SPEKTROFLUOROMETRI [PDF]

Citation preview

ANALISIS SEDIAAN FARMASI DENGAN METODE SPEKTROFLUOROMETRI NIA KRISTININGRUM, M.Farm., Apt.



PENDAHULUAN Penyerapan energi oleh molekul



EKSITASI



FOTOLUMINESENSI FLUORESENSI FOSFORESENSI



Tingkat energi molekuler terkait dengan peristiwa Fluoresensi dan Fosforesensi



Keadaan elektron dalam keadaan dasar, tereksitasi singlet dan tereksitasi triplet



Hubungan antara Intensitas fluoresensi dan konsentrasi



Intensitas fluoresensi dapat dijelaskan dari hukum Lambert-Beer :



A=abc



dimana: A = absorbansi a = konstanta disebut absortivitas b = tebal larutan c = konsentrasi larutan



Intensitas fluoresensi (F) sebanding dengan banyaknya sinar yang diserap oleh molekul analit.



F = (Io –It) Φ Io-It merupakan banyaknya sinar yang diserap Φ merupakan efisiensi kuantum atau hasil kali kuantum ( fraksi atau bagian molekul-molekul tereksitasi yang berelaksasi ke keadaan dasar melalui fluoresensi. Φ spesifik seperti absorptivitas.



Intensitas Fluoresensi dipengaruhi oleh :  konsentrasi analit



 efisiensi kuantum  intensitas



sumber sinar radiasi mengenai molekul sampel  absorptivitas analit



yang



FAKTOR YANG MEMPENGARUHI FLUORESENSI  SUHU  PELARUT



 pH  OKSIGEN TERLARUT  KEKAKUAN STRUKTUR



SUHU Kenaikan suhu



Tabrakan antar molekul atau dengan molekul pelarut



Kelebihan energi molekul yg tereksitasi dilepaskan ke molekul pelarut



Efisiensi Fluoresensi berkurang



Konversi keluar



PELARUT Intensitas fluoresensi makin besar jika pelarut makin polar. Semakin polar pelarut akan menurunkan energi proses transisi π→π* sehingga energi transisi ini lebih kecil dibandingkan energi transisi n→π* akibatnya intensitas fluoresensi semakin besar.



Jika pelarut mengandung atom-atom yang berat (Br, I, dll) maka interaksi antara gerakan spin dengan gerakan orbital elektron-elektron ikatan lebih banyak terjadi sehingga akan memperbesar laju lintasan antar sistem atau mempermudah pembentukan triplet dan kebolehjadian fluoresensi lebih kecil serta kebolehjadian fosforesensi menjadi lebih besar.



pH pH berpengaruh pada letak keseimbangan antara bentuk terionisasi dan bentuk tak terionisasi. Sifat fluoresensi dari kedua bentuk itu berbeda. Contoh:  Fenol dalam suasana asam akan berada dalam bentuk molekul utuh dengan λ antara 285-365 nm, ε=18 M-1cm-1. Dalam suasana basa fenol akan terionisasi membentuk ion fenolat dengan λ antara 310-400 nm, ε=10 M-1cm-1 Anilin yang bersifat basa lemah dalam larutan basa berada dalam bentuk molekul utuh dan dalam larutan asam mengalami protonasi sehingga tidak memiliki auksokrom.



OKSIGEN TERLARUT Intensitas fluoresensi akan diperkecil jika ada gas oksigen. Ini terjadi karena adanya proses oksidasi yang timbul yang disebabkan oleh pengaruh cahaya (fotochemically induced oxidation). Pengurangan intensitas fluoresensi disebut pemadaman sendiri (quenching). Molekul oksigen bersifat paramagnetik yang dapat mempengaruhi dan mempermudah lintasan antar sistem sehingga kecil kemungkinan fluoresensi dan besar keboleh jadian fosforesensi.



KEKAKUAN STRUKTUR Fluoresensi dapat terjadi dengan baik jika molekul-molekul memiliki struktur yang kaku (rigid) Contoh: fluoren dan bifenil berbeda pada adanya gugus metilen yang menghubungkan dua gugus fenil (pada fluoren) sehingga fluoren memiliki efisiensi kuantum yang besar mendekati 1 dibandingkan dengan bifenil dengan efisiensi kuantum yang lebih kecil (sekitar 0,2).



Fluoren



Bifenil



SENYAWA YANG BERFLUORESENSI Senyawa yang berfluoresensi umumnya



mempunyai gugus aromatis dengan energi yang rendah Kebanyakan hidrokarbon aromatis yang tidak tersubstitusi dapat berfluoresensi  fluoresensi meningkat dg meningkatnya jumlah cincin dan derajat kondensasi EDG (OH-, -NH2, OCH3) yang terikat pada sistem  dapatmenaikkan intensitas fluoresensi



Sampel cell Excitation filter Light source



Excitation (prymary) filter



Transmitted Light



Fluorecent (emitted) light Fluorecence (secondary) filter



Phototube Photomultiplier tube



Komponen-Komponen Spektrofluorometer



Spektrofotometer



Dari gambar dapat dilihat bahwa komponen spektrofluorometer hampir sama dengan komponen spektrofotometer. Perbedaan antara keduanya yakni Spektrofluorometer memiliki dua monokromator dimana salah satu digunakan untuk panjang gelombang eksitasi dan yang lainnya digunakan untuk panjang gelombang emisi.



Komponen Utama Spektrofluoresen 1) Source of light 2) Excitation filter 3) Sample holder 4) Emission filter 5) Detector



Source of light Two types of light sources: • Xenon lamp: nyala lampu terjadi karen ionisasi gas Xe dengan tegangan tinggi, kemudian arus dan tegangan dipertahankan 7,5A, 20 V(750W). Nyala lampu mencakup panjang gelombang UVVis. • Lampu Merkuri: Intensitas cahaya ini terkonsentrasi pada 254 dan 365 nm yang bermanfaat sebagai radiasi eksitasi.



Excitation- and emission filter 1.The simplest filter fluorimeters use fixed filters to isolate both the excited and emitted wavelengths. 2.More sophisticated fluorescence spectro meteres use monochromators to select both the excitation and emission wavelengths. 3.Hence both emission and excitation spectra can be recorded.



Detectors All commercial fluorescence instruments use photomultiplier tubes as detectors and a wide variety of types are available.



Sample and sample holder



1.The majority of fluorescence assays are carried out in solution. 2.The final measurement being made upon the sample contained in a cuvette



Information obatained from measurements 1.Emission and excitation spectra 2.Concetration (at low concentrations the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorophore)



KEUNTUNGAN METODE SPEKTROFLUOROMETRI  SENSITIF  SPESIFIK  RENTANG KONSENTRASI YANG LEBAR  SEDERHANA DAN CEPAT  MURAH



Keuntungan dari analisis fluoresensi Kepekaan yang baik karena : 1. Intensitas dapat diperbesar dengan menggunakan sumber eksitasi yang tepat 2. Detektor yang digunakan sangat peka 3. Pengukuran energi emisi lebih tepat daripada energi terabsorbsi 4. Limit deteksi rendah



kelompok analisis obat secara fluoresensi  Obat yang mempunyai sifat fluoresensi



alamiah dalam hal ini tidak diperlukan tambahan pereaksi  Contoh : Quinine  Larutan obat ini mengabsorbsi sinar UV dan mengemisi sinar Vis



kelompok analisis obat secara fluoresensi  Turunan obat yang dibentuk dengan pengikatan



dengan senyawa berfluoresensi  Contoh : Asam amino diikat oleh syclorida [ 5 – (dimethylamino) naphtalene-1-sulfonyl-chloride]  dansyl asam amino yang intensitas fluoresensinya tinggi



kelompok analisis obat secara fluoresensi  Vitamin B1 dalam sediaan Farmasi atau makanandapat ditetapkan



secara spektrofluorimetri setelah dioksidasi menjadi tiokrom yang mudah berfluoresensi



H3C



H3C



Metode spektrofluorometri  Spektrofotometri fluoresensi merupakan suatu proseduryang



menggunakan pengukuran intensitas cahaya fluoresensi yang dipancarkan oleh zat uji dibandingkan dengan yang dipancarkan oleh suatu baku tertentu.  Pada umumnya cahaya yang diemisikan oleh larutan berfluoresensi mempunyai intensitas maksimum pada panjang gelombang yang biasanya 20 nm hingga 30 nm lebih panjang dari panjang gelombang radiasi eksitasi(gelombang pita penyerapan sinar yang membangkitkannya).



TAHAPAN ANALISIS PREPARASI SAMPEL



HITUNG KADAR DALAM SAMPEL



TENTUKAN  EKSITASI DAN  EMISI



BUAT KURVA BAKU



Preparasi sediaan obat Sampel tablet yang akan dianalisis harus representatif, Contoh : Menurut Farmakope, untuk analisis tablet parasetamol dibutuhkan sampel sebanyak 20 tablet parasetamol 500 mg 2. Sediaan cair : dapat dilakukan pengukuran secara langsung, atau diencerkan atau dipekatkan terlebih dahulu dengan pelarut organik 3. Sediaan steril (injeksi) : dapat dilakukan pengukuran secara langsung 4. Sediaan semi padat Isolasi obat dalam salep harus ditunjukkan pada dasar salepnya : a. Salep lemak bulu domba alkohol, salep hidrofil, salep lanolin biasanya dilarutkan dalam kloroform atau eter b Salep Polietilen glikol, dilarutkan dalam etanol atau air 1.



PERHATIAN Pada prinsipnya, semua pengukuran dengan menggunakan instrumen spektroskopi, maka syarat pertama adalah harus larut dalam larutan pembawa yang digunakan Untuk sediaan obat multikomponen, maka instrumen spektroskopi harus dapat membedakan masing-masing komponen tersebut, berdasarkan nilai panjang gelombang



Pada larutan dengan konsentrasi tinggi,sebagian besar cahaya diserap lapisan larutan yang paling dulu kontak dengan radiasi eksitasi, sehingga fluoresensi hanya terjadi pada bagian yang menyerap cahaya tersebut. Dengan demikian, pada analisis kuantitatif harus digunakan larutan yang encer (serapan tidak lebih dari 0,02) supaya dapat memenuhi persamaan fluoresensi



MENENTUKAN  EKSITASI DAN  EMISI  Lar. cuplikan masukkan kedalam kuvet spektrofotometer  Atur monokromator eksitasi pada suatu  didaerah u.v.



(misal A). Kemudian monokromator emisi diputar sampai diperoleh intensitas yang maksimal misal B nm (B :  emisi)  Atur monokromator, emisi pada B nm dan sekarang monokromator eksitasi yang diubah sampai diperoleh intensitas yang maksimum misal A’ nm (A’ nm =  eksitasi)  Monokromator eksitasi diatur pada A’ nm dan buat spektra emisi dengan merecord intensitas sebagai fungsi dari panjang gelombang () akan diperoleh harga  yang mempunyai intensitas maksimal misal : B’ nm Maka  eksitasi : A’ nm  emisi : B’ nm



Latihan Soal  Dilakukan analisis ibuprofen dalam sediaan sirup. Data larutan



standar yang diperoleh adalah sebagai berikut : Intensitas Standar 0,2 ppm



18,428



Standar 0,4 ppm



32,257



Standar 0,6 ppm



34,166



Standar 0,8 ppm



43,496



Standar 1,0 ppm



52,185



Sampel



49,637



Preparasi sampel : dipipet sirup ibuprofen sebanyak 1 ml kemudian dilarutkan dalam NH4OH 0,2 M sampai volume 100ml. Kemudian larutan tersebut dipipet sebanyak 1 ml dan diencerkan sampai volume 250 ml.



 Berapakah persen akurasi ibuprofen dalam



sediaan sirup jika dalam label tertulis kandungan ibuprofen 120 mg/5 ml



Latihan Soal  Suatu senyawa griseofulvin standar disiapkan pada pH 7,



intensitas fluoresensinya diukur pada λ eksitasi dan emisi masing-masing pada 295 nm dan 450 nm serta memberikan data sebagai berikut : Konsentrasi (ng/mL) Intensitas fluoresensi



10 20



20 42,5



30 64,5



40 85



Preparasi sampel : ditimbang sampel sejumlah 35,96 mg kemudian dilarutkan sampai volume 100 ml, kemudian diambil 1 ml larutan tersebut dan diencerkan sampai 100 ml. Setelah itu diambil lagi larutan terakhir sebanyak 1 ml dan diencerkan lagi sampai 100 ml.



a. Berapa kandungan griseofulvin dalam



tablet jika diketahui intensitas fluoresensi sampel sebesar 64 dan bobot rata-rata tablet 310 mg ? b. Berapa persen akurasi kadarnya jika di kemasan tertulis setiap tablet mengandung 250 mg griseofulvin ?