SPEKTROFLUOROMETRI [PDF]

Citation preview

SPEKTROFLUOROMETRI KRISNA KHARISMA P., M.Sc., Apt. ANALISIS SEDIAAN FARMASI INSTITUT ILMU KESEHATAN BHAKTI WIYATA KEDIRI



Prinsip :



Molekul yang mempunyai kromofor dan struktur yang rigid dapat dieksitasi oleh REM uv-vis, dan akan mengemisikan REM yang diabsorpsi pada λ yang lebih panjang. Radiasi yang diemisikan ini yang diukur intensitasnya



Penggunaan :



- Penentuan kadar zat yang dapat berfluoresensi dalam pembawa/matrik yang tidak berfluoresensi - Uji batas impurities yang dapat berfluoresensi - Mempelajari ikatan senyawa dalam reaksi yang rumit/kompleks - Mempelajari drug-protein binding (bioanalisis)



Laju dissolusi digoxin tablet (0,25 mg/tablet) : digoxin diderivatisasi Uji batas : Al sebagai garam dengan 8 hidroksi quinoline dalam air untuk hemodialisis



Gambar 2. Bagan fluorometer



Bioluminesensi



Kemiluminesensi Luminol



Larutan Oksigen



Forensik : luminol + Fe dalam hemoglobin



Luminol +



2 H2O2



O2 + 2 H2O



Fe sebagai katalis Luminol teroksidasi + hv



Fotoluminesensi



JENIS FOTOLUMINESENSI



Radiasi/fluoresensi resonansi



Fluoresensi



Fosforesensi



Pergeseran Stokes



TERJADINYA LUMINESENSI PADA ANTRASEN S0 +



UV 255 nm



S0



UV 325 - 375 nm



+



S2



(1) S2



(1)



Keduanya berfluoresensi pd 380, 402 dan 425 nm, berfosforesensi pada 680 nm



DEAKTIVASI 1. Konversi internal - relaksasi vibrasional 2. Emisi fluoresensi 3. Intersystem crossing 4. Kuensing tumbukan 5. Emisi fosforesensi



=h =



E VR



S2



h 



IC VR



S1



Transisi S0 → S2



ISC



T1



VR



Transisi S0 → S1



F



O2 - Q



So



FF IC



255



350



Keduanya berfluoresensi pd 380, 402 dan 425 nm, berfofosresensi pada 680 nm Gambar 1 Diagram transisi energi molekul antrasen



F = kf Po(1-e-bc)



kf Po(2,3 bc) foton terukur



k= foton emisi f = efisiensi kuantum dari fluoresensi emisi foton /detik f = foton terserap/detik Po = kekuatan radian dari radiasi eksitan , = serapan molekuler, tergantung pada jenis analit b = tebal kuvet c = kadar analit



Variable yang berpengaruh pada luminesensi k karena emisi kesemua arah yang masuk dtektor satu arah



Detektor photomultiplier



EFISIENSI KUANTUM



f



 Jenis transisi oleh gugus fungsi, n, * atau , * efisiensi kuantum , * > n, * Intensitas fluoresensi relatif Jenis transisi gugus fungsi Benzena



10



-



Anilina



20



, *



Asam benzoat



3



n, *



 Kekakuan struktur 



Fluorena



>



Bifenil



Gambar 3. Sumber eksitasi Po A lampu Hg, Lampu Hg + P, Lampu Xenon



Pengaruh Suhu dan pelarut Peningkatan suhu, Penurunan kekentalan larutan, solv ent atau solut yang mengandung atom berat, (CCl4, etil-iodida menurunkan efisiensi kuantum,



( karena meningkatkan frekuensi tumbukan → memudahkan konv ersi eksternal)



Pengaruh pH terutama untuk senyawa berfluoresensi yang mempunyai gugus asam atau basa, karena intensitas dan panjang gelombang emisi bentuk ion berbeda dengan bentuk non-ion. Misalnya asam 1-naftil-4-sulfonat hanya terlihat dengan mata kalau dalam bentuk ion setelah penambahan basa



Oksigen terlarut,



menyebabkan peredupan fluoresensi



( IC dan konversi kepada triplet state)



Kadar senyawa, bila kadar senyawa besar (A>0,05), kurva



baku tidak linier lagi



Logam berat menyebabkan peredupan fluoresensi



Franck and Condon state, akibat eksitasi terlalu kuat sehingga mengantarkan pada kedudukan di atas S2. Pada lev el ini tidak akan terjadi fluoresensi, karena tidak terjadi relaksasi yang mengantarkan ke kedudukan singlet tereksitasi



KOMPONEN INSTRUMEN FLUORESENSI DAN FOSFORESENSI – SUMBER EKSITASI Lampu pijar merkuri Lampu xenon



Lampu Hg + P



Lampu D2



– MONOKROMATOR Filter Grating



→ FLUOROMETER → SPEKTROFLUOROMETER



– SEL SAMPEL Kuvet fluorometer Kuvet putar + labu Dewar



– DETEKTOR fotomultipler



→ FOSFORIMETER fotodioda



FILTER PLASTIK 7-54



Gambar 4. Daerah tapis filter



Gambar 5 Sel wadah fosforimeter



PENGGUNAAN FLUOROMETER  Analisis kuantitatif senyawa berpendar  Analisis kuantitatif senyawa berpendar pasca derivatisasi  Teknik analisis campuran A menyerap UV, B tidak menyerap A dan B menyerap UV, tetapi serapan B efisiensi B