Isolasi Dna Dengan Metode Guanidin [PDF]

Citation preview

I.



Judul



: Pengambilan Spesimen dan Isolasi DNA Mamalia



dengan Metode Guanidin Isotiosianat



II.



Tujuan



: Mahasiswa mengetahui jenis spesimen dan dapat



mengisolasi DNA manusia.



III.



Latar belakang :



DNA ( asam deoksiribonukleat ) merupakan materi genetik dari sebagian besar organisme yang mempunyai fungsi sebagai pembawa sifat keturunan. Setiap kromosom adalah suatu molekul DNA yang sangat panjang. Molekul kimia penyusun DNA dinamakan nukleotida. Satu nukleotida terdiri dari satu molekul gula dan satu molekul fosfat yang terikat pada salah satu basa DNA, yaitu Timin, Adenin, Guanin, dan Sitosin1. Analisa DNA banyak digunakan untuk menentukan karakteristik sifat genetik pada level molekuler yang secara langsung mencerminkan sifat genotip yang dimiliki oleh organisme tertentu. Analisis DNA terdiri dari tiga tahap yaitu ekstraksi / isolasi DNA, PCR, dan elektroforesis. Isolasi DNA adalah suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan 2. Metode – metode yang digunakan dalam ekstraksi DNA adalah fenol : kloroform, salting out, guanidin isotiosianat, dan silika gel. Pada praktikum kali ini menggunakan metode guanidin isotiosianat, metode ini lebih cepat dibanding metode fenol : kloroform dan salting out. Tiosianat yang bersifat toksik berfungsi untuk melisiskan dinding sel, dalam metode ini juga menggunakan kloroform yang berfungsi untuk mendenaturasi protein 3. Manfaat dari isolasi dna ini adalah untuk analisis genetik, skrining diagnosis, monitoring obat, dan forensik4.



Hal 1 dari 8



IV.



Metode A. Bahan yang digunakan 



Darah, spesies Homo sapiens







Red Blood Cell Lysis Buffer ( RBCLB ) pH 7,4 1550 mM



NH4Cl



8,2 gram



100 mM



KCO3



1 gram



10 mM



EDTA



0,37 gram



Aquadest



add 100 mL







Es







SE Buffer pH 8 750 mM



NaCl



4,38 gram



250 mM



EDTA



9,30 gram



Aquadest



add 100 mL







Guanidin isotiosianat 4M







Kloroform







NaCl 6M







Etanol absolut







Etanol 70%







TE Buffer Tris – HCl



10 mM



EDTA



1 mM



pH 8



B. Alat yang digunakan 



Spuit injeksi dan jarumnya







Falcon tube







Oven







Ependorf







Mikropipet







Blue tip







Yellow tip







Pipet voume







Sentrifuse







Tissue







Propipet Hal 2 dari 8



C. Cara Kerja



Diambil 2 mL darah, dimasukkan dalam Falcon tube.



Ditambahkan 10 mL RBCLB lalu dihomogenkan, kemudian diletakkan pada es selama 20 menit.



Dilakukan sentrifugasi campuran dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit.



Apabila buffy coat masih berwarna merah, diulangi langkah ke - 2 dan diinkubasikan lagi pada suhu 4°C selama 30 menit.



Dilakukan sentrifugasi campuran dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit.



Dibuang supernatan, dibersihkan dinding tube dengan cara membalik tube ke tissue.



Ditambahkan 100 μL SE Buffer ke dalam pelet, dikocok hingga larut.



Dipindahkan larutan pada tabung ependorf 1,5 mL.



Ditambahkan 100 μL Guanidin isotiosianat 4 M, dicampur menggunakan pipet.



Ditambahkan 700 μL Kloroform.



Ditambahkan 400 μL NaCl.



Dihomogenkan cairan tersebut secara hati - hati. Hal 3 dari 8



Dilakukan sentrifugasi campuran dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit.



Setelah sentrifugasi, akan tampak 3 lapisan pada larutan yaitu : Lapisan atas : Transparan mengandung DNA Lapisan tengah : Berwarna seperti susu mengandung protein Lapisan bawah : Transparan



Dipindahkan lapisan atas ke dalam ependorf 1,5 mL menggunakan pipet, dicatat volume supernatannya.



Ditambahkan 1 mL etanol absolut, dicampurkan perlahan dengan membolak - balikkan tabung, DNA akan tampak dalam larutan sebagai benang - benang atau endapan berkabut.



Benang DNA yang muncul diambil dengan menggunakan mikropipet 1 mL dan dipindahkan ke tabung ependorf steril dan bersih.



Apabila benang DNA tidak muncul, dilakukan sentrifugasi campuran dengan kecepatan 10000 rpm selama 2 menit. DNA akan terbentuk sebagai pelet. Hal 4 dari 8



Dibuang supernatan, ditambahkan etanol 70% sebanyak 500 μL ke dalam pelet. Digojog berlahan.



Dilakukan sentrifugasi campuran dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu 4°C selama 5 menit.



Dibuang supernatan, dibersihkan cairan pada dinding tabung dengan kertas tissue, JANGAN MENYENTUH PELET DNA.



Dikeringkan pelet DNA dalam oven pada suhu 55°C selama 5 menit.



Ditambahkan TE Buffer sebanyak 150 μL.



Disimpan larutan sampel pada suhu -20°C.



V.



Hasil dan Pembahasan



Pada praktikum kali ini kita melakukan pecobaan pengambilan spesimen dan isolasi DNA mamalia mengunakan metode guanidin isotiosianat. Tujuan dari percobaan kali ini adalah mahasiswa dapat mengetahui jenis spesimen biologi molekuler dan dapat mengisolasi DNA manusia. Tahapan isolasi DNA adalah : 1. Isolasi jaringan Tahap pertama yang dilakukan adalah mengisolasi jaringan yang diinginkan. Spesimen biologi molekuler ini dapat diekstaksi dari kultur sel, jaringan hewan atau tumbuhan, rambut, darah, parafin dan bakteri6. 2. Pelisisan dinding dan membran sel Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penambahan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan karena substansi gen ( DNA ) yang diinginkan ada Hal 5 dari 8



didalamnya. Penambahan larutan pelisis ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung DNA dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen – komponen sel lainnya yang tidak dibutuhkan. Larutan pelisis yang digunakan adalah Red Blood Cel Lysis Buffer ( RBCLB ) yang befungsi untuk melisiskan eritrosit, guanidin isotiosianat yang berfungsi untuk melisiskan membran sel dan TE buffer5. 3. Pengekstraksian dalam larutan Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak5. 4. Purifikasi Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil eksrak dari zat – zat kimia lainnya. Larutan yang digunakan adalah kloroform yang berfungsi untuk mendenaturasi protein, protein presipitasi buffer dan NaCl yang berfungsi untuk membantu pengendapan DNA5. 5. Presipitasi Tahap



terakhir,



yaitu



presipitasi



yang



bertujuan



untuk



mengendapkan protein histon, sehingga untai – untai DNA tidak lagi menggulung



dan



diberikatan



dengan



protein



histon,



yang



menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara penambahan larutan etanol. Etanol ini juga berfungsi untuk mencuci DNA. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasrkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas5. Metode – metode yang digunakan dalam ekstraksi DNA adalah : 1. Fenol : kloroform Metode ini menggunakan senyawa fenol – kloroform – isoamyl alkohol. Metode ini sudah ditinggalkan karena sifat fenol yang toksik5.



Hal 6 dari 8



2. Salting out Metode ini menggunakan garam kopnsentrasi tingi ( NaCl 6 M ). Penambahan



Proteinase



K



pada



metode



ini bertujuan



untuk



mendenaturasi protein5. 3. Guanidin isotiosianat Metode ini lebih cepat dari metode fenol : kloroform dan salting out. Penambahan tiosianat pada metode ini bertujuan untuk melisiskan dinding sel dan penambahan kloroform bertujuan untuk mendenaturasi protein5. 4. Silika gel Metode ini menggunakan silika gel yang berfungsi untuk mengikat DNA dengan perantaraan garam / buffer tertentu. Metode ini cepat tetapi recovery DNA kurang5. Dari hasil praktikum dihasilkan cairan berwarna kekuningan dengan gumpalan – gumpalan berwarna merah. Hasil ini dapat dikatakan belum berhasil karena tidak terbentuk benang – benang DNA. Tidak terbentuknya benang – benang DNA dimungkinkan kesalahan pada waktu pemipetan yang kurang tepat dan tidak hati – hati saat memindahkan sampel atau larutan – larutan ke dalam tempatnya. Pada saat pemindahan sampel darah dari mikropipet ke falcon tube dan penggojogan falcon tube yang telah diberi RBCLB tidak hati – hati mungkin salah satu penyebab sel darah lisis yang mengakibatkan kegagalan dalam praktikum kali ini.



VI.



Kesimpulan



Spesimen biologi molekuler adalah kultur sel, jaringan hewan atau tumbuhan, rambut, bakteri, darah dan parafin. Hasil dari praktikum dapat dikatakan belum berhasil karena benang – benang DNA tidak terbentuk.



Hal 7 dari 8



VII.



Daftar Pustaka



1. Brookes, M., 1999, Genetics, The Ivy Press, United kingdom, 12. 2. Campbell, NA., Reece, JB., dan Mitchell, LG., 2002, Biologi, Jilid 1, Erlangga, Jakarta, 115. 3. Surzycki, S., 2000, Basic Techniques in Molecular Biology, Springer – Verlag Publisher, New York, 216. 4. Hue, NT., Chan, NDH., Phong, PT., Linh, NTT., and Giang NDT., 2012, Extraction of Human Genomic DNA from Dried Blood Spots and Hair Roots,



International



Journal



of



Bioscience,



Biochemistry



and



Bioinformatics, 2 ( 1 ), 21 – 26. 5. Wilson, K., and John, W., 2010, Principles and techniques of Biochemistry and Molecular Biology, Cambridge University Press, New York, 115. 6. Wang, TY., Wang, L., Zhang, JH., and Dong, WH., 2011, A Simplified Universal Genomic DNA Extraction Protocol Suitable for PCR, Genetics and Molecular Research, 10 ( 1 ), 519 – 525.



Hal 8 dari 8