Modifikasi Pasca Transkripsi [PDF]

Citation preview

MODIFIKASI PASCA TRANSKRIPSI



RESUME Untuk Memenuhi Tugas Matakuliah Genetika I Yang dibina oleh Prof. Dr. Hj. Siti Zubaidah, M.Pd



Disusun oleh: Kelompok 8 Offering G Dies Naris Wari Pudjafinisya



160342606263



Krismonik Dwi Maulida



160342606270



JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI MALANG Maret 2018



1. Pemindahan Sekuen Intron dengan Penyambungan RNA Kebanyakan gen nukleus yang mengkode protein pada eukariot multiseluler mengandung intron. Lebih sederhana gen eukariotik uniseluler seperti ragi mengandung intron. Gen langka dari archaea dan beberapa virus prokariota pun mengandung intron. Dalam kasus ini split gen, transkrip primer mengandung seluruh urutan gen, dan urutan intron yang dipotong selama RNA diproses. Untuk gen yang mengkode protein, mekanisme penyambungan harus tepat, yang berarti harus menggabungkan urutan ekson yang akurat dengan nukleotida tunggal untuk memastikan bahwa kodon dalam ekson distal intron dibaca dengan benar. Akurasi untuk gelar ini tampaknya akan membutuhkan sinyal splicing tepat, urutan nukleotida mungkin dalam intron dan pada persimpangan ekson-intron. Namun, dalam transkrip utama gen nukleus, hanya urutan benar-benar dilestarikan intron berbeda urutan dinukleotida di ujung intron. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa splicing dan intron urutan dapat mempengaruhi ekspresi gen. Bukti langsung untuk kepentingannya telah disediakan oleh mutasi di situs tersebut yang menyebabkan fenotipe mutan dalam banyak eukariotik yang berbeda. Mutasi tersebut kadang-kadang bertanggung jawab untuk penyakit yang bersifat menurun pada manusia, seperti pada gangguan hemoglobin. Penemuan intron yang bukan pengkode pada gen menimbulkan perhatian yang besar pada mekanisme pemindahan sekuen intron selama ekspresi gen. Berdasarkan penelitian penyambungan RNA secara in vitro, terdapat tiga tipe khas penghilangan intron dari transkrip RNA. Tiga kelas intron merupakan paling umum dan paling penting dari seluruh ekspresi gen eukariot, yaitu: 1. Intron dari prekursor tRNA dihilangkan oleh reaksi pemotongan dan penyambungan endonukleotik yang tepat yang dikatalisis oleh aktivitas special splicing endonuclease dan ligase.



2. Intron dari prekursor rRNA Tetrahymena dipindahkan secara autokatalitik dalam reaksi khusus yang dimediasi oleh molekul RNA itu sendiri (tidak ada aktivitas protein enzimatik yang terlibat). 3. Intron dari transkrip nuclear pre-mRNA (hnRNA) dipindahkan dalam dua tahap reaksi yang dilaksanakan oleh partikel ribonukleoprotein kompleks yang disebut spliceosomes. Menurut angka tulisan dibawah garis menunjukkan presentase frekuensi dari consensus dasar di tiap-tiap posisi ; demikian 100 dibawah garis menunjukkan bahwa dasar selalu hadir pada posisi itu. N menunjukkan bahwa yang mana empat standar nucleotide mungkin hadir pada posisi yang ditunjukkan. Sambungan exon-intron berbeda dalam kasus dari gen tRNA dan struktur gen dalam mitokondria dan kloroplas, yang mana menggunakan perbedaan mekanisme sambungan RNA. Disini hanya satu sekuen terpelihara pendek dalam intron dari gen nuclear, yang disebut “TACTAAC box” dan ini kurang baik dipelihara. “TACTAAC box” memperlihatkan pilihan kuat untuk salah satu purin atau pirimidin pada tiap tempat sebagai berikut : Py80 N Py80 Py87 PU75 A100 Py95 Adenine residu pada posisi 6 di “TACTAAC box” sepenuhnya terpelihara dan diketahui berperan penting pada reaksi splicing (sambungan). Sisa sekuen dari intron (sering banyak sekali) dari gen nuclear itu sangat berbeda dan kelihatan menjadi sekuen bebas seluruhnya. Intron dari gen mitokondria dan kloroplas mengandung sekuen terpelihara yang berbeda dari gen nuclear. Sebagian besar gen mengandung bayak intron (contohnya gen α2 kolagen dari ayam mengandung lebih dari 50 intron), mendorong munculnya pertanyaan tujuan dari penghilangan intron yang banyak tersebut. Intron lain telah ditemukan untuk menjalani jalur alternatif dari pemotongan menyisakan mRNAs yang menghasilkan protein berbeda (dengan kata lain, dengan beberapa keadaan dan beberapa sekuen asam amino yang berbeda). Akhirnya, satu intron pada gen b sitokrom dari mitokondria ragi termasuk bagian dari sekuen pengkode untuk



protein, “RNA maturase”, yang bertanggung jawab untuk menghilangkan intron kedua dari transkrip gen tersebut.



2. Penyambungan Prekursor-Prekursor tRNA: Nuklease dan Ligase yang Khas Reaksi pemotongan prekursor tRNA telah dipelajari secara rinci pada Saccharomyces cerevisiae. Sistem pemotongan secara in vitro dan pemotongan pada mutan yang sensitif terhadap suhu telah digunakan dalam pemotongan mekanisme pemotongan



tRNA pada S. cerevisiae. Penghilangan intron dari



prekursor tRNA ragi terjadi dalam 2 tahap. Pertama, membran nuklear mengikat splicing endonuclease membuat dua potongan yang tepat pada akhir dari intron. Selanjutnya, pada susunan komplek yang biasa dari reaksi, splicing ligase ikut pertengahan kedua dari RNA untuk menghasilkan RNA yang siap dari molekul tRNA. Pemotongan dari prekursor tRNA menghasilkan ujung 5’-OH dan 2’-3’ grup fosfat silik pada ujung 3’. Tahap kedua dari proses penyambungan secara nyata melibatkan 4 reaksi terpisah 1. Reaksi pertama adalah penambahan grup fosfat pada ujung 5’-OH, reaksi ini membutuhkan aktivitas kinase dan donor fosfat (ATP) 2. Selanjutnya, grup 5’ fosfat diaktivasi oleh transfer grup AMP pada terminus dari sebuah intermediet AMP-ligase (AMP mula-mula telah berasal dari ATP juga) 3. 2’-3’ fosfat siklik dibuka oleh aktivitas cyclic phosphodiesterase yang menghasilkan 2’ fosfat dan 3’ hidroksil bebas 4. Reaksi penyambungan akhir terjadi melalui pemecahan nucleophilic dari 3’OH bebas pada bagian dalam 5’ fosfat dengan melepas AMP. Seluruh empat reaksi tersebut dikatalisis oleh splicing ligase. Akhirnya grup 2’ fosfat (sisa dari 2’-3’ fosfat siklik dihasilkan oleh reaksi pemecahan semula) dipindahkan oleh aktivitas phosphatase untuk menghasilkan molekul tRNA dewasa



Dua tahap keseluruhan dari cara penghilangan intron tRNA nampak terjadi pada organisme lain. Mekanisme dapat melibatkan reaksi yang sama pada tumbuhan. Namun, pada mamalia reaksinya tidak sama. Pemotongan masih terjadi dalam dua tahap namun reaksi penyambungan muncul secara langsung diikut 2’-3’ fosfat siklik terminus ke 5’-OH terminus. Rincian dari proses dari pemotongan precursor tRNA pada sel mamalia masih belum secara jelas.



3. Penyambungan Autokatalitik dari Prekursor Rrna Tetrahymena Pembahasan pokok biologi adalah metabolisme terjadi melalui sekuen dari reaksi katalisis oleh enzim. Semua enzim penting merupakan protein, kadang berupa polipeptida tunggal dan heteromultimer kompleks yang membutuhkan kofaktor non protein agar bisa aktif. Ikatan kovalen akan berubah ketika dipindah, ditransfer dan dibentuk, kita menduga bahwa reaksi tersebut dikatalis oleh enzim. Penemuan bahwa intron pada precursor rRNA dari Tetrahymena thermophile dihilangkan tanpa keterlibatan dari protein lain. Tetapi dijelaskan bahwa aktivitas pemotongan yang menghilangkan intron dari precursor rRNA adalah intrinsik terhadap molekul RNA itu sendiri. Pemotongan sendiri atau aktivitas autokatalitik telah ditunjukkan terjadi pada precursor rRNA, tRNA dan mRNA pada mitokondria dan kloroplas dari beberapa spesies yang berbeda. Pada sebagian besar kasus dari intron ini (disebut kelompok 1 intron) pada molekul prekorsor RNA, mekanisme pemotongan sendiri adalah sama dengan prekorsor rRNA Tetrahymena thermophile yang akan dideskripsikan selanjutnya. Untuk intron yang lain (kelompok II intron), mekanisme pemotongan mirip dengan mekanisme pemotongan yang diamati dengan precursor mRNA nuclear kecuali hal tersebut tidak membutuhkan aktivitas “spliceosome”. Proses penghilangan autokatalitik dari intron pada prekorsor rRNA Tetrahymena thermophile (kelompok I intron lainnya) tidak membutuhkan sumber energy dari luar yaitu tanpa ATP dan tanpa protein, sehingga melibatkan serangkaian transfer ikatan fosfoester tanpa ikatan yang hilang atau penambahan. Reaksi tersebut melibatkan nukleosida atau nukleotida guanine dengan kelompok 3’-OH bebas (GTP, GDP,



GMP atau semua guanosin yang dibutuhkan) sebagai kofaktor dengan kation monovalent dan kation divalent. Kebutuhan terhadap G-3’-OH merupakan kebutuhan mutlak, tidak ada komponen pokok lain yang dapat digantikan pada kofaktor nukleosida dan nukleotida. Intron dihilangkan dengan jalan transfer 2 ikatan fosfodiester dan intron yang hilang dapat membentuk sirkular dengan jalan transfer ikatan fosfodiester lain. sirkulasi autokatalitik dari penghilangan intron dengan pemotongan sendiri prokursor rRNA terletak secara primer dalam struktur intron itu sendiri. Aktivitas autokatalitik juga tergantung pada aktivitas sekunder dari intron atau struktur sekunder dari molekul precursor RNA. Struktur sekunder dari pemotongan sendiri oleh RNAs membawa grup reaktif sekitar juxtaposisi untuk mengizinkan transfer ikatan fosfoester terjadi. Pemotongan sendiri pada transfer ikatan fosfoester reaksinya berlangsung secara reversible, degradasi cepat dari penghilangan intron atau ekspor dari pemotongan rRNAs ke sitoplasma dapat mengendalikan pemotongan selanjutnya. Poin penting dari reksi pemotongan autokatalitik adalah intramolekular di alam tanpa bergantung konsentrasi. Precursor RNA mampu membentuk pusat aktif pada iktana kofaktor guanosin 3’-OH. Tempat katalitik tidak membatasi protein tetapi tidak ada aktivitas katalitik trans sebagai enzim, hanya aktivitas katalitik cis.



Gambar 3.1 Diagram mekanisme pemotongan sendri dari precursor rRNA Tetrahymena thermophile dan sirkulasi dari intron yang terpotong (Snustad, 2012). 4. Penyambungan pre-mRNA : snRNAs, snRNPs dan Splicoesome Intron pada inti precursor mRNA (inti pre-mRNAs) dihilangkan melalui dua tahap seperti intron pada pre-tRNAs ragi dan pre rRNAs Tetrahymena. Intron tidak dihilangkan dengan pemotongan nuclease dan ligase sederhana atau secara autokatalitik. Tetapi pemotongan inti pre-mRNA dilakukan oleh struktur RNA atau protein komplek yang disebut spliceosome. Spliceosome ini berada dalam jalur yang berbeda pada ribosom kecil. Spliceosome mengandung kumpulan molekul RNA kecil yang disebut snRNAs (small nuclear RNAs) dan kumpulan protein yang masih belum dikenal secara lengkap. Dua tahap dari pemotongan pre-mRNA nuclear telah diketahui, namun beberapa rincian dari proses pemotongan masih belum diketahui. Lima snRNAs yaitu U1, U2, U4, U5, dan U6 terlibat dalam pemotongan inti premRNA sebagai komponen dari spliceosome (snRNA U3 terdapat dalam nukleolus



dan kemungkinan terlibat dalam pembentukan ribosom). Pada mamalia memiliki rentangan ukuran snRNAs dari 100 nukleotida (U6) sampai 215 nukleotida (U3). Beberapa snRNAs pada ragi (S. cerevisiae) memiliki ukuran lebih besar. snRNAs bukan termasuk molekul RNA bebas. Tetapi, terdapat sebagai kompleks RNAprotein nuclear kecil yang disebut snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein). Karakteristik dari snRNPs telah diperkuat dengan adanya penemuan bahwa beberapa pasien dengan penyakit sistemik lupus erythematosus menghasilkan antibodi yang bereaksi dengan protein snRNPs. Antibodi ini disebut dengan autoantibodi karena bereaksi dengan protein pada pasien (“self” protein). Normalnya hanya antibodi yang bereaksi dengan protein asing akan diproduksi oleh sistem imun. Antibodi ini dapat digunakan untuk mempercepat snRNPs, sehingga antibody dapat menfasilitasi pemurniaan ari snRNPs untuk pembelajaran structural dan fungsional. snRNAs U1, U2, dan U5 dihadirkan dalam tiga partikel snRNP yang berbeda, masing-masing mengandung snRNA tunggal. snRNAs U4 dan U6 hadir dalam snRNP keempat, snRNAs U4 dan U6 mengandung dua bagian dari komplemen intramolekuler yang kemungkinan adalah dasar pasangan pada snRNP U4/U6. Masing-masing pada empat tipe dari partikel snRNP mengandung kumpulan pokok dari tujuh karakteristik protein snRNP dengan satu atau lebih protein khusus sampai tipe partikular dari partikel snRNP. Keseluruhan dari keempat kompleks snRNP ditampilkan dalam spliceosome yang diisolasi. Tahap pertama dalam pemotongan inti pre-mRNA melibatkan pemecahan pada 5’ intron splice site ( GT-intron) dan susunan dari ikatan fosfodiester intramolekular antara 5 karbon dari G dan 2’ karbon dari residu A dekat karbon 3’ akhir dari intron. Tahap ini terjadi pada spliceosome dan membutuhkan hidrolisis ATP. Buktinya menunjukkan bahwa U1 snRNP harus terikat pada tempat pemotongan 5’ sebelumnya sebagai inisial reaksi pemecahan. Pengenalan dari pemisahan pada karbon akhir 5’ dari intron akan melibatkan pasangan dasar antara sekuen konsensus pada tempat asal dan sekuen komplemen dekat ujung 5’ dari snRNA U1. Tetapi, ikatan khusus dari beberapa snRNPs ke sekuens consensus intron melibatkan



snRNAs dan protein snRNP spesifik, selanjutnya pasangan dasar antara intron sekuen konsesnsus 5’ dan sekuen komplementer pada snRNA menyediakan hanya satu bagian khusus untuk ikatan fungsional dari U1 snRNP ke molekul pre-mRNA. nsnRNP kedua ditambahkan untuk memotong komplek dan muncul untuk menjadi U2snRNP yang terikat pada sekuen consensus, mengandung 100 persen residu A yang membentuk titik percabangan pada struktur lariat dari intron yang terpotong. Setelah itu, U5 snRNP terikat pada tempat pemotongan 3’, dan U4/U6 snRNP ditambahkan pada komplek untuk menghasilkan spliceosome yang lengkap. Ketika tempat pemotongan 5’ intron dipotong pada tahap pertama, U4 snRNA dkeluarkan dari spliceosome (secara in vitro). Pada tahap 2 dari reaksi pemotongan, tempat pemotongan 3’ dari intron dipecah, dan dua exon disambung oleh ikatan fosfodiester normal 5’ ke 3’. mRNA yang telah terpotong sekarang siap untuk dikeluarkan ke sitoplasma dan meneruskan proses translasi oleh ribosom.



Gambar 5.1 peran postulat dari snRNA yang mengandung inti snRNPs pemotongsn pre-mRNA (Snustad, 2012) .



Soal dan Jawaban a. Dies Naris W.P / 160342606263 1. Bagaimana struktur gen mitokondria pada proses penyambungan RNA? Jawab: Struktur penghubung exon-intron pada gen mitokondria berbeda dengan gen lainnya, sehingga proses penyambungan RNA juga berbeda. Mitokondria hanya memiliki satu urutan pendek yang mengandung intron. Urutan tersebut dikenal dengan “TACTAAC box”. Sisa adenin pada urutan ke-6 pada “TACTAAC box” mempunyai peranan penting dalam proses penyambungan RNA. 2. Bagaimana mekanisme splicing precursor tRNA pada Saccharomyces cerevisiae? Jawab : Mekanisme splicing precursor tRNA pada Sacchromyces cerevisiae terjadi melalui dua tahapan. Tahap pertama yaitu enzim yang disebut splicing edonuklease (tRNA endonucleasse) yang terikat pada membran nukleus melakukan dua pemotongan secara tepat pada kedua ujung intron. Tahap kedua yaitu suatu enzim yang disebut splicing ligase (RNA ligase) menyambung kedua bagian tRNA sehigga dihasilkan molekul tRNA yng sedah matang. b. Krismonik Dwi M / 160342606270 1. Pada Tetrahymena thermophile intron pada precursor rRNA mengapa dihilangkan tanpa melibatkan peran dari protein lain? Jawab : pada Tetrahymena thermophile proses pemotongan yang diikuti dengan penghilangan intron dari prekursor rRNA dilakuakn dengan protein yang dia miliki sendri sehingga tidak memerlukan protein dari luar untuk membatu proses pemotongan dan penghilangan intron dan juga merupakan unsur intrinsik dari molekul RNA itu sendiri. inti pre-mRNA yang dipotong dilakukan oleh struktur RNA atau protein kompleks disebut spliceosome.



Spliceosome mengandung kumpulan molekul RNA disebut snRNAs (small nuclear RNAs) dan mengandung kumpulan protein yang masih belum dikenal secara lengkap. Memiliki lima snRNAs yang terlibat dalam pemotongan inti pre-mRNA yang merupakan bagian dari spliceosome yaitu U1, U2, U4, U5, dan U6. 2. Bagaimanakah tahap penyambungan pre-mRNA spliceosome? Jawab : Tahapannya yaitu diawal pemotongan yang terjadi pada ujung 5’ intron dan 2’-5’ phosphodiester yang dibentuk diantara posisi 5’-G ditempatkan dekat ujung 3’ intron. Tahap keduanya gen digabungkan oleh ikatan 3’-5’ phosphodiester dan intron yang terbentuk akan dilepaskan. Tahapan ini membutuhkan hidrolisis ATP. Terdpaat kandungan molekul lain pada spliceosome adalah molekul RNA yang disebut snRNP. Molekul snRNP mulai ditambahkan pada proses pemotongan yang prosesnya berlangsung secara lengkap. Molekul snRNP U2 diikat pada jaringan yang khusus kemudin membentuk percabangan. Kemudian snRNP U5 dan U4 atau U6 ditambahkan untuk menghasilkan spliceosome yang sempurna. Pada pembelahan ujung 5’ intron, snRNA U4 dilepaskan dari spliceosome. Setelah intron dipotong, dua bagian exon digabungkan dengan menyambungan 5’-3’ phosphodiester sehingga mRNA yang sudah dipotong siap dipindah ke sitoplasma dan meneruskan proses translasi oleh ribosom