#4 Pewarnaan Dalam Mikroteknik [PDF]

Citation preview

9/28/2018



Pewarnaan
Tujuan dari tahapan pewarnaan dalam mikroteknik, ialah :



1. Supaya unsur-unsur dalam jaringan tampak jelas, dan dapat dibedakan bagian-bagiannya di bawah mikroskop 2. Mempertajam atau memperjelas berbagai elemen tissue, terutama sel-selnya, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop.
Pewarna yang sering digunakan: Hemaktosilin-Eosin (HE)



1



9/28/2018



JENIS-JENIS PEWARNAAN HISTOKIMIA Pewarnaan hitokimia dikenal beberapa jenis teknik pewarnaan, diantaranya : 1. Hematoxcillin-Eosin (HE) yang berfungsi untuk memberi gambaran umum suatu jaringan. 2. AB (Alcian Blue) yang biasanya digunakan pada sampel yang memiliki pH 2,5 dan mampu mendeteksi mukopolisakarida asam dan biasanya memberikan warna biru.



Lanjutan.... 3. PAS (Periodic Acid Schiff) digunakan untuk mendeteksi adanya kandungan mukopolisakarida netral pada suatu jaringan dan akan memberikan warna magenta. 4. Lektin digunakan untuk mendeteksi adanya kandungan residu gula dan zat kompleks lain dalam suatu jaringan.



2



9/28/2018



Tahapan Pewarnaan HE 1. Sampel dicuci dengan NaCl fisiologis kemudian dimasukkan ke dalam larutan Bouin's 24 jam. 2. Dehidrasi I. Sediaan dimasukkan dalam larutan alkohol bertingkat masing-masing selama 24 jam, alkohol 100% 3 X @ 6-8 jam 3. Clearing. Direndam dalam dan xylol I selama 1 jam, kemudian dimasukkan ke xylol II 1 jam. Lalu dimasukkan ke xylol III 30 menit pad a suhu ruang dan 30 menit pada inkubator. Infiltrasi parafin 3 x @ 1 jam pada suhu 56-60°C 4. Embedding. Sediaan dimasukkan dalam alat pencetak parafin yang berisi parafin cair sampai setengah volume, posisi sampel jaringan diatur di tengah, kemudian parafin cair ditambah sampai penuh. 5. Pemotongan dan affixing. Menggunakan mikrotom dengan ketebalan 4 – 6 µm. Hasil potongan diletakkan diatas gelas obyek kemudian dipanaskan pada papan pemanas sampai sediaan kering.



LANJUTAN PEWARNAAN HE 6. Deparafinisasi dan rehidrasi. Sediaan dimasukkan ke dalam Xylol 3 x @ 2 menit kemudian direhidrasi dengan merendam dalam alkohol bertingkat selama 2 menit, dibilas dengan aquades selama 10-15 menit. 7. Pewarnaan. Dengan Hematoksilin 15 detik kemudian dibilas dengan air kemudian pewarnaan dalam eosin selama 15 menit dan dibilas dengan air. 8. Dehidrasi II. Sediaan dimasukkan ke dalam alkohol bertingkat masing2 selama beberapa menit, dan dimasukkan dalam alkohol 100% 3 x @ beberapa menit. 9. Clearing. Sediaan dimasukkan ke dalam Xylol selama beberapa menit sebanyak 3 kali. 10. Penutupan. Penutupan dengan Entelan atau Canada Balsam, dan gelas penutup. Dikeringkan dan diberi label.



3



9/28/2018



HASIL PEWARNAAN Hematoksilin-Eosin (HE)




Gambar Auricula (Organ Indra Khusus)
Sumber : Husna, 2011



TAHAPAN PEWARNAAN AB (Alcian Blue) 1. Deparafinisasi dan rehidrasi sediaan dalam larutan Xylol dan alkohol bertingkat masing-masing selama 3-5 men it, kemudian dilanjutkan pencucian dalam air mengalir selama 10 menit. 2. Penurunan pH dengan 3 % asam asetat selama 5 menit dalam suhu ruang. 3. Perendaman dalam AB pH 2.5 selama 30 menit. 4. Pencucian dengan 3 % asam asetat selama 5 menit sebanyak 3 kali dalam suhu ruang. 5. Pencucian dengan aquades selama 5 menit sebanyak 3 kali.



4



9/28/2018



Lanjutan.... 6. Counterstain (nuclear fast red), yang kemudian dicek dengan mikroskop. 7. Pencucian dengan aquades selama 5 menit sebanyak 3 kali. 8. Pencucian dengan air mengalir 10-60 menit. 9. Pencucian dengan aquades selama 5 menit sebanyak 2 kali. 10. Dehidrasi dan penjernihan dalam larutan Xylol dan penutupan sediaan dengan gelas penutup.



HASIL PEWARNAAN AB Fotomikrograf sebaran dan konsentrasi/kandungan kualitatif karbohidrat pada kelenjar Mandibularis (A)Ayam (C) Burung Puyuh Sumber : Adnyane, et al., 2007



5



9/28/2018



TAHAPAN PEWARNAAN PAS (Periodic Acid Schiff) 1. Deparafinisasi dan rehidrasi sediaan dalam larutan Xylol dan alkohol bertingkat masing-masing selama 3-5 menit, kemudian dilanjutkan pencucian dalam air mengalir selama 10 menit. 2. Dioksidasi dalam asam periodat 1% selama 5-10 menit. 3. Pencucian dengan aquades 3 kali, masing-masing selama 5 menit. 4. Pewarnaan digunakan larutan Reagent Schiff selama 15-30 menit. 5. Pencucian dengan air sulfit yang selalu fresh (dibuat baru) 3 x 3 menit



Lanjutan.... 6. Pencucian dengan aquades selama 5 menit sebanyak 3 kali. 7. Counterstain dengan hematoksilin, cek dengan mikroskop. 8. Pencucian dengan air mengalir 10-60 menit. 9. Pencucian dengan aquades selama 5 menit sebanyak 2 kali. 10. Dehidrasi dan penjernihan dalam larutan Xylol dan penutupan sediaan dengan gelas penutup.



6



9/28/2018



HASIL PEWARNAAN PAS Fotomikrograf sebaran dan konsentrasi/kandungan kualitatif karbohidrat pada kelenjar Mandibularis (B) Ayam (D) burung puyuh Sumber : Adnyane,IKM dkk., 2007



TAHAPAN PEWARNAAN Lektin 1. Deparafinisasi dan rehidrasi sediaan dalam larutan Xylol dan alkohol bertingkat masing-masing selama 3-5 men it, kemudian dilanjutkan pencucian dalam air mengalir selama 10 menit. 2. Sediaan dimasukkan dalam hidrogen peroksida (H2O2) 1 % dalam Phosfat Buffer Saline (PBS) selama 15 menit. 3. Pencucian dengan air mengalir selama 10 menit, dilanjutkan dengan larutan PBS 0.01 M selama 5 menit sebanyak 3 kali. 4. Pencucian dengan PBS sebanyak 3 kali, masing-masing 5 menit. 5. Inkubasi dengan lektin selama 2 jam dalam inkubator 37"C. 6. Pencucian dengan PBS sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit.



7



9/28/2018



Lanjutan.... 7. Visualisasi dengan 0.05 % DAB (Diaminobenzidine) dan 0.1% hidrogen peroksida (H202) pada buffer tris 0.05 M, pH 7.6 selama 10-20 menit di tempat gelap. 8. Pencucian dengan larutan PBS selama 5 menit sebanyak 3 kali. 9. Pewarnaan kontras dengan Hematoksilin, beberapa detik. 10. Pencucian dengan air mengalir selama 30 menit. 11. Dehidrasi dengan alkohol bertingkat, penjernihan dengan menggunakan Xylol dan penutupan dengan gelas penutup.



HASIL PEWARNAAN Lektin



Sumber : Rahmi dkk., 2009



8



9/28/2018



9