). Biological and Phytochemical Screening of Plants. Journal of Pharmaceutical Sciences.55(3). Halaman 263-264. Febby, F. (2017). Efek Ekstrak Air Herba Puguntano (Picria Fel-Terrae Lour.) Terhadap Penurunan Kadar Glukosa Darah Mencit Yang Diinduksi Streptozotocin. Universitas Sumatera Utara. Fernandez, S.P., Wasowski, C., Loscalzo, L.M., Granger, R.E., Johnston, G.A., Paladini, A.C. (2006). Central nervous system depressant action of flavonoid glycosides. Eur J Pharmacol;539(3):168–76. Firdaus, Rimbawan, Marliyati, S. A., Roosita, K. (2016). Model Tikus Diabetes yang Diinduksi Streptozotocin-Sukrosa untuk Pendekatan Penelitian Diabetes Melitus Gestasional. Jurnal MKMI. Vol. 12 No. 1 Fuangchana, A., Sonthisombata, P., Seubnukarnb, T., et al. (2011). Hypoglycemic effect of bitter melon compared with metformin in newly diagnosed type 2 diabetes patients. J. Ethnopharmacol. 134(2), 422-428. Fukuen, S., Iwaki, M., Yasui, A., Makishima, M., Matsuda, M., dan Shimomoura, I. (2005). Sulfonylurea agent axhibit peroxisome proliferator activated receptor gamma agonistic activity. J. Biol Chem. 2005;280:23653-23659. 58 Universitas Sumatera Utara



Handoko., dan Suharto. (2004). Insulin, Glukagon dan Antidiabetik Oral. Dalam: Farmakologi dan Terapi edisi 4. Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia Harahap, U., Patilaya, P., Marianne, Yuliasmi, S., Husori, D. I., Prasetyo, B. E., et al. (2013). Profil Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Puguntano (Curanga felterrae (Merr.) Lour.) yang Berpotensi sebagai Antiasma. Semiar Nasional Sains dan Teknologi V. Halaman 422-426. Harborne, J.B. (1987). Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisa Tumbuhan. Penerjemah: Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Bandung: Penerbit ITB. Halaman 147, 259. Harfina, F., Bahri, S., Saragih, A. (2012). Pengaruh Serbuk Daun Puguntano (Curranga fel-terrae Merr.) Pada Pasien Diabetes Mellitus. Journal of Pharmaceutics and Pharmacology. 1(2):112-118. Hasibuan, P.A.Z., Satria, D., Harahap, U., dan Silalahi, J. (2016). In Silico Analysis of Picfeltarraenin IA and IB as Potential PI3K and EGFR Inhibitor. Der Pharma Chemica. 8(19):666-670. Hernandez, I., Alegre, L., Van, Breusegem, F., dan Munné-Bosch S. (2009). How relevant are flavonoids as antioxidant in plants?. Trends Plant Sci 14(3):125-132. Heyne, K. (1987). Tumbuhan Berguna Indonesia Edisi III. Jakarta: Badan Litbang Kehutanan. Halaman 1744. Hidayatullah. (2016). Uji Aktivitas Antelmintik Kombinasi Ekstrak Etanol Daun Pugun Tanoh [Curanga fel-terrae (Lour.) Merr.] Dengan Albendazol. Universitas Sumatera Utara. Hikmah, N. (2014). Profil Kadar Gula Darah Diabetes dengan Metode Induksi Stratified Dose Streptozotocin (SD-STZ) dan Multi Low Dose Streptozotocin (MLD-STZ). Universitas Jember. Halaman 4-5. Huebschmann, A.G., Regenstreiner, J.G., Vlassara, H., dan Reusch, J.E. (2006). Diabetes and advanced glycoxidation end product. Diabetes Care. 29:1420-1432. Internasional of Diabetic Ferderation. (2015). Diabetes Atlas. http://www.oedg.at/pdf/1606_IDF_Atlas_2015_UK.pdf. Diunduh tanggal 28 Oktober 2017. Jagtar, A.G., dan Patil, P.B. (2010). Antihyperglycemic activity and inhibition of advanced glycation end product formation by Cuminum cyminum in streptozotocin induced diabetic rats. Food Chem Toxicol 48(8-9):20302036 59 Universitas Sumatera Utara



Jeevathayaparan, S., Tennekoon, K. H., Karunnanapake. (1999). A Comparative Study Of The Oral Hyperglicaemic Effect Of Momordica Charantia Fruit Juice and Tolbutamid in Streptozotocin Induced Graded Severity Diabetes in The Rats. Int. J. Diabetes. 3: 99-103. Junqueira, L.C., dan Carneiro, J. (2003). Basic Histology: Text & Atlas, Tenth Ed, dalam : Tambayong, J., Histologi Dasar : Teks & Atlas, Edisi 10, Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC. Halaman 63 Juwita, N.A. (2009). Karakterisasi Simplisia dan Uji Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Pugun Tanoh (Curanga fel-terrae Merr.) Terhadap Mencit Jantan. Skripsi. Medan: Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Halaman 6-8. Kadota, S.L., Marpaung, T., Kikuchi, Ekimoto, H. (1990). Constituens Of The Seeds Swietenia Mahagoni Jack. Chem Pharm Bull. 38:1495-1500. Katzung, B.G. (2007). Farmakologi Dasar dan Klinik. Edisi V. Editor Azwar Agoes. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Hal. 553-554. Kim, H.Y., Lee, J.M., Yokozawa, T., Sakata, K., dan Lee, S. (2011). Protective activity of flavonoid and flavonoid glycosides against glucose-mediated protein damage. Food Chem 126:892-895 Kojima, K., Isaka, K., Ogihara, Y. (1998). Tetratriterpenoid From Swietenia Macrophylla. Chem Pharm Bull. 46:523-525. Lavle, N., Shukla, P., Panchal, A. (2016). Role of Flavonoids and Saponins in the Treatment of Diabetes Mellitus. J Pharm Sci Bioscienctific Res. 6(4):535541. Lee, E.H., Song, D.G., Lee, J.Y., Pan, C.H., Um, B.H., dan Jung, S.H. (2008). Inhibitory Effect of the Compounds Isolated from Rhus verniciflua on Aldose Reductase and Advanced Glycation Endproduct. Biol Pharm Bull. 31(8):1626-1630 Lequin, R.M. (2005). "Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)". Clinical Chemistry 51 (12): 2415–2418. Marfianti, E. (2009). Perbedaan Kadar Resistin Obesitas dengan Resistensi Insuln dan Obesitas tanpa Resistensi Insulin. Jurnal Kedokteran dan Kesehatan Indonesia. Mc Neill, J.H. (1999). Experimental Models of Diabetes (Edited Version). New York: CRC Press. Hal. 82-85. Metwally, N.S., Mohamed, A.M., Sharabasy, F.S. (2012). Chemical Constituent of the Egyptian Plant Anabasis articulata (Forssk) Moq and Its Antidiabetic Effects on Rats with Streptozotocin-induced Diabetic Hepatology. J. Appl. Pharm. Sci. 2(4),54-65. 60 Universitas Sumatera Utara



Nolte, M. S., dan Karam, J. H. (2010). Hormon Pankreas & Obat Antidiabetes. Editor: Katzung, B. G. Farmakologi Dasar dan Klinik. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Halaman 704-709. Novia, A. (2016). Uji Invitro Aktivitas Antelmintik Ekstrak N-Heksana Daun Pugun Tanoh [Curanga fel-terrae (Lour.) Merr.]. Universitas Sumatera Utara. Nugraha, A. (2012). Docking molekuler dan aktivitas antihiperglikemik senyawa aktif hasil isolasi dari ekstrak metanol biji mahoni (Swietenia macrophylla King) pada tikus diabetes setelah induksi streptozotosin. Tesis. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada. Nurkhozin, A., Irawan, M.I., dan Mukhlash, I. (2011). Klasifikasi Penyakit Diabetes Mellitus Menggunakan Jaringan Syaraf Tiruan Backpropagation dan Learning Vector Quantization. Prosiding Seminar Nasional Penelitian, Pendidikan dan Penerapan MIPA. Fakultas MIPA. Universitas Negeri Yogyakarta. Oishi, Y., Sakamoto, T., Udagawa, H., et al. (2007). Inhibition of increases in blood glucose and serum neutral fat by Momordica charantia saponin fraction. Biosci. Biotechnol. Biochem. 71(3),735-740. Osorio, M., Rodriguez, A.E., Mancilla, J.V., Zarate, C.A. (2016). Protective Action of Carica papaya on β-Cells in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats. Environmental Research and Public Health. 13,446;doi:10.3390. Pareek, H., Sharma, S., Khajja, B.S., dan Jain, G.C. (2009). Evaluation Of Hypoglycemic and Anti- Hyperglycemic Potential of Tridax Procumbens (Linn.). BMC. 2009: 1-7. Doi: 10.1186/1472-6882.9-48. Pathak, S., Helge, C.D., Vladimir, S.B., dan Daan, M.F.A. (2008). Chemical Dissection of the Link Between Streptozotocin, GlcNAc, and Pancreatic Cell Death. Chem Biol. 15(8):799-807. Patilaya, P. (2015). Aktivitas Antelmentik Dari Ekstrak Etanol Daun Poguntano. Universitas Sumatera Utara. Patra, J.C., dan Chua, B.H. (2010). Artificial neutral network based drug design for diabetes mellitus using flavonoids. J Comput Chem; 32(4):555–67. Perry, L.M. (1980). Medicinal Plants of East and Southeast Asia. London: The MIT Press. Halaman 384. Prasetyo dan Entang Inoriah. (2013). Pengelolaan Budidaya Tanaman Obatobatan (Bahan Simplisia). Cetakan ke-1. Bengkulu: Badan Penerbitan Fakultas Pertanian UNIB. Halaman 17-28. 61 Universitas Sumatera Utara



Prohati. (2015). Detil Data Picria fel-terrae Lour. Diunduh dari http://www.proseanet.org/prohati2/browser.php?docsid=459. Pada tanggal 02 Desember 2017 Purwanti, O.S. (2013). Analisis Faktor-Faktor Resiko Terjadinya Ulkus kaki pada Pasien Diabetes Mellitus di RSUD Dr. Moewardi Surakarta, Prosiding Seminar Ilmiah Nasional (ISSN): 2338-2694. Rahmawati, S., dan Rifqiyati, N. (2014). Efektivitas Ekstrak Kulit Batang, Akar, dan Daun Sirsak (Annona muricata L) Terhadap Kadar Glukosa Darah. J Kaunia.10(2):81-91 Riset Kesehatan Daerah. (2013). Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementerian RI tahun 2013. Sato, T., Iwaki, M., Sinogoito, N., Wu, X., Yamaguchi, S dan Takeuchi, M. Toxic AGE Theory in Diabetic Complication. Curr. Mol.Med.2006.6(3):351-8. Satria, D., Silalahi, J., Haro, G., Ilyas, S., dan Anjelisa, P. (2017). Antioxidant and Antiproliferative Activities of an Ethylacetate Fraction of Picria FelTerrae Lour. Herbs. Asian Pasific Journal of Cancer Prevention. 18(2):399-403. Schnedl, W.J., Ferber, S., Johnson, J.H., and Newgard, C.B. (1994). STZ Transport and Cytotoxicity Specific Enhancement in GLUT2 Expressing Cells Diabetes. PubMed. 43:1326-1333. Segal, R., Goldzweig-Milo, I., Zaitschek, D.V. (1969). The Sapogenin Content of Anabasis articulate. Phytochemistry. 8, 521. Sherwood, L. (2001). Fisiologi Manusia;dari Sel ke Sistem. Edisi II. Jakarta;EGC Siregar, A.A. (2013). Efek Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah (EEDSM) Terhadap Penurunan Kadar Gula Darah Serta Gambaran Histologi Pankreas Mencit (Mus Musculus L) Diabetes. Tesis. Pascasarjana Universitas Sumatera Utara. Sitepu, M.A. (2016). Uji In Vitro Aktivitas Antelmintik Ekstrak Etilasetat Daun Pugun Tanoh [Curanga fel-terrae (Lour.) Merr.]. Universitas Sumatera Utara. Sitorus, P., Harahap, U., Pandapotan, M., Barus, T. (2014). Isolation of βsitosterol from n-hexane extract of picria fel-terrae lour. Leave and study of its antidiabetic effect in alloxan induced diabetic mice. Int J Pharm Tech Res 6(1):137-41. Soegondo, S. (2008). Hidup Secara Mandiri Dengan Diabetes Melitus, Kencing Manis, Sakit Gula. Balai Penerbit FKUI, Jakarta. 62 Universitas Sumatera Utara



Soewondo, P., Subekti, Soegondo, S. (2010). Penatalaksanaan Diabetes Melitus Terpadu. Jakarta: Balai Penerbit FKUI Stuartxchange (2015). Phillipine Alternative Medicine. [Diakses 02 Desember 2017]; Diambil dari http://www.stuartxchange.com/Sagai-uak Suharmiati. (2003). Pengujian Bioaktivitas Anti Diabetes Mellitus Tumbuhan Obat. Cermin Dunia Kedokteran. No. 140. Surabaya: Departemen Kesehatan RI. Halaman 10. Suherman, S.K., dan Nafrialdi. (2012). Insulin dan Antidiabetik Oral. Dalam buku Farmakologi dan Terapi. Edisi Kelima. Cetak Ulang dengan Edisi Tambahan. Jakarta: Badan Penerbit FK UI. Halaman 481-495. Szkuldeski, T. (2001). The Mechanism of Alloxan and Streptozotocin Action in B Cells of the Rat Pankreas. Physiol. Res., vol. 50, 536-46. Terao J, Kawai Y, Murota K (2008) Vegetable flavonoids and cardiovascular disease. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 17(S1): 291–293 Umniyah, I.L. (2007). Pengaruh Pemberian Teh Hijau (Camellia Sinensis Kuntze) Terhadap Kadar Transminase (SGPT Dan SGOT) Pada Hepar Mencit (Mus Musculus) Diabetes. Skripsi. Malang : Jurusan Biologi UIN Maulana Malik Ibrahim Malang. Warsito, R., dan Hastari, W. (2014). Antibodi & Imunohistokimia. Rapha Publishing: Yogyakarta. Andi offset. Halaman 1-3, 69-85. World Health Organization. (2008). Diagnosis and classification of diabetes mellitus its compilation. Department Of Noncommunicable Disease Surveillance, Geneva, 2008. World Health Organization. (1992). Quality Control Methods For Medicinal Plant Materials. WHO/PHARM/92.559. Geneva: Halaman:26-27. World Health Organization. (1998). Quality Control Methods For Medicinal Plant Materials. Switzerland: Geneva. Halaman 31-33. Wuhan Fine Biotech. Rat sRAGE (Soluble Receptor for Advanced Glycation End product) ELISA Kit. Fine Test. Eastlake High-tech Development District, Wuhan, Hubei,China. ER1853 Yamagishi, S., dan Matsui, T. (2010). Smooth Muscle Cell Phatophysiology and AGEs. Curr. Drug. Target. 11(7): 875-81. Yamagishi, S.I., dan K., Noda, Y. (2012). Role of advanced glycation end products (AGEs) and oxidative stress in vascular complications in diabetes. Biochim Biophys Acta, v. 1820, p.663-71.



63 Universitas Sumatera Utara



Yamagishi, S., Nakamura, K., Mutsui, K., Noda, Y., dan Imaizumi, T. (2008). RAGE: A Novel Therapeutic Target For Diabetic Vascular Complication. Curr. Pharm. 14(5):487-95. Zou, J.M., Wang, L.S., Niu, X.M., Sun, H.D., dan Guo, Y.J. (2005a). Phenylethanoid Glycosides from Picria felterrae Lour. Journal of Integrative Plant Biology. 47(5): 632-636. Zou, J.M., Wang, L.S., Yan, H., Yin, W.Q., Guo, Y.J. (2005b). Determination of Picfeltarraenins IA and IB in Picria fel-terrae Lour. with TLCS. Chin J Pharm Anal. 25(6): 654-656 Zhong, S.Q., Zhang, B.N., dan Huang, F.X. (1979). An Antitumor Herb Cucao. China: Chin Tradit Herb Drugs Lett 3. Halaman 45-46.



64 Universitas Sumatera Utara



Lampiran 1. Surat rekomendasi persetujuan etik penelitian kesehatan



65 Universitas Sumatera Utara



Lampiran 2. Surat hasil identifikasi tumbuhan



66 Universitas Sumatera Utara



Lampiran 3. Gambar makroskopik herba puguntano



A



B



C



Keterangan: A: herba puguntano segar, B: simplisia herba puguntano, C: serbuk simplisia herba puguntano



67 Universitas Sumatera Utara



Lampiran 4. Bagan pembuatan simplisia



Herba Puguntano Dicuci dari pengotor sampai bersih Ditiriskan Dipotong kecil-kecil Ditimbang berat basah Dikeringkan Ditimbang berat kering Simplisia Dihaluskan dengan blender Disimpan Serbuk Simplisia



68 Universitas Sumatera Utara



Lampiran 5. Bagan pembuatan ekstrak



Serbuk Simplisia Herba Poguntano 600 g



Dimasukkan kedalam bejana Ditambahkan etanol 96% 4,5 liter Didiamkan selama 5 hari dengan sesekali pengadukan tanpa terkena sinar matahari Disaring, ampas diperas dan dicuci dengan 1,5 liter etanol 96%



Filtrat



Ekstrak Etanol



Di rotary evaporator Residu



Residu Diuapkan di atas penangas air



Ekstrak Kental 95,395 g



69 Universitas Sumatera Utara



Lampiran 6. Perhitungan pemeriksaan karakteristik serbuk simplisia herba puguntano 1. Perhitungan kadar air serbuk simplisia herba poguntano % = Kadar etanol simplisia =



No. 1. 2. 3.



Berat sampel (g) 3, 0030 3, 0024 3, 0009



a. Kadar air = b. Kadar air = c. Kadar air = % Rata-rata =



1 30



; 1 15 3 0030



1 50



;1 30



3 0024 1 65



;1 50



3 0009



4 99 :6 66 :4 99 3



𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 (𝑚𝑙) 𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑔)



x 100%



Volume awal (ml) 1,15 1,30 1,50



Volume akhir (ml) 1,30 1,50 1,65



x 100% = 4,99% x 100% = 6,66 % x 100% = 4,99% = 5,54%



2. Perhitungan kadar sari larut dalam air



% = Kadar sari larut dalam air =



No. 1. 2. 3.



𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑟𝑖 (𝑔) 𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑔)



Berat sampel (g) 5,0129 5,0118 5,0120 0 1813



a. Kadar sari larut dalam air = 5 0129



0 2136



b. Kadar sari larut dalam air = 5 0118 0 1619



c. Kadar sari larut dalam air = 5 0120



x



100 20



x 100%



Berat sari (g) 0,1813 0,2136 0,1619 100 20 100 20 100 20



100% = 18,08% 100% = 21,30% 100% = 16,15%



Lampiran 6. (Lanjutan)



70 Universitas Sumatera Utara



% Rata-rata kadar sari larut dalam air =



18 08 :21 30 :16 15



= 18,51%



3



3. Perhitungan kadar sari larut dalam etanol



% = Kadar sari larut dalam etanol =



No. 1. 2. 3.



𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑟𝑖 (𝑔)



x



𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑔)



Berat sampel (g) 5,0180 5,0183 5,0183



100 20



x 100%



Berat sari (g) 0,0742 0,0750 0,0674



0 0742



100



a. Kadar sari larut dalam etanol = 5 0180



20



0 0750



100



b. Kadar sari larut dalam etanol = 5 0183



20



0 0674



100



c. Kadar sari larut dalam etanol = 5 0183



20



% Rata-rata kadar sari larut dalam etanol =



100% = 7,39% 100% = 7,47% 100% = 6,71%



7 39 :7 47 :6 71 3



= 7,19%



4. Perhitungan kadar abu total



% Kadar abu total = No. 1. 2. 3.



berat abu (g) berat simplisia (g)



Berat sampel (g) 1,0026 1,0569 1,0221 0 0892



1. Kadar abu total = 1 0026 0 0846



2. Kadar abu total = 1 0569



0 0861



3. Kadar abu total = 1 0221 % Rata-rata kadar abu total =



8 89



100%



Berat abu (g) 0,0892 0,0846 0,0861



100% = 8,89% 100% = 8,00% 100% = 8,42% :8 00 : 8 42 3



= 8,43%



Lampiran 6. (Lanjutan)



71 Universitas Sumatera Utara



5. Perhitungan kadar abu simplisia tidak larut dalam asam



% Kadar abu tidak larut dalam asam =



No. 1. 2. 3.



berat abu (g) x 100% berat simplisia (g)



Berat sampel (g) 1,0026 1,0569 1,0221



Berat abu (g) 0,0071 0,0047 0,0059 0 0071



1. Kadar abu tidak larut dalam asam = x 100% = 0,70% 1 0026 0 0047



2. Kadar abu tidak larut dalam asam = 1 0569 x 100% = 0,44% 0 0059



3. Kadar abu tidak larut dalam asam = 1 0221 x 100% = 0,57% % Rata-rata kadar abu tidak larut dalam asam =



0 70 :0 44 3



:0 57



= 0,57%



Lampiran 7. Contoh perhitungan dosis



72 Universitas Sumatera Utara



Tabel konversi dosis antara jenis hewan dengan manusia



1. Perhitungan dosis ekstrak etanol herba puguntano (EEHP) -



Dosis suspensi EEHP yang akan dibuat adalah 100 mg/kgbb, 200 mg/kgbb, dan 400 mg/kgbb



-



Cara pembuatan suspensi EEHP :



Dihitung dosis yang diperlukan, misalnya: 100 mg/ 1 ml Dosis 100 mg/kg/1000 x 200 kgbb = 20 mg / 1 ml Untuk 4 tikus maka: 20 mg x 4 = 80 mg Untuk 7 hari maka : 80 mg x 7 = 560 mg Aquanya : 1 ml untuk 1 tikus maka : 4 ml untuk 4 tikus Untuk 7 hari maka -



: 4 ml x 7 = 28 ml



Ditimbang ekstrak



Lampiran 7. (Lanjutan)



73 Universitas Sumatera Utara



-



Ditambahkan Na-CMC 1 % secukupnya sebagai emulgator



-



Diaduk/digerus hingga homogen



-



Ditambhakan aqua sampai batas kalibrasi perhitungan dosis



2. Perhitungan dosis metformin -



Dosis Manusia = 500 mg (Nolte dan Karam, 2010)



-



Dosis Tikus (BB=200 g) = dikonversikan = 500 mg x 0,018 x 1000 / 200 g = 45 mg/kgbb



-



Menurut FI edisi III keseragaman bobot = 20 tablet, maka diambil 20 tablet metformin, digerus dan ditimbang berat totalnya = 9521 mg



-



Berat bahan aktif metformin dalam 20 tablet metformin adalah 500 mg/tab x 20 tab = 10000 mg



-



Serbuk tablet metformin yang digunakan :



45 mg/ 10000 mg = a / 9521 mg, a= 42,8445 mg = 43 mg -



Cara pembuatan suspensi metformin :



Timbang 43 mg serbuk tablet metformin dilarutkan dalam 1 ml Misalnya untuk 12 hari maka : 43 mg x 12 = 516 mg Aqua untuk 12 hari maka : 1 ml x 12 = 12 ml 3. Perhitungan larutan streptozotocin untuk diinduksi secara intraperitoneal (i.p) -



Dosis STZ untuk tikus = 35 mg/kgbb



-



Cara pembuatan :



Dihitung dosis yang diperlukan, misalnya : 35 mg/kgbb x 0,2 kg = 7 mg / 0,5 ml Untuk 16 tikus maka : 7 mg x 16 = 112 mg Lampiran 7. (Lanjutan)



74 Universitas Sumatera Utara



Akuabides untuk 16 tikus : 0,5 ml x 16 = 8 ml -



Ditimbang STZ



-



Ditambahkan akuabides dan kocok hingga larut



4. Perhitungan larutan ketamin untuk menganastesi tikus -



Dosis ketamin yang akan diberikan : 70 mg/kg bb



-



Ketamin yang digunakan dalam bentuk larutan injeksi berupa vial sebanyak 10 ml, dimana tiap ml nya mengandung sebanyak 100 mg ketamin



-



Jumlah ketamin yang diberikan 70 mg/1000 g x 200 g = 14 mg



14 mg/100 mg/ml = 0,14 ml (untuk satu dosis) -



Ketamin 0,14 ml dilarutkan dalam larutan fisiologis NaCl 0,9% sebanyak 0,3 ml



-



Volume ketamin yang diberikan pada tikus 0,14 ml + 0,3 ml = 0,4 4 ml



Lampiran 8. Data kadar glukosa darah (KGD) tikus



75 Universitas Sumatera Utara



Kelompok



EEHP 100



Rata-rata SEM



EEHP 200



Rata-rata SEM



EEHP 400



Rata-rata SEM



Metformin



Rata-rata SEM



Na-CMC



Rata-rata SEM



KGDN 80 89 98 83 90 88 3,12 94 99 87 93 96 93,8 1,98 90 97 97 92 88 92,8 1,82 86 95 98 97 90 93,2 2,26 87 84 99 79 89 87,6 3,31



KGD0 436 543 486 502 512 495,8 17,6 497 521 511 489 508 505,2 5,56 525 518 509 513 499 512,8 4,37 520 490 518 509 511 509,6 5,29 530 521 499 501 515 513,2 5,87



KGD3 418 501 439 498 487 468,6 16.9 335 370 382 371 356 362,8 8,07 345 326 335 349 315 334 6,18 283 248 270 268 277 269,2 5,91 521 510 490 500 498 503,8 5,33



KGD5 388 439 401 410 432 414 9,50 328 339 340 331 320 331,6 3,70 292 301 299 300 289 296,2 2,39 183 195 190 178 199 189 3,84 487 501 480 488 475 486,2 4,40



KGD7 340 401 365 378 382 373,2 10,0 299 300 310 298 285 298,4 3,99 271 283 277 281 276 277,6 2,08 130 128 118 122 129 125,4 2,31 438 451 440 438 428 439 3,66



KGD9 300 331 311 315 321 315,6 5,15 267 270 261 241 261 260 5,06 255 266 241 252 248 252,4 4,13 112 108 110 103 111 108,8 1,59 421 430 418 422 417 421,6 2,29



KGD11 260 281 266 273 301 276,2 7,13 181 192 187 190 170 184 3,97 168 178 166 158 150 164 4,70 99 102 98 88 103 98 2,66 408 411 398 408 399 404,8 18,4



KGD13 181 201 198 178 199 191,4 4.88 115 118 121 115 120 117,8 1,24 108 102 111 100 112 106,6 2,40 81 90 78 80 76 81 2,41 381 401 387 400 402 394,2 4,29



KGD15 114 124 120 118 122 119,6 1,72 80 81 79 85 80 81 1,04 78 82 80 79 80 79,8 0,66 70 68 72 69 67 69,2 0,86 369 378 376 402 396 378,8 6,23



76 Universitas Sumatera Utara



Lampiran 9. Gambar alat glukometer dan contoh hasil KGD



B



A



C



Keterangan: A: strip glukosa, B: alat glukometer, C: contoh hasil pengukuran kadar gula darah



77 Universitas Sumatera Utara



Lampiran 10. Hasil analisis data statistik KGD 1. Uji Homogenitas



obat KGD_N p100 p200 p400 metformin



Tests of Normality Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk Statistic df Sig. Statistic Df Sig. ,187 5 ,200* ,961 5 ,814 * ,228 5 ,200 ,960 5 ,811 ,248 5 ,200* ,881 5 ,314 * ,239 5 ,200 ,909 5 ,460



cmc na KGD_0 p100 p200 p400 Metformin cmc na KGD_3 p100 p200 p400 Metformin cmc na KGD_5 p100 p200 p400 Metformin cmc na KGD_7 p100 p200 p400 Metformin cmc na KGD_9 p100 p200 p400 Metformin Lampirancmc 10. (Lanjutan) na KGD_11 p100 p200



,225 ,202 ,189 ,148 ,280 ,222 ,287 ,255 ,186 ,264 ,225 ,201 ,215 ,299 ,158 ,227 ,184 ,282 ,167 ,292 ,251 ,145 ,335 ,189 ,232 ,269 ,182 ,233



5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5



,200* ,200* ,200* ,200* ,200* ,200* ,200* ,200* ,200* ,200* ,200* ,200* ,200* ,163 ,200* ,200* ,200* ,200* ,200* ,188 ,200* ,200* ,069 ,200* ,200* ,200* ,200* ,200*



,959 ,966 ,979 ,994 ,865 ,928 ,847 ,930 ,957 ,920 ,964 ,946 ,931 ,855 ,966 ,954 ,976 ,922 ,967 ,871 ,928 ,997 ,839 ,982 ,885 ,877 ,939 ,898



5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5



,802 ,848 ,927 ,991 ,247 ,584 ,184 ,595 ,788 ,533 ,836 ,708 ,603 ,210 ,850 ,767 ,911 ,541 ,855 ,272 ,582 ,998 ,161 ,946 ,334 ,296 ,660 ,400



78 Universitas Sumatera Utara



,200* ,161 ,140 ,088 ,200* ,200* ,161 ,085 ,200* ,161 ,200*



,987 ,842 ,842 ,801 ,876 ,894 ,867 ,819 ,979 ,813 ,956



5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5



,966 ,171 ,171 ,082 ,292 ,377 ,255 ,116 ,928 ,103 ,777



metformin ,141 5 ,200* cmc na ,270 5 ,200* *. This is a lower bound of the true significance. a. Lilliefors Significance Correction



,979 ,903



5 5



,928 ,428



p400 metformin cmc na KGD_13 p100 p200 p400 metformin cmc na KGD_15 p100 p200 p400



,175 ,300 ,307 ,326 ,244 ,204 ,300 ,328 ,141 ,300 ,246



5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5



2. Uji ANOVA ANOVA Sum of Squares KGD_N Between Groups Within Groups Total KGD_0 Between Groups Within Groups Total KGD_3 Between Groups Within Groups Total KGD_5 Between Groups



Mean Square



df



182,240



4



45,560



661,600



20



33,080



843,840



24



1035,040



4



258,760



8464,400



20



423,220



9499,440



24



187849,840



4



46962,460



9043,600



20



452,180



196893,440



24



257913,200



4



64478,300



F



Sig.



1,377



,277



,611



,659



103,858



,000



447,953



,000



79 Universitas Sumatera Utara



Lampiran 10. (Lanjutan) Within 2878,800 Groups Total 260792,000 KGD_7 Between 278158,640 Groups Within 2822,400 Groups Total 280981,040 KGD_9 Between 257215,040 Groups Within 1540,400 Groups Total 258755,440 KGD_11 Between 282398,400 Groups Within 2057,600 Groups Total 284456,000 KGD_13 Between 325264,000 Groups Within 1110,000 Groups Total 326374,000 KGD_15 Between 359694,960 Groups Within Groups Total



20



143,940



24 4



69539,660



20



141,120



492,770



,000



834,897



,000



686,233



,000



1465,153



,000



2003,648



,000



24 4



64303,760



20



77,020



24 4



70599,600



20



102,880



24 4



81316,000



20



55,500



24 4



89923,740



897,600



20



44,880



360592,560



24



Multiple Comparisons Tukey HSD



Dependent Variable (I) obat KGD_N p100 Lampiran 10. (Lanjutan)



(J) obat



Mean Differe Std. nce (I-J) Error



p200 p400



-5,800 -4,800



3,6 3,6



Sig. ,518 ,683



95% Confidence Interval Upper Lower Boun Bound d -16,69 -15,69



5,09 6,09



80 Universitas Sumatera Utara



metfor min



p200



cmc na p100



p400



,400



p100



p200



p400 Lampiran 10. (Lanjutan)



,617



3,6 1,000



-16,09



5,69



-10,49 11,29



3,6



,518



-5,09 16,69



p400 metfor min cmc na p100



1,000



3,6



,999



-9,89 11,89



3,6 1,000



-10,29 11,49



p200 metfor min



p400



KGD_0



3,6



5,800



cmc na metformin p100 p200



cmc na



-5,200



,600 6,200



3,6



,454



-4,69 17,09



4,800



3,6



,683



-6,09 15,69



-1,000



3,6



,999



-11,89



9,89



-,400



3,6 1,000



5,200



3,6



,617



-5,69 16,09



5,200 -,600



3,6 ,617 3,6 1,000



-5,69 16,09 -11,49 10,29



,400 5,600 -,400 -6,200 -5,200



3,6 1,000 3,6 ,550 3,6 1,000 3,6 ,454 3,6 ,617



-10,49 11,29 -5,29 16,49 -11,29 10,49 -17,09 4,69 -16,09 5,69



3,6



,550



-16,49



13,0 13,0



,949 ,690



-48,33 29,53 -55,93 21,93



13,0



,824



-52,73 25,13



13,0



,672



-56,33 21,53



13,0 13,0



,949 ,976



-29,53 48,33 -46,53 31,33



13,0



,997



-43,33 34,53



13,0



,971



-46,93 30,93



13,0 13,0



,690 ,976



-21,93 55,93 -31,33 46,53



p100 p200 p400 metfor -5,600 min p200 -9,400 p400 -17,000 metfor -13,800 min cmc -17,400 na p100 9,400 p400 -7,600 metfor -4,400 min cmc -8,000 na p100 17,000 p200 7,600



-11,29 10,49



5,29



81 Universitas Sumatera Utara



KGD_3



metfor 3,200 min cmc -,400 na metformin p100 13,800 p200 4,400 p400 -3,200 cmc -3,600 na cmc na p100 17,400 p200 8,000 p400 ,400 metfor 3,600 min p100 p200 105,800 *



p400



134,600 *



p200



metfor 199,400 * min cmc -35,200 na p100 105,800



13,0



,999



-35,73 42,13



13,0 1,000



-39,33 38,53



13,0 13,0 13,0



,824 ,997 ,999



-25,13 52,73 -34,53 43,33 -42,13 35,73



13,0



,999



-42,53 35,33



13,0 ,672 13,0 ,971 13,0 1,000



-21,53 56,33 -30,93 46,93 -38,53 39,33



13,0



,999



-35,33 42,53



13,4



,000



65,56 146,0



13,4



,000



94,36 174,8



13,4



,000



159,16 239,6



13,4



,105



-75,44



13,4



,000 -146,04 -65,56



13,4



,242



-11,44 69,04



13,4



,000



53,36 133,8



13,4



,000 -181,24 -100,7



13,4



,000 -174,84 -94,36



13,4



,242



13,4



,001



13,4



,000 -210,04



5,04



*



p400 28,800 metfor 93,600* min cmc na 141,000 *



p400



p100



134,600 *



Lampiran 10. (Lanjutan)



p200 -28,800 metfor 64,800* min cmc na 169,800



-69,04 11,44 105,0 24,56 4 -129



*



82 Universitas Sumatera Utara



metformin p100



199,400



13,4



,000 -239,64



-159



13,4



,000 -133,84 -53,3



13,4



,001 -105,04 -24,5



13,4



,000 -274,84



13,4



,105



-5,04 75,44



13,4



,000



100,76 181,2



13,4



,000



129,56 210,0



13,4



,000



194,36 274,8



7,5



,000



59,69 105,1



7,5



,000



95,09 140,5



7,5



,000



202,29 247,7



7,5



,000



-94,91 -49,4



7,5



,000 -105,11 -59,6



7,5



,001



12,69 58,11



7,5



,000



119,89 165,3



7,5



,000 -177,31



7,5



,000 -140,51 -95,0



7,5



,001



-58,11 -12,6



7,5



,000



84,49 129,9



*



p200 p400 cmc na



93,600* 64,800* 234,600



-194



*



cmc na



p100 p200



35,200 141,000 *



p400



169,800 *



KGD_5



p100



metfor 234,600 * min p200 82,400* p400 117,800 *



p200



metfor 225,000 * min cmc na 72,200* p100 82,400* p400 35,400* metfor 142,600 * min cmc na 154,600



-131



*



p400



p100



117,800 *



p200 Lampiran 10. (Lanjutan)



-



35,400* metfor 107,200 * min



83 Universitas Sumatera Utara



cmc na



190,000



7,5



,000 -212,71



-167



7,5



,000 -247,71



-202



7,5



,000 -165,31



-119



7,5



,000 -129,91 -84,4



7,5



,000 -319,91



7,5



,000



49,49 94,91



7,5



,000



131,89 177,3



7,5



,000



167,29 212,7



7,5



,000



274,49 319,9



7,5 7,5



,000 ,000



52,32 97,28 73,12 118,0



7,5



,000



225,32 270,2



7,5



,000



-88,28



7,5



,000



-97,28 -52,3



7,5



,078



-1,68 43,28



7,5



,000



150,52 195,4



7,5



,000 -163,08 -1182



7,5



,000 -118,08 -73,1



7,5



,078



-43,28



7,5



,000



129,72 174,6



*



metformin p100



225,000 *



p200



142,600 *



p400



107,200 *



cmc na



297,200



-274



*



cmc na



72,200* 154,600



p100 p200



*



p400



190,000 *



KGD_7



p100



p200



metfor min p200 p400 metfor min cmc na p100



297,200 *



74,800* 95,600* 247,800 *



-



65,800* 74,800* p400 20,800 Metfo 173,000 * rmin cmc na 140,600



-43



*



p400



Lampiran 10. (Lanjutan)



p100



-



95,600* p200 -20,800 Metfo 152,200 * rmin



1,68



84 Universitas Sumatera Utara



cmc na



161,400



7,5



,000 -183,88



-138



7,5



,000 -270,28



-225



7,5



,000 -195,48



-150



7,5



,000 -174,68



-129



7,5



,000 -336,08



-291



7,5



,000



43,32 88,28



7,5



,000



118,12 163,0



7,5



,000



138,92 183,8



7,5



,000



291,12 336,0



5,5 5,5



,000 ,000



38,99 72,21 46,59 79,81



*



5,5



,000



190,19 223,4



106,000



5,5



,000 -122,61 -89,3



5,5



,000



-72,21 -38,9



5,5



,653



-9,01 24,21



5,5



,000



134,59 167,8



5,5



,000 -178,21



5,5



,000



-79,81 -46,5



5,5



,653



-24,21



*



metformin p100



247,800 *



p200



173,000 *



p400



152,200 *



cmc na



313,600 *



cmc na



p100 p200



65,800* 140,600 *



p400



161,400 *



KGD_9



p100



Metfo rmin p200 p400 Metfo rmin cmc na



313,600 *



55,600* 63,200* 206,800



*



p200



p100



-



55,600* p400 7,600 Metfo 151,200 * rmin cmc na 161,600



-144



*



p400 Lampiran 10. (Lanjutan)



p100



-



p200



63,200* -7,600



9,01



85 Universitas Sumatera Utara



Metfo 143,600 * rmin cmc na 169,200



5,5



,000



126,99 160,2



5,5



,000 -185,81



-152



5,5



,000 -223,41



-190



5,5



,000 -167,81



-134



5,5



,000 -160,21



-126



5,5



,000 -329,41



-296



5,5



,000



89,39 122,6



5,5



,000



144,99 178,2



5,5



,000



152,59 185,8



5,5



,000



296,19 329,4



6,4



,000



73,00 111,4



6,4



,000



93,00 131,4



6,4



,000



159,00 197,4



6,4



,000 -147,80



6,4



,000 -111,40 -73,0



6,4



,039



,80 39,20



6,4



,000



66,80 105,2



6,4



,000 -240,00



*



Metformin p100



206,800 *



p200



151,200 *



p400



143,600 *



cmc na



312,800 *



cmc na



p100



106,000 *



p200



161,600 *



p400



169,200 *



KGD_11



p100



Metfo 312,800 * rmin p200 92,200* p400 112,200 *



Metfo 178,200 * rmin cmc na 128,600



-109



*



p200



p100



92,200* 20,000*



Lampiran 10. (Lanjutan)



p400 metfor 86,000* min cmc na 220,800



-201



*



86 Universitas Sumatera Utara



p400



p100



112,200



6,4



,000 -131,40 -93,0



6,4



,039



6,4



,000



6,4



,000 -260,00



-221



6,4



,000 -197,40



-159



6,4



,000 -105,20 -66,8



6,4



,000



6,4



,000 -326,00



6,4



,000



109,40 147,8



6,4



,000



201,60 240,0



6,4



,000



221,60 260,0



6,4



,000



287,60 326,0



4,7 4,7



,000 ,000



59,50 87,70 70,70 98,90



*



4,7



,000



96,30 124,5



202,800



4,7



,000 -216,90



4,7



,000



-87,70 -59,5



4,7



,163



-2,90 25,30



4,7



,000



22,70 50,90



*



p200



20,000*



metfor 66,000* min cmc na 240,800



-39,20



-,80



46,80 85,20



*



metformin p100



178,200 *



p200



86,000* 66,000* 306,800



p400 cmc na



-85,20 -46,8



-287



*



cmc na



p100



128,600 *



p200



220,800 *



p400



240,800 *



KGD_13



p100



metfor min p200 p400 metfor min cmc na



306,800 *



73,600* 84,800* 110,400



-188



*



p200 Lampiran 10. (Lanjutan)



p100



73,600* 11,200



p400 metfor 36,800* min



87 Universitas Sumatera Utara



cmc na



276,400



4,7



,000 -290,50



-262



4,7



,000



-98,90 -70,7



4,7



,163



-25,30



4,7



,000



4,7



,000 -301,70



4,7



,000 -124,50 -96,3



4,7



,000



-50,90 -22,7



4,7



,000



-39,70 -11,5



4,7



,000 -327,30



4,7



,000



188,70 216,9



4,7



,000



262,30 290,5



4,7



,000



273,50 301,7



*



4,7



,000



299,10 327,3



38,600* 39,800*



4,2 4,2



,000 ,000



25,92 51,28 27,12 52,48



50,400*



4,2



,000



37,72 63,08



264,600



4,2



,000 -277,28



4,2



,000



-51,28 -25,9



4,2



,998



-11,48 13,88



*



p400



p100



84,800* -11,200



p200 metfor 25,600* min cmc na 287,600



2,90



11,50 39,70



-273



*



Metformin p100



110,400 *



p200



36,800* 25,600* 313,200



p400 cmc na



-299



*



cmc na



p100



202,800 *



p200



276,400 *



p400



287,600 *



p100



metfor min p200 p400 metfor min cmc na



313,200



-251



*



p200



p100



-



p400



38,600* 1,200



Lampiran 1



88 Universitas Sumatera Utara



metfor min cmc na



11,800



4,2



,076



-,88 24,48



303,200



4,2



,000 -315,88



4,2



,000



-52,48 -27,1



4,2



,998



-13,88 11,48



4,2



,130



-2,08 23,28



4,2



,000 -317,08



4,2



,000



-63,08 -37,7



4,2 4,2



,076 ,130



-24,48 -23,28



,88 2,08



4,2



,000 -327,68



-302



4,2



,000



251,92 277,2



4,2



,000



290,52 315,8



4,2



,000



291,72 317,0



,000



302,32 327,6



-290



*



p400



p100



39,800* -1,200



p200 metfor 10,600 min cmc na 304,400



-291



*



Metformin p100



-



p200 p400 cmc na



50,400* -11,800 -10,600 315,000 *



cmc na



p100



264,600 *



p200



303,200 *



p400



304,400 *



metfor 315,000 4,2 * min *. The mean difference is significant at the 0.05 level.



89 Universitas Sumatera Utara



Lampiran 10. (Lanjutan) 3. Homogenitas Subset KGD_13 a Tukey HSD Subset for alpha = 0.05 Obat Metformin p400 p200



N 5 5 5



1 81,00



2



3



4



106,60 117,80



5 191,40 p100 cmc na 5 394,20 Sig. 1,000 ,163 1,000 1,000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5,000. KGD_15 a



Tukey HSD



Subset for alpha = 0.05 Obat Metformin p400 p200 p100 cmc na Sig.



N 5 5 5 5 5



1 69,20 79,80 81,00



2



3



119,60 ,076



1,000



384,20 1,000



Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5,000.



90 Universitas Sumatera Utara



Lampiran 11. Data kadar sRAGE tikus diabetes melitus Kelompok



Pog 200



Pog 400



Metformin



Na-CMC



26,5000



24,2778



25,3889



19,2778



171,7778



29,8333



23,4444



28,1667



19,2778



167,8889



28,7222



22,8889



29,2778



18,4444



163,4444



28,1667



21,7778



28,4444



17,8889



173,1667



Rata-rata



28,30555



23,0972



27,8194



18,7222



169,0694



SEM



1,38



1,04



1,68



0,68



4,36



Kadar



Pog 100



91 Universitas Sumatera Utara



Lampiran 12. Hasil analisis data statistik kadar sRAGE 1. Uji Normalitas Tests of Normality Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk Sampel Statistic df Sig. Statistic df kadar1 pog 100 ,210 4 . ,982 4 pog 200 ,171 4 . ,994 4 pog 400 ,332 4 . ,865 4 metformin ,293 4 . ,860 4 na-cmc ,233 4 . ,940 4



Sig. ,911 ,976 ,279 ,262 ,652



a. Lilliefors Significance Correction 2. Uji ANOVA ANOVA kadar1



Between Groups Within Groups Total



Sum of Squares 67137,295 76,177 67213,473



df



Mean Square F 4 16784,324 3304,980 15 5,078 19



Sig. ,000



Multiple Comparisons Dependent Variable: kadar1 Tukey HSD



(I) sampel (J) sampel pog 100 pog 200 pog 400



95% Confidence Interval Mean Difference (I- Std. Upper J) Error Sig. Lower Bound Bound * 5,2083250 1,5 ,036 ,287712 10,128938 ,4861000 1,5 ,998 -4,434513 5,406713



9,5833250* 140,7639000* pog 200 pog 100 -5,2083250* pog(Lanjutan) 400 -4,7222250 Lampiran 12. Metformin 4,3750000 na-cmc 145,9722250* Metformin na-cmc



1,5



,000



1,5



,000



1,5 1,5 1,5



,036 ,063 ,093



1,5



,000



4,662712 14,503938 -145,684513 135,843287 -10,128938 -,287712 -9,642838 ,198388 -,545613 9,295613 -150,892838 141,051612



92 Universitas Sumatera Utara



pog 400



pog 100 pog 200 metformin na-cmc



-,4861000 4,7222250 9,0972250* 141,2500000* -9,5833250* -4,3750000 -9,0972250* 150,3472250* 140,7639000*



1,5 1,5 1,5



,998 ,063 ,000



1,5



,000



1,5 1,5 1,5



,000 ,093 ,000



1,5



,000



1,5



,000



-5,406713 4,434513 -,198388 9,642838 4,176612 14,017838 -146,170613 136,329387 -14,503938 -4,662712 -9,295613 ,545613 -14,017838 -4,176612 -155,267838 145,426612 135,843287 145,684513



pog 200



145,9722250



*



1,5



,000



141,051612 150,892838



pog 400



141,2500000*



1,5



,000



136,329387 146,170613



metformin 150,3472250 1,5 ,000 *. The mean difference is significant at the 0.05 level.



145,426612 155,267838



Metformin pog 100 pog 200 pog 400 na-cmc na-cmc



pog 100



*



kadar1 a



Tukey HSD



Subset for alpha = 0.05 2 3



Sampel N 1 4 Metformin 4 18,722225 pog 200 4 23,097225 23,097225 pog 400 4 27,819450 27,819450 pog 100 4 28,305550 na-cmc 4 169,069450 Sig. ,093 ,063 ,998 1,000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4,000.



93 Universitas Sumatera Utara