Kelompok 3 - AKTIVITAS ENZIM I [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA AKTIVITAS ENZIM



DOSEN PENGAMPU : apt. Meta Kartika Untari M.Sc. Kelompok : 1. M. Erwin Rivandi



(23175173A)



2. Riska Cahyani



(25195930A)



3. Ananda Rezky Putri



(25195931A)



4. Dini Rahmawati



(25195932A)



PROGRAM STUDI S1 FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SETIA BUDI SURAKARTA 2020



I.



Tujuan Mengetahui aktivitas enzim dengan menentukan achromic point dan factor suhu dan pH yang mempengaruhi aktivitasnya. 1. Penentuan achromic point Mengetahui aktivitas enzim amilase dalam air ludah/saliva dengan menentukan achromic pointnya 2. uji pengaruh suhu pada aktivitas enzim Membuktikan bahwa kecepatan reaksi enzimatik sampai suhu tertentu sebanding dengan kenaikan suhu 3. uji pengaruh pH pada aktivitas enzim Membuktikan bahwa keasamaan pH mempengaruhi kecepatan reaksi enzimatik



II. Dasar Teori Enzim merupakan biokatalisator yang mampu meningkatkan kecepatan reaksi spesifik tanpa ikut bereaksi dan tidak menghasilkan produk samping, bersifat jauh lebih efisien dibandingkan katalis lain, disebabkan molekul enzim memiliki spesifikasi yang tinggi terhadap substratnya. Ukuran molekul enzim jauh lebih besar dari ukuran substratnya karena enzim terdiri dari ratusan bahkan lebih dari seribu asam amino. Ikatan enzim dengan substrat biasa terjadi di sekitar active site, selain itu enzim memiliki sisi regulator yang berfungsi sebagai pengatur untuk meningkatan ataupun menurunkan aktivitas kerja enzim. Sisi regulator ini akan mengikat molekul kecil atau substrat secara langsung ataupun tidak langsung yang berfungsi untuk enzim-substrat yang bersifat sementara dan akan kembali membentuk enzim bebas dan produk (Lehninger, 1997). Menurut Palmer (1995), reaksi antara enzim dengan substrat dapat terjadi menurut dua hipotesis berikut: a. Hipotesis Lock and Key Spesifitas enzim termasuk adanya struktur komplementer antara enzim dengan substrat terjadi apabila substrat mempunyai kesesuaian bentuk ruang dengan enzim pada struktur sisi aktif enzim. b. Hipotesis Induce Fit Substrat tidak mempunyai kesesuaian ruang dengan sisi aktif enzim pada kompleks enzim-substrat, tetapi dalam proses pengikatan substrat, enzim mengalami perubahan konformasi sehingga sesuai dengan substrat. Proses ini



disebut proses induksi. Aktivitas enzim dipengaruhi banyak faktor. Faktor-faktor tersebut menentukan efektifitas kerja enzim. Apabila faktor tersebut berada pada kondisi yang optimum, maka kerja enzim juga akan maksimal. Beberapan faktor yang mempengaruhi kerja enzim, yaitu (Poedjiadi dan Supriyanti, 2006): 1. Konsentrasi enzim Seperti pada katalis lain, kecepatan suatu reaksi yang menggunakan enzim tergantung pada konsentrasi enzim tersebut. Pada suatu konsentrasi substrat tertentu, kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya konsentrasi enzim. 2. Konsentrasi substrat Hasil eksperimen menunjukkan bahwa dengan konsentrasi enzim yang tetap, maka pertambahan konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi. Akan tetapi pada batas konsentrasi tertentu, tidak terjadi kenaikkan kecepatan reaksi walaupun konsentrasi substrat diperbesar. Keadaan ini telah diterangkan oleh Michaleis-Menten dengan hipotesis mereka tentang terjadinya kompleks enzim-substrat. Kompleks enzim-substrat dapat diperoleh dengan adanya kontak antara enzim dengan substrat. Kontak ini terjadi pada sisi aktif enzim. Pada konsentrasi substrat rendah, sisi aktif enzim hanya akan menampung substrat sedikit. Bila konsentrasi substrat diperbesar, makin banyak substrat yang akan bergabung dengan enzim pada sisi aktif tersebut. Dengan demikian, konsentrasi kompleks enzim-substrat makin besar. Hal ini menyebabkan makin besarnya kecepatan reaksi. Pada suatu batas konsentrasi substrat tertentu, semua sisi aktif enzim telah dipenuhi dengan substrat atau telah jenuh dengan substrat, dimana dalam keadaan ini bertambahnya konsentrasi substrat tidak menyebabkan bertambah besarnya konsentrasi kompleks enzim-substrat, sehingga jumlah hasil reaksinya pun tidak bertambah besar. 3. pH (keasaman) Seperti protein pada umumnya, struktur ion enzim tergantung pada pH lingkungannya. Enzim dapat membentuk ion positif, ion negatif atau bermuatan ganda (zwitter ion). Dengan demikian perubahan pH lingkungan akan berpengaruh terhadap efektivitas sisi aktif enzim dalam membentuk enzim- substrat. pH rendah atau pH tinggi juga dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi yang mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim. Oleh



karena itu enzim memiliki pH optimum yang berbeda-beda. 4. Suhu Reaksi enzimatik juga dipengaruhi oleh suhu. Suhu optimum merupakan suhu yang paling tepat bagi suatu reaksi yang menggunakan enzim. Karena enzim merupakan suhu protein, maka kenaikkan suhu juga dapat menyebabkan proses denaturasi yang menyebabkan sisi aktif enzim terganggu dan mengurangi kecepatan reaksi. 5. Waktu kontak Waktu kontak/reaksi antara enzim dan substrat menentukan efektivitas kerja enzim. Semakin lama waktu reaksi maka kerja enzim juga akan semakin optimum (Azis, 2012) 6. Produk akhir Reaksi enzimatik selalu melibatkan dua hal, yaitu substrat dan produk akhir. Dalam beberapa hal, produk akhir juga dapat menurunkan produktivitas kerja enzim (Azis, 2012).



III. Alat dan bahan A. Alat  Tabung reaksi dan Rak tabung reaksi  Gelas ukur, Beaker glass  Stopwatch  Penangas air  Pipet tetes, Pipet volume  Timbangan analitik B. Bahan 



Liur, sebagai sumber amylase







Larutan garam fisiologis NaCl 1 %







Larutan amylum/pati 0,5 % dalam buffer fosfat (0,1M pH 6,7)







Larutan amylum/pati 1 %







Larutan Buffer (penyangga) dengan pH : 1 ;3 ;6,7;9 ;11







Larutan Iodium (0,1 N dalam larutan KI 3%)







Larutan HCl 0,05 N







Penjepit kayu



IV. Metode kerja 1. penentuan achromic point isolasi enzim kumurlah 3kali dengan air untuk membersihkan mulut dari kotoran Kumurlah dengan



larutan garam fisiologis NaCl 1% sebentar



untuk merangsang keluarnya saliva (liur) kunyah kapas sampai saliva cukup banyak, kemudian peras Diencerkan 1:20 dengan akuadest sbg laritan enzim encer



pindahkan masing-masing 5 ml larutan enzim encer ke dalam 3 buah tabung reaksi bersih (tabung A,B dan C) tabung pertama (tabung A) masukan dalam penangas air 37•C. Pada tabung kedua ( tabung B) dipanaskan sampai mendidih selama 2 menit, kemudian masukan juga ke dalam penangas air yang sama pada tabung A. Sedangkan tabung C ditempatkan di rak sebagai suhu kamar siapkan 3 tabung reaksi yaitu tabung I untuk uji (enzim aktif), tabung II sebagai kontrol-1 (enzim inaktif) dan tabung III sebagai kontrol-2 ( blanko/ tanpa enzim)



pada tabung I dan II diisi masing-masing: 5 ml larutan pati 0,5% 2 ml 0,1 M buffer fospar pH 6,7 1 ml larutan graam fisiologis Nacl 1% pada tabung III diisi 5 ml larutan0,5% pati 3ml 0,1 M buffer fosfat pH 6,7 dan 1 ml larutan garam fisiologis NaCl 1% ketiga tabung (I,II,III) dimasukan ke dalam penangas air suhu 37•C dipertahankan tetap selama 5 menit



pada tabung I ditambahkan 1 ml larutan dipertahankan tetap selama 5 menit



tepat setelah 30 detik kemudian pada tabung II Ditambahkan larutan saliva 1 ml dari tabung B ( enzim yang diinaltifkan)



setiap selang waktu 1 menit diambil 1 tetes dari masing2 tabung I, II, III dan dicampur dengan 1 tetes larutan iodium dalam test plate porselin Amati perubahan warna yang terjadi dari campuran bahan yang diuji



2. uji pengaruh suhu pada aktivitas enzim Masukkan 2 ml larutan buffer (penyangga) pH 6,7 kemudian tambahkan 5 ml larutan substrat S (amilum 0,5%) dan 1 ml larutan NaCl fisiologis ke dalam setiap tabung reaksi (ke 10 tabung) baik tabung B dan Tabung U yang sudah ditempatkan pada masing-masing suhu di atas. Diamkan selama 5 menit dan dipertahankan pada masingmasing suhu di atas sebelum cara kerja berikutnya. Tambahkan 1 ml larutan enzim pada setiap tabung U. Tepat saat penambahan larutan enzim ini, catatlah waktu pada penunjuk waktu. Cepat homogenkan. Diamkan pada suhunya selama 6 menit (sesuaikan dengan waktu achromic pointnya). Setelah diinkubasi selama 6 menit, segera didinginkan atau dipindahkan pada suhu ruang dan tambahkan 1 ml HCl 0,05 N serta 1 ml akuades ke dalam setiap tabung B dan tabung U untuk menghentikan reaksi enzimatik.



Tambahkan 1 tetes larutan Iodium dan tambahkan 5 ml akuades (sesuaikan tingkat intensitas warnanya) Segera baca serapan (A) pada panjang gelombang 680 nm. Hitung selisih serapan (∆A) antara tabung B (A pada t=0 menit) dengan tabung U dari tiap suhu. Masukkan data dalam tabel



Buatlah kurva yang menggambarkan hubungan kecepatan reaksi enzimatik (v = ∆A/ menit) dalam 6 menit dengan variasi suhu



3. uji pengaruh pH pada aktivitas enzim Disiapkan alat yang akan digunakan Masukkan kedalam tabung 10 ml larutan buffer pada pH 4, 6, 7, 8. Ke dalam larutan buffer masing-masing ditambahkan larutan kanji 1 %, 2 ml NaCl 0,1 M, dan 2 ml saliva encer pada tiap tabung



Semua tabung reaksi dimasukkan pada penangas air.



Setelah mencapai chromic point, diambil sebanyak 2 tetes dari larutan contoh pada masing-masing tabung, kemudian diteteskan pada plat tetes. Khusus untuk pH 7 dan 8 terlebih dahulu dengan asam asetat. Khusus untuk pH 7 dan 8 terlebih dahulu dengan asam asetat.



Kemudian pada masing-masing sampel yang diteteskan pada plat tetes ditambahkan lagi iodine 0,01 M sebanyak 1 tetes. Diamati perubahan warnanya.



Dilakukan percobaan tersebut pada interval waktu 5, 10, 15, 20, 25, 30, dan 35 menit.



V.



Hasil dan Pembahasan Enzim adalah molekul protein yang berperan sebagai biokatalisator dan berfungsi



untuk mengkatalis reaksi-reaksi metabolisme yang berlangsung pada mahluk hidup. Menurut Bahri (2012) beberapa jenis enzim dibutuhkan untuk merombak karbohidrat, lemak dan protein atau molekul organik lainnya. Karbohidrat mengandung pati yang akan dipecah oleh enzim amilase. Enzim amilase salah satunya terdapat pada air liur manusia yang juga merupakan awal proses pencernaan. Kinerja suatu enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti substrat, suhu, pH, kofaktor, dan inhibitor. Pada kondisi optimumnya laju reaksi akan berlangsung cepat sehingga diperoleh produk yang lebih banyak. Penelitian enzim dapat dilakukan dengan pengujian aktivitas enzim berdasarkan waktu dan mengamati pengaruh pH terhadap aktivitas enzim. 1. Penentuan Achromic Point (waktu inkubasi reaksi) Waktu



Reaksi warna dengan



(menit)



Iodium



1



Biru



biru



biru



2



Biru



biru



biru



3



Biru



biru



biru



4



Biru



kuning



biru



Dst Percobaan pertama yaitu menguji aktivitas enzim amilase air liur yang dilakukan untuk mengamati dan mengetahui kemampuan minimal enzim amilase memecah pati persatuan waktu. Cara kerja dari uji tersebut adalah Amilase yang terkandung dalam air ludah akan menghidrolisa ikatan alfa-1 antar unit D-glukosa. Pada nilai pH sekitar 6-7 dan dengan adanya ion klorida. Alfa amilase mengkatalisis hidrolisis pati menghasilkan berbagai dekstrin sebagai produk antaranya. Pati dengan dekstrin BM tinggi memberikan warna biru-ungu dengan iodine, dekstrin BM rendah tidak bereaksi dengan Iodin. Karena itu, kerja Alfa-amilase dapat diikuti dengan mengamati waktu yang diperlukan sampai mencapai keadaan dimana campuran reaktan tidak membentuk warna lagi dengan Iodin, yang disebut achromic point. Jadi, Achromic point dari data diatas adalah pada waktu 4 menit. Karena pada waktu tersebut, campuran bahan tidak lagi membentuk warna biru-ungu dengan larutan Iodium Bila achromic point tidak tercapai lebih dari 4 menit amilase saliva



tersebut memiliki aktivitas nol. Tetapi bila achromic point tercapai kurang dari 4 menit, larutan saliva perlu diencerkan untuk mendapatkan hasil yang lebih baik. Karena Achromic Pointnya tepat pada 4 menit maka aktivitas amilase saliva tidak sama dengan nol (hasil sudah baik). 2. Pengaruh Suhu pada Aktivitas Enzim Serapan



Serapan



v = (Serapan tabung U-Serapan tabung



tabung B



tabung U



B)/ waktu inkubasi reaksi



0oC



0,025



0,068



(0,068-0,025)/ 6 menit = 0,043/6 = 0,007



20oC



0,437



0,609



(0,609-0,437)/ 6 menit = 0,172/6 = 0,0286



Suhu ruang



0,045



0,052



(0,052-0,045)/ 6 menit = 0,007/6 = 0,0011



37oC-40oC



0,02



0,023



(0,023-0,02)/ 6 menit = 0,003/6 = 0,0005



75oC-80oC



0,157



0,470



(0,470-0,157)/ 6 menit = 0,313/6 = 0,052



Suhu



Gambar 1. Tabel Data Pengaruh Suhu pada Aktivitas Enzim 0,07



Suhu o



V



0,06



0C



0,007



o



0,0286



20 C Suhu ruang 37oC40oC 75oC80oC



0,0011



0,05 0,04 0,03



0,0005 0,02



0,052



0,01 0 0



1



2



3



4



5



6



Gambar 2. Kurva Suhu (X) dan kecepatan reaksi enzimatik (Y) Pada pengujian ini digunakan berbagai suhu pemanasan untuk membuktikan bahwa kecepatan reaksi enzimatik sampai suhu tertentu sebanding dengan kenaikan suhu. Berdasarkan hasil pengamatan: - Pada suhu 0°C, kecepatan kerja enzim hampir terhenti karena suhu tergolong rendah. Suhu rendah menyebabkan terhentinya kerja enzim secara reversibel karena dalam keadaan tersebut tidak terjadi benturan antara partikel S dan S. Akibatnya



kompleks E-S yang sangat penting dalam reaksi enzimatik tidak terbentuk sehingga P juga tidak terbentuk. - Pada suhu 20°C; Suhu ruang; 37°-40°C, Kenaikan suhu lingkungan sedikit demi sedikit akan meningkatkan energi kinetik enzim dan meningkatkan frekuensi benturan antara molekul Enzim dan Substrat dalam membentuk kompleks E-S akan makin meningkat sehingga produk (P) yang terbentuk akan makin banyak. - Pada suhu 75°-80°C adalah suhu optimum enzim karena pada saat tercapai suhu tersebut kecepatan reaksi enzimatik mencapai maksimum (v paling besar = 0,052). Bila pengujiannya sampai pada suhu yang jauh melampaui suhu optimum maka akan terjadi denaturasi enzim yang sifatnya irreversibel.



1. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim pH lar. Ami Serapan



Serapan



v = (Serapan tabung U-Serapan tabung B)/



-lum 0,5%



tabung B



tabung U



waktu inkubasi reaksi



pH 1



0,322



0,465



(0,465-0,322)/ 6 menit = 0,143/6 = 0,0238



pH 3



0,677



0,941



(0, 941-0,677)/ 6 menit = 0,264/6 = 0,044



pH 6,7



0,320



0,045



(0,045-0,320)/ 6 menit = -0,275/6 = 0,045



pH 9



0,442



0,474



(0,474-0,442)/ 6 menit = 0,032/6 = 0,0053



pH 11



0,394



0,013



(0,013-0,394)/ 6 menit =-0,381/6 = 0,0635



Gambar 3. Tabel Data Pengaruh pH pada Aktivitas Enzim pH pH 1 pH 3 pH 6,7 pH 9 pH 11



V 0,0238 0,044 0,045 0,0053 0,0635



0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0



1



2



3



4



5



6



Gambar 4. Kurva Suhu (X) dan kecepatan reaksi enzimatik (Y) Percobaan ketiga yaitu untuk mengetahui pengaruh pH terhadap aktivitas enzim. Setiap enzim memiliki pH optimum yang berbeda. Di luar pH optimum aktivitas enzim dapat terganggu karena mempengaruhi muatan kompleks enzim substrat (E-S). pH optimum dari data Enzim diatas adalah pH 11 (v paling besar = 0,0635). Namun hal ini tidak sesuai dengan teori karena pH 11 terlalu basa, berlaku juga untuk pH 9. Dimana pH yang terlalu tinggi (basa)/ lebih dari pH optimum, kecepatan reaksi enzimatiknya berkurang karena karena enzim mengalami denaturasi atau dapat mengalami perubahan muatan listrik yaitu SH+ akan mengalami ionisasi. Reaksi yang terjadi: SH+  S



+



H+ . Oleh karena hanya SH+ yang dapat bereaksi dengan Enz- ,



maka pada pH ekstrim rendah atau tinggi konsentrasi efektif SH+ dan Enz- akan berkurang, sehingga kecepatan reaksi enzimatikya juga berkurang.



Pada pH 1; pH 3; pH 6,7 adalah pH rendah (asam)/ kurang dari pH optimum, kecepatan reaksi enzimatiknya berkurang karena enzim mengalami denaturasi atau dapat mengalami perubahan muatan listrik yaitu Enz- akan bereaksi dengan H+ menjadi enzim yang tidak bermuatan. Reaksi yang terjadi: Enz- + H+  Enz-H. Catatan: hasil v sebenarnya yang diperoleh pada suhu pH 6,7 dan pH 11 adalah minus (data tidak valid). Kemungkinannya dikarenakan kesalahan yang terjadi ketika pengujian, misalnya kesalahan teknis, faktor human error dan lain-lain.



VI. Kesimpulan 1. Achromic point adalah waktu yang tercatat pada saat campuran bahan tidak lagi membentuk warna biru-ungu dengan larutan Iodium. 2. Kecepatan reaksi enzimatik sampai suhu tertentu sebanding dengan kenaikan suhu. 3. Di luar pH optimum aktivitas enzim dapat mengalami denaturasi atau dapat mengalami perubahan muatan listrik



DAFTAR PUSTAKA Rosyda. 2016. karakterisasi ph, suhu dan konsentrasi substrat pada enzim selulase kasar yang diproduksi oleh Bacillus circulans. Dalam http://etheses.uinmalang.ac.id/2864/1/10630059.



Diakses



pada tanggal 5 oktober 2020 jam



12.00 WITA. Dyna. 2015. Aktivitas enzim dari larva. Dalam http://ejurnal.umri.ac.id/index. php/photon/article/download. Diakses pada tanggal 6 oktober 2020 jam 14.00 WITA.