Ringkasan Kuliah Mikroteknik [PDF]

Citation preview

1



RINGKASAN KULIAH MIKROTEKNIK   



KETERKAITAN MIKROTEKNIK DENGAN ILMU LAIN Mikroteknik sangat berhubungan dengan ilmu lain, misal Histologi, Teratologi (Kelainan perkembangan), maupun Patologi.  Pada dasarnya ilmu ini terkait sebagai penunjang dalam ilmu dasar maupun ilmu terapan seperti Bidang pertanian, kedokteran maupun ilmu lain yang serumpun.  MIKROTEKNIK DAN MANFAATNYA  Ilmu ini menyediakan berbagai metode preparasi yang banyak digunakan untuk menelaah organ, jaringan maupun sel.  Organ maupun jaringan yang ditelaah bisa berupa organ maupun jaringan yang normal, atau yang mengalami kelainan karena penyakit maupun penyebab lain.  BERBAGAI MACAM AWETAN  Preparat Sementara : Preparat yang dibuat bersifat sementara dan tidak dapat disimpan dalam waktu lama. Contohnya untuk mengamati anatomi batang akar maupun bagian lain pada tumbuhan dengan mengiris langsung bagian tersebut dan diletakkan pada kaca benda yang ditetesi air, ditutup dengan kaca penutup dan diamati di bawah mikroskop. Kalaupun misalnya ada pewarnaan sifatnya juga sementara. Setelah pengamatan, spesimen dibuang, kaca benda dibersihkan.  BERBAGAI MACAM AWETAN ( lanjutan 1 )  Preparat permanen : preparat yang dalam pembuatannya memerlukan prosedur tertentu, cukup rumit dan melibatkan berbagai zat kimia dan peralatan tertentu. hasilnya merupakan preparat yang dapat disimpan dalam waktu bertahun – tahun.  BERBAGAI MACAM AWETAN ( lanjutan 2 )  Preparat utuh / Whole Mount : Preparat yang dibuat dari organ atau bagian organisme, atau organisme utuh tanpa melakukan pengirisan. Preparat hapusan / Smear : Biasanya dibuat dari cairan maupun larutan yang dihapuskan pada kaca benda. Contoh smear darah, smear sperma, smear faeces.  Contoh pembuatan preparat apusan.1  Contoh pembuatan preparat apusan.2  BERBAGAI MACAM AWETAN ( lanjutan 3 )  Preparat Pejetan / Squash : Preparat ini dibuat dengan cara menekan benda yang diamati di atas kaca benda, shg diperoleh lapisan yang cukup tipis dari benda yang diamati. Contoh squash ujung akar Allium cepa, squash kelenjar ludah larva Drosophylla  Preparat Irisan : Dibuat dari irisan / penyayatan organ tubuh mahluk hidup. ( baik preparat sementara ataupun permanen )  BERBAGAI MACAM AWETAN ( lanjutan 4 )  Preparat Isolasi / pemisahan : Preparat ini dibuat dengan cara memisahkan bagian – bagian tubuh organisme untuk di pelajari. Contoh preparat alat mulut serangga, kepala sari dari bunga, dsb. Maserasi :



2 Preparat ini dibuat dengan cara meluruhkan bagian yang tidak tahan terhadap zat maserator, shg tersisa bagian yang tahan. Contoh sel – sel dari jaringan pengangkut.  Contoh alat dalam mikroteknik  Rottarry miicrrottomes  Contoh alat untuk mengamati hasil mikroteknik (Foto mikroskop/fotomikrograf )  Contoh alat untuk mengamati hasil mikroteknik ( mikroproyektor )  GELAS PEWARNAAN  PEMBUATAN PREPARAT PEJETAN (SQUASH )  Kompetensi yang diharapkan :  Terampil membuat sediaan untuk memperoleh jaringan yang tipis dari organ tumbuhan. Dengan tehnik squash ( pejetan )  Tujuan :  membuat preparat sementara dari ujung akar tumbuhan untuk melihat tingkah laku kromosom pada saat terjadi pembelahan mitosis  membuat preparat sementara dari kepala sari bunga untuk melihat tingkah laku kromosom pada saat terjadi pembelahan meiosis.  Cara Kerja: Tahap I Penumbuhan akar bawang merah dalam air  5 hari sebelum praktikum pembuatan preparat squash, dilakukan penumbuhan akar dari umbi bawang merah dengan cara : beberapa umbi bawang merah ditusuk dengan lidi dari samping setinggi setengah panjang umbi; letakkan deretan umbi pada lidi dalam air dalam gelas aqua dengan posisi sekitar 1/3 panjang umbi bagian bawah terendam air; biarkan selama 5 hari sampai tumbuh akar.  Penumbuhan akar bawang merah dalam air  Tahap II preparat untuk pengamatan mitosis : 1. Potonglah ujung akar bawang merah sepanjang sekitar 5 mm dari ujungnya dan fiksir dengan FAA selama 24 jam. (pengambilan siang – 14.00) 2. Pindahkan ke dalam alcohol 70 % sebagai larutan preservative. Dalam larutan ini akar dapat disimpan lama; 3. Masukkan ujung akar ke dalam larutan hidrolisis yang terdiri dari HCl 1 N selama 2 – 5 menit. 4. Pindahkan ujung akar ke dalam gelas arloji yang telah diisi dengan acetocarmine dan biarkan sampai ujung akar berwarna biru kehitaman, untuk mempercepat proses panaskan diatas api Bunsen. 5. Letakkan ujung akar diatas kaca benda dan tutup dengan kaca penutup. Dengan menggunakan ibu jari dan bantalan kertas pejetlah akar tersebut hingga rata. 6. Periksalah dibawah mikroskop dengan pembesaran kuat, kromosom akan berwarna biru kehitaman.  Mitosis : ipmat  preparat untuk pengamatan meiosis : 1. Petiklah kuncup bunga (belum mekar, sebelum mikrosporogenesis ,pengambilan 08.00 – 11.00 pagi) dan fiksir dengan FAA selama 24 jam. 2. Pindahkan ke dalam alcohol 70 % sebagai larutan preservative. Dalam larutan ini kuncup bunga dapat disimpan lama;



3 3.



Bukalah kuncup bunga tersebut, carilah kepala sarinya, bila sudah ketemu Masukkan ke dalam larutan hidrolisis yang terdiri dari HCl 1 N selama 2 – 5 menit. 4. Pindahkan kepala sarinya ke dalam gelas arloji yang telah diisi dengan acetocarmine dan biarkan sampai kepala sarinya berwarna biru kehitaman, untuk mempercepat proses panaskan diatas api Bunsen. 5. Letakkan kepala sarinya diatas kaca benda dan tutup dengan kaca penutup. Dengan menggunakan ibu jari dan bantalan kertas pejetlah kuncup bunga tersebut hingga rata. 6. Periksalah dibawah mikroskop dengan pembesaran kuat, kromosom akan berwarna biru kehitaman.  MIKROMETRI  Mengukur panjang/lebar sel atau bagian sel Alat yg diperlukan : Mikroskop Okuler mikrometer Objek mikrometer Preparat  Okuler/objek mikrometer  Mencari nilai skala okuler mikrometer 1. Mata ditempelkan di atas lensa okuler, dilihat apakah bayangan skalaskala okuler mikrometer sudah jelas. 2. Objek mikrometer ditempatkan di bawah objektif, dicari bayangan yang jelas dari skala-skala objek mikrometer tsb, bersama-sama dengan bayang skala-skala okuler mikrometer. 3. Kedua bayangan skala tersebut dibuat sejajar dengan memutar okuler dalam tabungnya. Titik-titik 0 dari kedua skala tersebut diletakkan sama tinggi dgn menggerakkan objek mikrometer. 4. Dicari bayangan garis skala kedua mikrometer tsb yg berimpit(sama tinggi). Dihitung jumlah bagian skala pd masing-2 mikrometer dihitung dari titik 0 s/d garis skala yang berimpit tadi. 5. Jarak sesungguhnya antara 2 garis skala objektif mikrometer diketahui (tertulis pd objek mikrometer), jd skala okuler mikrometer dpt dihitung.  Mengukur panjang/lebar sel atau bagian sel 1. Objek mikrometer diambil, diganti dgn preparat, bayangan preparat dicari. Kombinasi objektif, okuler serta panjang tubus sama dengan waktu mencari nilai skala okuler mikrometer. 2. Bayangan skala okuler mikrometer ditempatkan pd bayangan preparat sedemikian, hingga arah bayangan skala itu sesuai dgn arah panjang/lebar sel/bagian sel yg diukur. Jml bgian skala dikalikan dgn nilai skala adalah panjang/lebar yag dcari. Catatan : perbesaran tetap dari peneraan s/d pengamatan preparat.  SELAMAT MENCOBA  TERIMA KASIH 4. LANGKAH – LANGKAH MIKROTEKNIK Mematikan Fiksasi Pencucian Dehidrasi Dealkoholisasi Infiltrasi parafin Embedding dan pembuatan blok



4 Penyayatan Penempelan Pewarnaan / Staining Merekat / Mounting Pemberian etiket / Labelling Mematikan Bahan yang akan dibuat preparat baik sementara maupun awetan, baik dari tumbuhan maupun hewan haruslah dimatikan terlebih dahulu. Mematikan bisa secara cepat maupun secara lambat. Contoh zat yang bisa digunakan untuk mematikan misalnya gas CO2, Eter, Kloroform, Aseton, Metan. Aplikasi zat bisa lewat udara, perendaman, atau injeksi. Setelah mematikan, kemudian dilakukan pemotongan organ dan jaringan yang dikehendaki. Contoh pembuatan preparat apusan.1 Fiksasi Fiksasi bertujuan untuk mempertahankan kondisi yang mendekati kondisi aslinya. Dilakukan sesegara mungkin setelah pemotongan ( diseksi ) Menggunakan larutan fiksatif yang sesuai, baik tunggal ( contoh : Formalin, Alkohol, Asam asetat ) maupun majemuk ( contoh : Lar. Bouin, Carnoy, FAA ). Waktu yang diperlukan bisa beberapa jam atau beberapa hari, tergantung sifat zat dan jaringan. BERBAGAI MACAM FIKSASI Fiksasi merupakan suatu langkah dlm mikroteknik yang sangat menentukan keberhasilan langkah selanjutnya. Larutan yang digunakan dalam fiksasi sangat beragam, disesuaikan dengan sifat spesiment yang akan difiksasi. Contoh larutan fiksatif tunggal : Formalin, Alkohol, Asam asetat, asam pikrat, Kalium bikromat, Asam kromat, Mercurie clorida, Osmium tetra oksida, Larutan fiksatif tunggal pada umumnya kurang memenuhi syarat larutan fiksatif yang baik. Berbagai macam fiksasi lanjutan ( 1 ) Larutan fiksatif campuran lebih sering digunakan karena lebih bisa diramu sesuai keinginan. Nama larutan biasanya sesuai nama penemu formulanya. Contoh – contoh larutan fiksatif campuran Lar. Bouin : biasanya untuk fiksasi jaringan hewan. Merupakan campuran asam pikrat dan asam asetat glasial. Lar. Formol saline : campuran dari NaCl, Aquades, dan formalin Berbagai macam fiksasi lanjutan ( 2 ) Larutan Zenker : campuran dari merkuri klorida, kalium bikromat, natrium sulfat, aquadest. Jika akan dipakai, ditambahkan asam asetat glasial. Fiksatif ini sering dipakai dalam patologi, misalnya untuk memfiksasi tumor, dan beberapa jaringan lain pada hewan. Larutan Helly : larutan induk sama dengan larutan zenker, tetapi learutan tambahan ketika akan dipakai adalah formalin 5 – 10 %. Berbagai macam fiksasi lanjutan ( 3 ) Larutan FAA : merupakan campuran dari Formalin, Alkohol 70 % dan Asam asetat glasial. Sering digunakan dalam fiksasi jaringan tumbuhan, bisa digunakan untuk fiksasi jaringan hewan dengan porsi komposisi yang berbeda. Pencucian / Washing Dilakukan segera setelah fiksasi selesai Tujuannya menghilangkan sisa larutan fiksatif yang tertinggal dalam jaringan. Pencuci : air, atau alkohol dengan konsentrasi tertentu. Caranya : bisa direndam berkali – kali dengan pencucinya, atau ditaruh dibawah air mengalir pelan, dengan teknik tertentu.



5 Dehidrasi Akibat pencucian terdapat air yang masih tertinggal dalam jaringan, sehingga harus dikeluarkan Cara : dengan direndam secara bertahap dalam alkohol bertingkat, dari konsentrasi rendah ke tinggi. Sehingga air tertarik secara bertahap dan tidak menyebabkan jaringan menjadi Colaps. Pada langkah ini terdapat Stopping point ( waktu istirahat ) pada alkohol 70 %. Shg proses bisa dilanjutkan esok hari. Dealkoholisasi / Penjernihan Clearing Setelah proses dehidrasi, terdapat alkohol yang tertinggal dalam jaringan. Alkohol harus dikeluarkan dari jaringan karena alkohol tidak larut dalam parafin maupun balsam canada. Cara : dengan merendam bahan dalam campuran Alkohol dan Xylol berseri, sampai ke Xylol murni. Sifat Xylol memberi efek menjernihkan. Infiltrasi Parafin Infiltrasi berarti memasukkan medium kedalam seluruh ruangan yang ada dalam jaringan, shg ketika medium ( parafin ) memadat, jaringan tidak rusak ketika diiris. Dilakukan bertahap dalam campuran Xylol dan parafin, sampai ke parafin murni. Dilakukan dalam Oven, dengan suhu sedikit diatas titik leleh parafin yang dipakai Contoh titik leleh parafin dalam derajat Celcius 48, 52, 58. Embedding / penanaman dan Pembuatan Blok Penanaman dengan cara memasukkan sampel dari rendaman dalam infiltrasi dalam Oven, ke dalam blok – blok cetakan parafin Cetakan bisa dibuat dari logam, plastik, atau kertas. Dalam penanaman harus dipertimbangkan posisi dengan rencana arah irisan. Biarkan sampai blok parafin mengeras, kemudian dilepas dari cetakan. Contoh pembuatan cetakan blok Penyayatan / Section Penyayatan dilakukan dengan Mikrotom. Cara : Tempelkan blok parafin pada pemegang blok, atur posisi, jarak dengan pisau, ketebalan irisan, dan arah irisan Arah irisan bisa - melintang - membujur ( radial atau tangensial ) CONTOH CONTOH ARAH PENYAYATAN Contoh hasil irisan dengan arah berbeda 1. melintang Contoh hasil irisan dengan arah berbeda 1. membujur Contoh hasil irisan dengan arah berbeda 1. membujur Menempel / Afiksasi Melekatkan pita hasil irisan pada kaca preparat dengan perekat, misal perekat Haupt, albumen Mayer. Dilakukan dengan alat : kuas kecil, pinset, scalpel, cutter, dsb. Lakukan dengan cermat hingga posisi datar. Panaskan diatas Hotplate sampai kering. Jika kaca benda tampak kotor sebelum dipakai, cuci dahulu dengan alkohol, biarkan kering. Pewarnaan / Staining Tujuan : memperjelas unsur jaringan shg mudah dipelajari.



6 Tiap zat warna memiliki kemampuan khusus dalam mewarnai jaringan. Contoh : Safranin untuk mewarnai lignin dan dinding sel; Hematoxylin dan Carmin untuk inti sel; Fastgreen untuk selulose, kloroplast dan sitoplasma. Prosedur pewarnaan bisa pewarnaan tunggal atau ganda. ( lihat bagan ) BERBAGAI MACAM PEWARNAAN Beberapa contoh pewarnaan. Mayers Hemalum : zat warna hematin dilarutkan dalam alkohol 95 %, biasanya ditambahkan Potasium alum. Dibiarkan dahulu selama 24 jam, lalu disaring sebelum digunakan. Hematoxilin asam Ehrlich : campuran dari alkohol absolut, hematoxilin, asam asetat glasial, dan gliserol. Tambahkan larutan Mordannya berupa kalium alum ( hablur ) dengan akuades. Larutan ini bisa dipakai mewarnai sayatan dan organ utuh. BERBAGAI PEWARNA LANJUTAN ( 1 ) Larutan Hematoxilin Mallory : merupakan campuran dari akuades, phosphotungstic acid, hematoxilin, hidrogen peroxide. Bahan padat( 2,3 ) dimasukkan dalam akuadfes, tambahkan bahan 4. Pewarna ini jika digunakan akan menghasilkan warna biru pada inti dan jar. Penghubung, serabut kolagen dan elemen antar sel akan berwarna kuning, merah, atau merah coklat. BERBAGAI PEWARNA LANJUTAN ( 2 ) Safranin – Fast Green : pewarnaan ganda ini dilakukan berturutan. Dilakukan dulu pewarnaan dengan safranin 1 % dalam akuades, setelah pembilasan, kemudian secara bertahap dalam larutan alkohol berseri, kemudian dimasukkan dalam pewarna Fast green 0,2 % dalam alkohol 95 %. Beberapa contoh hasil pewarnaan ganda Contoh hasil pewarnaan pada jaringan muda dengan pewarna Haemalum Contoh hasil pewarnaan dengan safranin Merekat / Mounting Tujuan : agar preparat tahan lama. Dilakukan setelah preparat selesai diwarnai, dan dikeluarkan dari Xylol murni. Cara : ditetesi Entelan atau balsam canada, kemudian ditutup dengan kaca penutup. Dilakukan dengan cermat, baik posisi maupun jumlah tetesan, shg tidak lebih atau kurang. Jangan sampai ada gelembung udara yang terbentuk di dekat spesimen, ketika meneteskan Entelan, Pemberian Etiket / Labelling Tujuan : memudahkan dalam penyimpanan maupun pengambilan Letak label di sebelah kiri Isi : * Divisi – marga * Bidang irisan * Pewarnaan * Nama pemroduksi ( orang, instansi, perusahaan ). Cara pelabelan Contoh alat untuk mengamati hasil mikroteknik ( mikroskop ) Contoh alat untuk mengamati hasil mikroteknik ( mikroproyektor ) Contoh – contoh hasil mikroteknik Contoh daun Hidrofit Contoh Sistolit dan Litokis pada daun Contoh serabut pada penampang melintang dan membujur Perkembangan Embryo Capsella Perkembangan daun rumput Peristiwa plasmolisis pada preparat segar



7