Bilirubin Total Dan Bilirubin Direct [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA KLINIK (BILIRUBIN TOTAL DAN BILIRUBIN DIRECT)



OLEH: GOLONGAN 1 KELOMPOK 6A MADE DION ABIMANYU



(1608551036)



NI PUTU DIAH KUSUMA DEWI



(1608551037)



NI KOMANG AYU MEIANTARI



(1608551038)



NI KADEK SRIANI



(1608551039)



ALFRED SILVESTER SERAN NAHAK



(1608551040)



I GUSTI AGUNG GDE CAHYA ADHI P.



(1608551041)



PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA 2019



(BILIRUBIN TOTAL DAN BILIRUBIN DIRECT)



I.



TUJUAN



1.1



Tujuan Instruksional Umum Mahasiswa dapat mengetahui cara pemeriksaan kadar Bilirubin Total dan kadar Bilirubin Direct dalam serum.



1.2



Tujuan Instruksional Khusus a. Mahasiwa dapat melakukan pemeriksaan kadar Bilirubin Total dan kadar Bilirubin Direct dalam serum menggunakan reagen Glory® Diagnostics. b. Mahasiswa dapat mengetahui kadar Bilirubin Total dan kadar Bilirubin Direct dalam sampel patologis. c. Mahasiswa dapat menginterpretasikan hasil pemeriksaan.



II.



TINJAUAN PUSTAKA



2.1



Bilirubin dan Pemeriksaan Bilirubin Total Metode Kolorimetri Bilirubin adalah produk dari eritrosit yang rusak atau dari atabolisme heme



dari semua hemeprotein terjadi dalam fraksi mikrosom sel retikuloendotel oleh sistem enzym yang kompleks yaitu heme oksigenase. Bilirubin yang terkonjugasi akan dengan cepat bereaksi dengan asam sulfanil yang terdiazotasi membentuk azobilirubin atau bilirubin langsung (direct bilirubin). Bilirubin tak terkonjugasi ini diikat oleh albumin dan protein lain, kemudian beredar melalui peredaran darah. Setibanya di dalam hepar, bilirubin tak terkonjugasi dilepas oleh hepar dari albumin, kemudian digabung dengan glukoronid sehingga dapat melarut dalam air dan disebut bilirubin terkonjugasi (Baradero et. al.,2008). Bilirubin diubah menjadi azobilirubin yang berwarna diazotized sulfanilic acid yang dapat terukur secara fotometri. Dari dua fraksi bilirubin dalam serumbilirubin-glucoronide dan bilirubin bebas yang berikatan dengan albumin, hanya bilirubin-glucoronide yang bereaksi secara langsung setelah reaksi pertukaran dari protein dengan bantuan accelerator. Perbedaan dari 2 pengukuran bilirubin total (dengan accelerator) dan bilirubin direct (tanpa accelerator) memungkinkan perhitungan bilirubin indirect.



1



Pemeruksaan kadar bilirubin total dan bilirubin direct dengan metode kolortimetri dapat menggunakan kalkulasi sebagai berikut.



Sampel dengan konsentrasi lebih dari 20 mg/dL sebaiknya diencerkan dengan larutan normal saline 1 : 2. Hasil yang diperoleh dikalikan 2. 2.2



Bilirubin Direct dan Pemeriksaan Bilirubin Direct Metode Kolorimetri Bilirubin direct adalah bilirubin yang di transport ke liver dimana bilirubin



direct ini merupakan bilirubin yang melekat pada albumin. Bilirubin direct yang terikat pada albumin tidak larut dalam air, karenanya tidak didapat di urin. Nilai normal bilirubin direct ini adalah 0,1-0,4 g/dt. Bilirubin direct juga merupakan bilirubin yang telah terkonjugasi dengan asam glukoronat di dalam hati sehingga bilirubin direct ini larut dalam air, tidak larut dalam alkohol, tidak terikat oleh protein, mewarnai jaringan, dengan reagen azo langsung bereaksi, tanpa accelator, dapat ditemkan dalam urin, bilirubin yang terkojugasi. Bilirubin direct adalah bilirubin bebas yang bersifat larut dalam air sehingga dalam pemeriksaan mudah bereaksi. Bilirubin terkonjugasi (bilirubin glukoronida atau hepatobilirubin) masuk ke saluran empedu dan diekskresikan ke usus. Selanjutnya flora usus akan mengubahnya menjadi urobilinogen. Bilirubin terkonjugasi bereaksi cepat dengan asam sulfanilat yang terdiazotasi membentuk azobilirubin. Peningkatan kadar bilirubin direct atau bilirubin terkonjugasi dapat disebabkan oleh gangguan ekskresi bilirubin intrahepatik antara lain Sindroma Dubin Johson dan Rotor, Recurrent (benign) intrahepatic cholestasis, Nekrosis hepatoseluler, Obstruksi saluran empedu. Diagnosis tersebut diperkuat dengan pemeriksaan urobilin dalam tinja dan urin dengan hasil negative Prinsip bilirubin direct adalah bilirubin direct dihdapkan pada bentuk diazotisasi 2,4 dicloroaniline membentuk warna merah yang bercampur dalam asam sedangkan bilirubin total yaitu dihadapkan bentuk diazotasi 2,4 diklroaniline menyediakan penentuan yang aman dari bilirubin total (Hartanto, 2004). III. ALAT DAN BAHAN 3.1



Alat



2



a. Yellow tip b. Blue tip c. Mikropipet d. Spektrofotometer e. Stopwatch f. Tabung reaksi 3 ml g. Beaker glass 3.2



Bahan a. Aquades b. Reagen RT tdd: Sulfanilic Acid 29 mmol/L, hydrochloric acid 0.24 mol/L, Duposol® 3% (w/v) c. Reagen RD tdd: Sulfanilic Acid 29 mmol/L, hydrochloric acid 0.24 mol/L d. Reagen RN tdd: Sodium Nitrite 11.6 mmol/L e. Pemeriksaan Bilirubin Total Metode Kolorimetri: ˗



Kalibrasi/ Standar/ CAL: Serum ID 110 (0,25 mg/dL)



˗



Sampel serum ID 224 (Laki-laki, 77 tahun)



f. Pemeriksaan Bilirubin Direct Metode Kolorimetri: ˗



Kalibrasi/ Standar/ CAL: Serum ID 191 (0,16 mg/dL)



˗



Sampel serum ID 121 (Perempuan, 4 tahun)



IV.



CARA KERJA



4.1



Pemeriksaan Bilirubin Total Metode Kolorimetri Siapkan alat dan bahan yang digunakan serta dikondisikan dalam suhu percobaan 37oC.



Siapkan spektrofotometri dengan absorbansi 0 menggunakan aquades.



Siapkan working reagent: Campur 1 ml reagen RN dengan 4 ml reagen RD.



3



Siapkan Standar/ Kalibrasi: Rekonstitusi vial dengan menambahkan secara tepat 1.0 ml aqua destilasi. Homogenkan campuran dan biarkan selama 5 – 10 menit sebelum dipergunakan.



Disiapkan 3 buah tabung reaksi yang telah diberi label blanko, standar dan sampel.



Dipipet masing-masing kedalam tabung: Reagen blanko (aquadest 100µL dan working reagen 1 mL), Sampel blanko (Sampel 100 µLdan RD 1 mL), Sampel (sampel 100 µL dan working reagen 1 mL), CAL (CAL 100 µL dan working reagen 1 mL). Campuran dihomogenkan, inkubasi selama 2 menit pada suhu 37oC.



Baca absorbansi sampel blanko terhadap aqua destilasi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.



Baca absorbansi sampel terhadap reagen blanko dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.



Absorbansi dicatat, lalu dihitung kadar Bilirubin Total dalam sampel.



4.2



Pemeriksaan Bilirubin Direct Metode Kolorimetri Siapkan alat dan bahan yang digunakan serta dikondisikan dalam suhu percobaan 37oC.



Siapkan spektrofotometri dengan absorbansi 0 menggunakan aquades.



Siapkan working reagent: Campur 1 ml reagen RN dengan 4 ml reagen RT.



4



Siapkan Standar/ Kalibrasi: Rekonstitusi vial dengan menambahkan secara tepat 1.0 ml aqua destilasi. Homogenkan campuran dan biarkan selama 5 – 10 menit sebelum dipergunakan.



Disiapkan 3 buah tabung reaksi yang telah diberi label blanko, standar dan sampel.



Dipipet masing-masing kedalam tabung: Reagen blanko (aquadest 100µL dan working reagen 1 mL), Sampel blanko (Sampel 100 µLdan RD 1 mL), Sampel (sampel 100 µL dan working reagen 1 mL), CAL (CAL 100 µL dan working reagen 1 mL). Campuran dihomogenkan, inkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC.



Baca absorbansi sampel blanko terhadap aqua destilasi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.



Baca absorbansi sampel terhadap reagen blanko dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.



Absorbansi dicatat, lalu dihitung kadar Bilirubin Direct dalam sampel.



V.



HASIL DAN PENGAMATAN



7.1



Hasil



7.1.1 Pemeriksaan Bilirubin Total Metode Kolorimetri Tabel 7.1. Tabel hasil pemeriksaan bilirubin total. No.



Larutan



Kadar



1.



Sampel blanko



-



2.



CAL (ID 110)



0,25 mg/dL



3.



Sampel (pasien ID 224)



0,664 mg/dL



5



Gambar 7.1. Larutan sampel dalam pemeriksaan bilirubin total.



7.1.2 Pemeriksaan Bilirubin Direct Metode Kolorimetri Tabel 7.2. Tabel hasil pemeriksaan bilirubin direct. No.



Larutan



Kadar



1.



Sampel blanko



-



2.



CAL (ID 191)



0,16 mg/dL



3.



Sampel (pasien ID 121)



0,075 mg/dL



Gambar 7.2. Larutan sampel dalam pemeriksaan kreatinin. 7.2



Kalkulasi



7.2.1 Pemeriksaan Bilirubin Total Diketahui: Hasil pengukuran sebagai berikut.



6



Kadar larutan standar



= 0,25 mg/dL



Absorbansi larutan standar



= 0,038



Absorbansi larutan sampel



= 0,118



Absorbansi sampel blanko



= 0,02



Ditanya: Kadar bilirubin total Jawab: Kadar bilirubin total



-



= =



–



= 0,644 mg/dL Jadi, kadar bilirubin total dalam larutan sampel ID 224 (Laki-laki, 77 tahun) adalah 0,644 mg/dL (normal karena mencapai 1,0 mg/dL). 7.2.2 Pemeriksaan Bilirubin Direct Diketahui: Hasil pengukuran sebagai berikut. Kadar larutan standar



= 0,16 mg/dL



Absorbansi larutan standar



= 0,034



Absorbansi larutan sampel



= 0,035



Absorbansi sampel blanko



= 0,019



Ditanya: Kadar bilirubin direct Jawab: Kadar bilirubin direct



-



= =



–



= 0,075 mg/dL Jadi, kadar bilirubin total dalam larutan sampel ID 121 (Perempuan, 4 tahun) adalah 0,075 mg/dL (normal karena mencapai 0,2 mg/dL).



VI.



PEMBAHASAN Bilirubin merupakan hasil produk utama dari penguraian sel darah merah



yang tua. Bilirubin mengandung bahan pewarna yang dapat memberi warna pada



7



kotoran. Bilirubin total merupakan jumlah bilirubin direk dan bilirubin indirek. Bilirubin dalam sirkulasi umum terdapat bilirubin indirek < 0,75% dan bilirubin direk < 0.25% dengan total bilirubin tidak lebih dari 1 mg% (Zunaidi, 2011), sementara menurut Puppalwar et al (2012) menyatakan bahwa kadar bilirubin total normal pada orang dewasa adalah 0,3-1,2 mg/dL. Pemeriksaan bilirubin total dilaksanakan dengan tujuan untuk mengetahui jumlah total bilirubin dalam darah meliputi bilirubin tak terkonjugasi dan bilirubin yang terkonjugasi dengan protein. Metode pemeriksaan bilirubin diazo method, Vanadate oxidase method, kromatografi, spektrofotometri, elektroforesis, elektrokimia, dan metode enzim. Metode spektrofotometri untuk memeriksa kadar bilirubin memiliki prinsip sebagai reaksi diazo yaitu mengubah bilirubin menjadi azobilirubin yang berwarna merah dengan cara mereaksikan bilirubin dengan sulfanilic acid. Keuntungan metode ini adalah tidak dipengaruhi pH, sensitif terhadap kadar bilirubin yang kecil pada serum, namun tidak sensitif jika dalam sampel memiliki banyak kandungan protein. Bilirubin dengan metode reaksi diazo terdiri atas dua senyawa azo isomerik yang dapat dibaca pada panjang gelombang 454 dan 540 nm (Ngashangva et al., 2019). Berdasarkan hasil praktikum diketahui bahwa absorbansi sampel blanko adalah 0,020, sampel 0,118 dan standar 0,038 dengan konsentrasi standar 0,25 mg/dL, sehingga berdasarkan perhitungan diketahuhi bahwa kadar bilirubin total pada sampel adalah 0,644 mg/dL, diketahui bahwa sampel berasal dari pasien laki-laki berusia 77 tahun sehingga kadar bilirubin total yang diperoleh termasuk dalam kategori normal karena masih berada dibawah 1 mg/dL (Puppalwar et al., 2012). Selanjutnya, dilakukan pemeriksaan bilirubin direct dengan metode kolorimetri. Prinsip dari bilirubin direct ini adalah Bilirubin diubah menjadi azobilirubin yang berwarna oleh diazotized sulfanilic acid yang dapat terukur secara fotometri. Dari dua fraksi bilirubin dalam serum-bilirubin-glucoronide dan bilirubin bebas yang berikatan dengan albumin , hanya bilirubin-glucoronide yang beraksi secara langsung ,sedangkan bilirubin yang berikatan dengan albumin akan bereaksi setelah reaksi pertukaran dari protein dengan bantuan accelerator .Perbedaan dari dua pengukuran bilirubin total(dengan accelator ) dan bilirubin



8



direct (tanpa accelerator) dan bilirubin direct (tanpa accelerator) memungkinkan perhitungan bilirubin indirect. Pada pengujian ini digunakan sampel ID 121. Untuk pengujian bilirubin direct, kedalam tabung reaksi dimasukkan working reagen 1.0 ml.Kemudian pada tabung blanko ditambanhkan 100 µL akuades, tabung standar ditambahkan 100 µL standar dan RD, dan tabung CAL dimasukkan working reagen 1.0 ml dan CAL 191 ditambahkan 100 µL. ketiga tabung diinkubasi selama 5 menit agar reagen bereaksi sempurna dengan analit. Penambahan akuades, standar, dan CAL diusahakan dimasukkan kedalam tabung dalam waktu yang bersamaan, karena waktu inkubasi yang berbeda akan mempengaruhi hasil analisis yang diperoleh karena lamanya reaksi yang terjadi tiap tabung akan berbeda. Keempat larutan dibaca menggunakan panjang gelombang 540 nm Hasil pengukuran diperoleh nilai absorbansi blanko 0 , nilai absorbansi sampel blanko 0,019, nilai absorbansi sampel 0,035 dan absorbansi CAL 0,034.Dimana Hasil sampel ID 121 perempuan umur 4 tahun,yang diperoleh adalah 0,075 mg/dL. Nilai bilirubin direct dari hasil yang didapat dikatakan normal karena mencapai kadar bilirubin direct dewasa yaitu 0,2 mg/dL.



VII. KESIMPULAN Bedasarkan pembahasan di atas, maka dapat disusun kesimpulan sebagai berikut. 7.1



Pemeriksaan kadar bilirubin total dan bilirubin direct dalam serum menggunakan reagen Glory® Diagnostics dilakukan dengan metode metode kolorimetri yang diukur bedasarkan serapannya pada spektrofotometri.



7.2



Bedasarkan pemeriksaan, diperoleh kadar bilirubin total sebesar 0,644 mg/dL; dan kadar bilirubin direct sebesar 0,075 mg/dL.



7.3



Bedasarkan interpretasi, kadar bilirubin total dan bilirubin direct tergolong normal karena masih berada di rentang kadar normal.



9



DAFTAR PUSTAKA Baradero, M., M. W. Dayrit, dan Y Siswadi. 2008. Klien Gangguan Hati: Seri Asuhan Keperawatan. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC. Hartanto, H. 2004. Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Edisi 1. Jakarta: EGC. Ngashangva, L., V. Bachu, P. Goswami. 2019. Development of New Method for Determination of Bilirubin. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 162(2019): 272-285. P



w P. V. K. G w M f E 1(1): 17-28.



. D . . R v w “Ev f ”. Journal of Dental and Medicine Science



Zunaidi. 2011. Pengaruh Penundaan Pemeriksaan Bilirubin Total 1,2, dan 3 Jam. Makassar: Universitas Hasanuddin.