10 Uji Sitotoksik Metode MTT [PDF]

Citation preview

Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC), Fakultas Farmasi, UGM 2008    UJI SITOTOKSIK METODE MTT



Alat: 1. 2. 3. 4. 5.



Mikropipet 20, 200, 1000 µl Tabung reaksi kecil Rak tabung kecil Vortex Conical tube



Bahan: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.



Stok sampel (10 mg) dalam eppendorf DMSO MK PBS 96-well plate Tisu makan (kotak) Buangan untuk media bekas dan PBS



Langkah



Pekerjaan



1.



Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel. Gunakan kultur sel dalam kondisi 80% konfluen untuk dipanen.



2.



Panen sel sesuai dengan protokol panen.



3.



Hitung jumlah sel dan buat pengenceran sel dengan MK sesuai kebutuhan mengikuti protokol penghitungan sel.



4.



Transfer sel ke dalam sumuran, masing-masing 100 µl. Setiap kali mengisi 12 sumuran, resuspensi kembali sel agar tetap homogen.



5.



Sisakan 3 sumuran kosong (jangan diisi sel).



6.



Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Dokumentasikan.



7.



Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam (agar sel pulih kembali setelah panen).



8.



Perlakuan sel dengan sampel dilakukan setelah sel kembali dalam keadaan normal. Jika dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, inkubasikan kembali. Selalu amati kondisi sel sebelum perlakuan.



9.



Setelah sel normal kembali, segera buat seri konsentrasi sampel untuk perlakuan (termasuk kontrol sel dan kontrol DMSO)1 sesuai dengan protokol preparasi sampel (protokol 9).



1



 



Protokol in vitro – Uji Sitotoksisitas 



Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC), Fakultas Farmasi, UGM 2008    10.



Ambil plate yang telah berisi sel dari inkubator.



11.



Buang media sel (balikkan plate 180° di atas tempat buangan, kemudian tekan plate secara perlahan di atas tisu makan untuk meniriskan sisa cairan)



12.



Masukkan 100 µl PBS ke dalam semua sumuran yang terisi sel, kemudian buang PBS dengan cara membalik plate seperti no. 10. Tiriskan sisa cairan dengan tisu.



13.



Masukkan seri konsentrasi sampel ke dalam sumuran (triplo).



14.



Inkubasi di dalam inkubator. Lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan terhadap sel. Jika dalam waktu 24 jam belum terlihat efek sitotoksik, inkubasi kembali selama 24 jam (waktu inkubasi total: 24-48 jam).



15.



Menjelang akhir waktu inkubasi, dokumentasikan kondisi sel untuk setiap perlakuan (foto dahulu).



16.



Buang media sel, cuci PBS 1x (seperti pada no. 11), dan tambahkan reagen MTT 100 µl ke setiap sumuran, termasuk kontrol media (tanpa sel)2. Inkubasi sel selama 2-4 jam di dalam inkubator (sampai terbentuk formazan).



17.



Periksa kondisi sel dengan mikroskop inverted. Jika formazan telah jelas terbentuk, tambahkan stopper SDS 10% dalam 0,1 N HCl. Pekerjaan tidak perlu dilakukan di dalam LAF hood.



18.



Bungkus plate dengan kertas atau alumunium foil dan inkubasikan di tempat gelap (suhu ruangan) semalam (jangan diletakkan di inkubator!).



19.



Hidupkan ELISA reader, tunggu proses progressing hingga selesai.



20.



Buka pembungkus plate dan tutup plate. Masukkan ke dalam ELISA reader (posisi jangan terbalik). Baca absorbansi masing-masing sumuran dengan ELISA reader dengan λ=550-600 nm (595 nm, tekan tombol START).



21.



Matikan kembali ELISA reader. Simpan dan temple kertas hasil ELISA pada LOG BOOK. Setiap kali pembacaan di ELISA reader, catat di buku catatan pemakaian ELISA READER.



22.



Buat grafik absorbansi (setelah dikurangi kontrol media) vs konsentrasi (jangan di-logkan) untuk melihat profil sel hidup. Hitung prosentase sel hidup3 dan analisis harga IC50 dengan Excell (Regresi linear dari log konsentrasi) atau SPSS (Probit/Logit).



2



 



Protokol in vitro – Uji Sitotoksisitas 



Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC), Fakultas Farmasi, UGM 2008    Keterangan: 1. Kontrol negatif = sel + media. Kontrol DMSO = sel + % terbesar DMSO yang digunakan dalam MK. % DMSO terbesar dilihat dari konsentrasi DMSO dalam seri konsentrasi sampel yang paling pekat. 2. Stok MTT (5mg/ml) Æ timbang 50 mg sebuk MTT, larutkan dalam 10 ml PBS (dengan bantuan vortex). Reagen MTT untuk perlakuan (0,5 mg/ml) Æ ambil 1 ml stok MTT dalam PBS (5mg/ml), encerkan dengan MK ad 10 ml (untuk 1 buah 96 well plate). Gunakan sarung tangan! (MTT – karsinogenik). 3. Prosentase sel hidup =



(Absorbansi perlakuan – Absorbansi kontrol media) (Absorbansi kontrol negatif – Absorbansi kontrol media)



 



3



 



Protokol in vitro – Uji Sitotoksisitas 



x 100%