Modul 2 - Turbidimetri Dan Counting Chamber - Novita [PDF]

Citation preview

1



Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik



LAPORAN RESMI PENENTUAN JUMLAH SEL MIKROORGANISME



I. Tujuan I.1 Metode Spektrofotometri Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mempelajari cara menghitung jumlah sel mikroorganisme dengan metode spektrofotometri. II.2 Metode Counting Chamber Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mempelajari cara menghitung jumlah sel mikroorganisme dengan metode counting chamber. II. Data Pengamatan II.1 Metode Spektrofotometri Tabel II. 1 Hasil Pengamatan Metode Spektrofotometri Faktor Pengenceran 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16



%T 25.2 46.87 76.83 79.03 86.57



OD 0.599 0.329 0.114 0.102 0.063



II.2 Metode Counting Chamber Massa ragi = 1 gram Tabel II.2 Hasil Pengamatan pada Pengenceran 10.000 kali Kotak



Run



Total



Jumlah Sel/ Kotak



1



A 10



B 7



C 8



D 8



E 7



40



8



2



8



9



13



8



9



47



9,4



3



9



9



11



10



9



48



9,6



JUMLAH



Jumlah sel ragi rata-rata



= 27/3



Laboratorium Teknik



Mikrobiologi



27



2



Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik



= 9 sel/kotak Jumlah sel ragi = 9 x (1/25) sel/mm2 = 225 sel/mm2 Jumlah sel ragi = [225 sel/mm2 x (1/0,1mm)] sel/mm3 = 2.250 sel/mm3 Jumlah sel ragi pada pengenceran 10.000x = 2.250 sel/mm3 x (1 mm3/0,001 ml) = 2.250.000 sel/ml sampel = 2 juta sel/ml sampel Tabel II.3 Hasil Pengamatan pada Pengenceran 100.000 kali Kotak



Run



Total



Jumlah Sel/ Kotak



1



A 5



B 6



C 12



D 7



E 9



39



7,8



2



3



5



13



6



11



38



7,6



3



5



4



15



5



7



36



7,2



JUMLAH



Jumlah sel ragi rata-rata



22.6



= 22,6/3



= 7,533 sel/kotak Jumlah sel ragi = 7,533 x (1/25) sel/mm2 = 188,325 sel/mm2 Jumlah sel ragi = [ 188,325 sel/mm2 x (1/0,1mm)] sel/mm3 = 1883,25 sel/mm3 Jumlah sel ragi pada pengenceran 100.000x =1.883,25 sel/mm3 x (1 mm3/0,001 ml) = 1.883.250 sel/ml sampel = 2 juta sel/ml sampel Tabel II.4 Hasil Pengamatan pada Pengenceran 1.000.000 kali



Laboratorium Teknik



Mikrobiologi



3



Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik



Kotak



Run



Total



Jumlah Sel/ Kotak



1



A 0



B 1



C 0



D 0



E 1



2



0,4



2



0



1



1



0



1



3



0,6



3



0



1



0



0



1



2



0,4



JUMLAH



Jumlah sel ragi rata-rata



1,4



= 1,4/3



= 0,47 sel/kotak Jumlah sel ragi = 0.47 x (1/25) sel/mm2 = 11,75 sel/mm2 Jumlah sel ragi = [11,75 sel/mm2 x (1/0,1mm)] sel/mm3 = 117,5 sel/mm3 Jumlah sel ragi pada pengenceran 1.000.000x = 117,5 sel/mm3 x (1 mm3/0,001 ml) = 117.500 sel/ml sampel = 100 ribu sel/ml sampel III. Pembahasan III.1 Metode Spektrofotometri Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mempelajari cara menghitung jumlah sel



mikroorganisme



dengan



metode



spektrofotometri.



Spektrofotometri



merupakan analisa kuantitatif berdasarkan absorbsi suatu zat terhadap panjang gelombang elektromagnetik tertentu, dalam hal ini gelombang cahaya. Suspensi dari suatu sel akan terlihat keruh, karena sel akan menyebarkan cahaya yang melewati suspense. Semakin banyak sel, semakin banyak cahaya yang disebarkan, sehingga suspensi terlihat semakin keruh. Kekeruhan sel akan sebanding dengan jumlah sel yang ada di suatu suspense. Sehingga perlu dipahami bahwa absorbsi yang terjadi pada sel bukan karena adanya absorbsi pada panjang gelombang tertentu, tetapi penyebaran cahaya pada panjang gelombang tertentu. Pengukuran



Laboratorium Teknik



Mikrobiologi



4



Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik



kekeruhan sel disajikan dalam satuan Optical Density (OD) pada panjang gelombang yang spesifik. (Madigan, 2012, hal 131)



(Tortora, 2010,sel hal 179) Gambar III.1 Metode spektrofotometri untuk menghitung jumlah Pertama-tama spektrofotometer dinyalakan lalu ditunggu sekitar 15 menit agar alat yang digunakan mencapai kesetimbangan termal sehingga lebih optimal ketika digunakan. Kemudian dilakukan pengenceran terhadap bakteri Escherichia coli. Pengenceran berfungsi untuk mengurangi konsentrasi suspensi. Dengan konsentrasi bakteri yang kecil, bakteri akan tersebar merata di seluruh larutan dan kemungkinan membentuk gumpalan. Pengenceran yang digunakan adalah pengenceran berantai, sehingga akan menghemat larutan dan bahan. Langkah pertama yang dilakukan dalam pengenceran adalah menyiapkan 5 tabung reaksi dan memberi label 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, dan 1:16. Nutrient Broth dimasukkan ke dalam tabung (kecuali tabung 1:1) masing-masing sebanyak 4 ml. Ditambahkan nutrient broth supaya mikroorganisme yang digunakan, yaitu Escherecia coli tidak mati. Nutrient Broth Agar (NBA) merupakan media yang berasal dari ekstrak daging. Media NBA terdiri dari 2 jenis, yaitu cair (Nutrient Broth) atau padat dengan penambahan agar (Nutrient Agar). NBA cocok digunakan untuk kultur bakteri karena kandungannya kaya protein yang sangat dibutuhkan bakteri dalam pertumbuhannya. Komposisi Nutrient Agar adalah sebagai berikut: Peptone 5.0 g Beef extract 3.0 g Agar 15.0 g Distilled water 1,000.0 ml Komposisi Nutrient Broth adalah sebagai berikut: Peptone 5.0 g Beef extract 3.0 g Laboratorium Teknik



Mikrobiologi



5



Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik



Distilled water



1,000.0 ml



(Prescott, 2002, hal. 446) Bakteri yang digunakan adalah Escherichia coli dengan taksonomi sebagai berikut: Domain



: Bacteria



Filum



: Proteobacteria



Kelas



: Gammaproteobacteria



Ordo



: Enterobacteriales



Famili



: Enterobacteriaceae



Genus



: Escherichia



Spesies



: E. coli



Ciri-ciri dari Eschericia coli adalah berbentuk batang (basil) dan berukuran panjang sekitar 3 µm. Merupakan bakteri gram negatif dan tidak menghasilkan spora. Eschericia coli merupakan bakteri yang dapat menguntungkan maupun merugikan. Eschericia coli membantu dalam proses pembusukan makanan di dalam usus besar. Namun di sisi lain dapat menyebabkan berbagai macam penyakit pada manusia, seperti diare, infeksi saluran kemih, sepsis, dan meningitis. (Leboffe, 2011, hal. 144) Larutan suspesi Escherichia coli kemudian diambil 4 ml dan dimasukkan ke tabung 1:1. Larutan suspesi Escherichia coli kemudian diambil 4 ml lagi dan dimasukkan ke tabung 1:2. Dari tabung 1:2 diambil 4 ml dimasukkan ke tabung 1:4. Dari tabung 1:4 diambil 4 ml dimasukkan ke tabung 1:8. Dari tabung 1:8 diambil 4 ml dimasukkan ke tabung 1:16. Ketika pengenceran, suspensi bakteri diaduk dengan memutar-mutar tabung reaksi dengan telapak tangan. Tujuannya agar larutan menjadi homogen sehingga tidak ada bakteri yang terkonsentrasi pada satu titik. Pengadukan tidak boleh dilakukan dengan mengocok tabung reaksi karena dapat menyebabkan sel-selnya mati dan terjadi penumpukan sel.



Laboratorium Teknik



Mikrobiologi



6



Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik



(Benson, 2003, 97) Gambar III.2 Proses Pengenceran secara Berantai Panjang gelombang pada spektrofotometer diatur menjadi 686 nm, lalu dimasukkan kuvet yang berisi media Nutrient Broth sebagai blanko. Sel bakteri menyebarkan cahaya dengan baik pada panjang gelombang 686 nm, ketika ditumbuhkan di media standar. Setelah itu spektrofotometer dikalibrasi sehingga menunjukkan 0 A dan 100 %T Suspensi bakteri pada tabung 1:1 dimasukkan ke dalam kuvet hingga ¾ volume kuvet. Kuvet tidak boleh diisi penuh untuk menghindari larutan tumpah di dalam ruang pengukuran. Kuvet berisi blanko kemudian dikeluarkan dan diganti dengan kuvet berisi suspensi bakteri yang akan diukur. Spektrofotometer akan menunjukkan angka absorbansi dan transmitansi. Tunggu beberapa saat agar spektrofotometer menunjukkan angka yang stabil lalu dicatat hasilnya. Pengukuran pada suatu satu variabel lebih baik diulang sebnayak 3 kali kemudian dirata-rata hasilnya untuk mendapatkan hasil yang lebih akurat. Prosedur yang sama dilakukan untuk variable lainnya, yaitu 1:2, 1:4, 1:8, dan 1:16. Pada setiap pergantian variabel pengenceran, juga dilakukan standarisasi dengan larutan blanko. Diagram Faktor Pengenceran VS Optical Density 0.8 0.6



Optical Density 0.4 0.2 0 1:1



1:2



1:4



1:8



1:16



Faktor Pengenceran



Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, dapat dibuat grafik faktor pengenceran terhadap OD.



Laboratorium Teknik



Mikrobiologi



7



Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik



Gambar III.3 Grafik Faktor Pengenceran terhadap Optical Density III.2 Metode Counting Chamber Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mempelajari cara menghitung jumlah sel mikroorganisme dengan metode counting chamber. Metode termasuk metode langsung karena menghitung jumlah sel pada sebagian kecil sampel kemudian dihitung rata-rata jumlah sel per ml. Metode ini mempunyai keuntungan karena hanya membutuhkan waktu yang singkat, mudah, dan tidak memerlukan biaya mahal. Namun apabila tidak diberi pewarnaan khusus, sel hidup atau sel yang mati tidak dapat dibedakan sehingga mengurangi tingkat kepercayaan perhitungan. Pertama-tama 1 gram fermipan (Saccharomyces cerevisiae) dilarutkan dengan aquadest 10 ml lalu diencerkan secara berantai. Larutan fermipan kemudian diambil 1 ml dan diencerkan dengan aquadest hingga 10 ml dan dimasukkan ke tabung A. Dari tabung A diambil 1 ml dan dimasukkan ke tabung B lalu diencerkan dengan aquadest hingga 10 ml. Dari tabung B diambil 1 ml dan dimasukkan ke tabung C lalu diencerkan dengan aquadest hingga 10 ml. Dari tabung C diambil 1 ml dan dimasukkan ke tabung D lalu diencerkan dengan aquadest hingga 10 ml. Dari tabung D diambil 1 ml dan dimasukkan ke tabung BElalu diencerkan dengan aquadest hingga 10 ml. Dari tabung E diambil 1 ml dan dimasukkan ke tabung F lalu diencerkan dengan aquadest hingga 10 ml. Ketika pengenceran, suspensi fermipan diaduk dengan memutar-mutar tabung reaksi dengan telapak tangan. Tujuannya agar larutan menjadi homogen sehingga tidak ada yeast yang terkonsentrasi pada satu titik. Pengadukan tidak boleh dilakukan dengan mengocok tabung reaksi karena dapat menyebabkan sel-selnya mati dan terjadi penumpukan sel. Pengenceran sendiri bertujuan agar bakteri yang akan diamati tidak berkoloni, sehingga mempermudah pengamatan. Hemasitometer dan deck glass yang akan digunakan dibersihkan terlebih dahulu menggunakan alkohol. Hal ini bertujuan untuk membunuh segala mikroorganisme yang ada pada hemasitometer maupun deck glass. Alkohol



Laboratorium Teknik



Mikrobiologi



8



Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik



efektif untuk membunuh bakteri dan jamur, tetapi tidak dengan endospore dan virus yang tidak mempunyai envelope. Mekanisme alkohol digunakan sebagai desinfektan karena alkohol menyebabkan denaturasi protein, dapat merusak membran dan melarutkan lemak, termasuk komponen lemak penyusun lapisan pelindung pada virus. Alkohol cukup baik dalam membunuh mikroorganisme dan mudah menguap serta tidak meninggalkan residu. Selanjutnya menghitung banyaknya sel secara langsung. (Tortora, 2010, hal. 197) Mikroskop berasal dari bahasa Yunani yang terdiri dari micos yang artinya kecil dan scopein yang artinya melihat. Mikroskop merupakan alat bantu yang dapat ditemukan hampir diseluruh laboratorium untuk dapat mengamati organisme berukuran kecil (mikroskopis). Dua karakteristik kunci dari mikroskop adalah magnification, atau kemampuan untuk memperbesar objek, dan resolving power, atau kemampuan untuk menampilkan detail objek. Ada beberapa jenis mikroskop, yaitu mikroskop konvensional, mikroskop cahaya (compound light microscope), dan mikroskop elektron. Mikroskop konvensional adalah mikroskop yang menggunakan cahaya matahari yang dipantulkan melalui cermin sebagai sumber cahaya. Mikroskop cahaya (compound light microscope) adalah mikroskop yang hampir mirip dengan mikroskop konvensional, tetapi sumber cahaya berasal dari lampu elektrik pada mikroskop. Mikroskop elektron adalah mikroskop yang mengunakan elektron sebagai sumber cahaya. Mikroskop elektron dibagi menjadi 2, yaitu Transmission Electron Microscope (TEM) dan Scanning Electron Microscope (SEM). (Cowan, 2016, hal 50-51) Pada percobaan ini, mikroskop yang digunakan adalah mikroskop cahaya (Compound Light Microscope) dengan perbesaran lensa obyektif 40x dan lensa okuler 10x, sehingga perbesaran totalnya 400x. Perbesaran total didapatkan dengan mengalikan perbesaran pada lensa okuler dengan perbesaran pada lensa obyektif. (Cowan, 2016, hal 48) Hemasitometer dapat dikatakan sebagai kaca obyek yang dibuat secara khusus sehingga terdapat jarak antara hemasitometer dengan deck glass yang Laboratorium Teknik



Mikrobiologi



9



Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik



dikenal dengan kedalaman. Pada permukaan hemasitometer terdapat suatu grid dengan luasan tertentu yang digunakan untuk menghitung sel.



(Leboffe, 2011, hal. 219) Gambar III.5 Hemasitometer A



B



E



Gambar III.6 Ruang Hitung D pada Hemasitometer C Pengamatan pada setiap sampel variabel diulang sebanyak tiga kali, kemudian dirata-rata hasilnya. Hal ini untuk menghindari kesalahan perhitungan. Dari percobaan diperoleh data jumlah sel per kotak. Dari data tersebut, dapat dihitung jumlah sel per ml dengan cara : Jumlah sel/ mm3 = jumlah sel rata – rata per kotak (luas per kotak) x tebal Jumlah sel / ml = jumlah sel / mm3 x 1000 (mm3/ml) (Tortora, 2010, hal 178) Setelah dilakukan perhitungan, hemasitometer dan deck glass dibersihkan kembali dengan alkohol untuk membunuh bakteri yang tersisa. Prosedur yang sama dilakukan untuk larutan di tabung E (pengenceran 100.000 kali) dan larutan di tabung F (pengenceran 1.000.000 kali). Pengamatan untuk metode ini hanya pada pengenceran 10.000 kali, 100.000 kali, dan 1.000.000 kali.



Hal ini



dilakukan karena metode counting chamber ini memiliki kekurangan yaitu: 1. Sel mati tidak bisa dibedakan dengan sel hidup,



Laboratorium Teknik



Mikrobiologi



10



Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik



2. Sel kecil sukar terlihat pada mikroskop, sehingga hal ini mengakibatkan sel tersebut terlewatkan atau tidak terhitung, 3. Tingkat ketelitian kurang, 4. Dibutuhkan mikroskop dengan kontras tinggi ketika tidak digunakan pewarnaan terhadap bakteri 5. Metode ini tidak cocok untuk suspensi sel dengan kepekatan atau kekentalan rendah, 6. Sel yang bersifat motile harus dibuat tidak bergerak sebelum dihitung, 7. Debu pada lensa mikroskop sering terhitung sebagai sel mikroorganisme. (Madigan, 2012, hal. 129) Dari data hasil pengamatan dan perhitungan, dapat dibuat grafik yang menyatakan hubungan antara pengenceran dan jumlah sel sebagai berikut : Grafik Hubungan Jumlah Sel dengan Pengenceran 25 20



f(x) = - 0x + 21.85 R² = 0.99



15



Jumlah sel / ml sampel (x105) 10 5 0 0



500000



1000000



Pengenceran (kali)



Gambar grafik III.6 Grafik Jumlah sel dengan Pengenceran Berdasarkan yang Hubungan telah dibuat, diketahui bahwa harga gradiennya negatif. Hal ini menunjukkan bahwa pengenceran berbanding terbalik dengan nilai jumlah sel. Dengan kata lain, semakin besar pengenceran, maka semakin sedikit jumlah sel ragi/ml dalam sampel yang diamati, begitu pula sebaliknya. Hal Laboratorium Teknik



Mikrobiologi



11



Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik



ini juga sesuai pada literatur, yaitu ketika konsentrasi bakteri dalam suatu sampel menurun, maka jumlah sel mikroorganisme juga semakin menurun. (Tortora, 2010, 177) Jawaban Pertanyaan 1. Apa hubungan antara OD dengan jumlah sel pada culture saudara? Optical Density akan berbanding terbalik dengan jumlah sel. Semakin banyak jumlah sel, maka akan semakin banyak pula cahaya yang disebarkan oleh bakteri sehingga nilai transmitannya akan kecil. Hal itu menyebabkan nilai Optical Density menjadi lebih kecil. Begitu pula sebaliknya. 2. Apakah diperlukan untuk membuat suatu hubungan antara perhitungan sel antara metode 1 (dilution) dengan metode 2 (turbidimetri) ? Perlu. Hal ini dikarenakan agar data yang diperoleh dari turbidimetri dapat dinyatakan sebagai konsentrasi mikroorganisme, maka diperlukan suatu kurva standar yang menyatakan korelasi antara kekeruhan biakan dengan jumlah mikroorganisme per volume biakan. Namun, pada praktikum kali ini tidak bisa dilakukan, karena mikroorganisme yang digunakan pada kedua metode berbeda. IV. Kesimpulan IV.1 Metode Turbidimetri Berdasarkan hasil percobaan dengan metode spektrofotometri dapat disimpulkan bahwa nilai Optical Density berbanding terbalik dengan faktor pengenceran, akan tetapi berbanding lurus dengan jumlah sel dalam sampel. IV.2 Metode Counting Chamber Berdasarkan hasil percobaan dengan metode counting chamber dapat disimpulkan bahwa jumlah sel pada pengenceran 10.000x adalah 2.250.000 sel/ml sampel, pada pengenceran 100.000x adalah 1.883.250 sel/ml sampel, dan pada pengenceran 1.000.000x adalah 117.500 sel/ml sampel. Daftar Pustaka



Laboratorium Teknik



Mikrobiologi



12



Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik



Benson. 2001. Microbiological Applications Laboratory Manual 8th Edition. The McGraw Hill Cowan, Marjorie Kelly, et al. 2016. Microbiology Fundamentals A Clinical Approach Second Edition. New York: McGraw Hill Leboffe, Michael J., Pierce, Burton E. 2011. A Photographic Atlas for the Bicrobiology Laboratory 4th Edition. US: Morton Publishing Company Madigan, Michael T. et al. 2012. Brock Biology of Microorganisms 13th Edition. San Francisco: Benjamin Cummings Tortora, Gerard J., Funke, Berdell R. Case, Christine L. 2010. Microbiology an Introduction 10th Edition. US: Benjamin Cummings.



Laboratorium Teknik



Mikrobiologi