Prinsip Spektrofotometer Uv-Vis [PDF]

Citation preview

KIMIA INSTRUMEN (SPEKTROFOTOMETER UV-VIS)



OLEH KELOMPOK III (ADDITIF)



NUR ASMIN/1513141008 NURLAILA/1513141011 RABIANTI/1513140006 ILHAM/1513142005 ANGRIYANI AHMAD/1313141015



JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI MAKASSAR 2017



SEJARAH SPEKTROFOTOMETER UV VIS Spektrofotometri adalah ilmu yang mempelajari tentang penggunaan spektrofotometer.



Spektriofotometer



adalah



alat



yang



terdiri



dari



spektrofotometer dan fotometer. Spektofotometer adalah alah yang digunakan untuk mengukur energi secara relative jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Spektrofotometermenghasilkan sinar dari spectrum dengan panjang gelombang tertentu, dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya



yang



ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopik yang memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (190-380 nm)



dan



sinar



tampak



(380-780



nm)



dengan



memakai



instrumen



spektrofotometer. Spektrofotometri UVVis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Absorbansi cahaya oleh bahan pertama kali dieksplorasi oleh ahli Matematika Jerman Johann Heinrich Lambert (1728-1777) yang menemukan bahwa untuk radiasi monokromatik (dalam radiasi praktek pita sempit) jumlah cahaya yang diserap adalah berbanding lurus dengan panjang jalur cahaya itu melalui material dan tidak tergantung dari intensitas cahaya. Astronom Jerman Wilhelm Beer (1797-1850) memperluas pekerjaan ini dan menemukan bahwa, untuk larutan encer, ada hubungan linier antara konsentrasi analit dan absorbansi. Absorbsi cahaya UV-Vis mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi electron-electron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi berenergi lebih tinggi. Energi yang terserap kemudian terbuang sebagai cahaya atau tersalurkan dalam reaksi kimia. Absorbsi cahaya tampak dan radiasi ultraviolet meningkatkan energi elektronik sebuah molekul, artinya energi yang disumbangkan oleh foton-foton memungkinkan electronelectron itu mengatasi kekangan inti dan pindah ke luar ke orbital baru yag lebih tinggi energinya. Semua molekul dapat menyerap radiasi dalam daerah UVtampak karena mereka mengandung electron, baik sekutu maupun menyendiri,



yang dapat dieksitasi ketingkat energi yang lebih tinggi. Absorbsi untuk transisi electron seharusnya tampak pada panjang gelombang diskrit sebagai suatu spectrum garis atau peak tajam namun ternyata berbeda. Spektrum UV maupun tampak terdiri dari pita absorbsi, lebar pada daerah panjang gelombang yang lebar. Ini disebabkan terbaginya keadaan dasar dan keadaan eksitasi sebuah molekul dalam subtingkat-subtingkat rotasi dan vibrasi. Transisi elektronik dapat terjadi dari subtingkat apa saja dari keadaan dasar ke subtingkat apa saja dari keadaan eksitasi. Karena pelbagi transisi ini berbeda energi sedikit sekali, maka panjang gelombang absorpsinya juga berbeda sedikit dan menimbulkan pita lebar yang tampak dalam spectrum itu. Penggunaan spektroskopi sebagai sarana penentuan struktur senyawa memiliki sejarah yang panjang. Reaksi nyala yang populer berdasarkan prinsip yang sama dengan spektroskopi. Di pertengahan abad ke-19, kimiawan Jerman Robert Wilhelm Bunsen (1811-1899) dan fisikawan Jerman Gustav Robert Kirchhoff (1824-1887) berkerjasama mengembangkan spektrometer. Metoda penyelidikan dengan bantuan spektrometer disebut spektrometri. Dengan sumber cahaya apapun, spektrometer terdiri atas sumber sinar, prisma, sel sampel, detektor dan pencatat. Fungsi prisma adalah untuk memisahkan sinar polimkromatis di sumber cahaya menjadi sinar monokromatis, dan dengan demikian memainkan peran kunci dalam spektrometer. Umumnya spektroskopi dengan sinar ultraviolet (UV) dan sinar tampak (VIS) dibahas bersama karena sering kedua pengukuran dilakukan pada waktu yang sama. Karena spektroskopi UV-VIS berkaitan dengan proses berenergi tinggi yakni transisi elektron dalam molekul, informasi yang didapat cenderung untuk molekul keseluruhan bukan bagian-bagian molekulnya. Metoda ini sangat sensitif dan dengan demikian sangat cocok untuk tujuan analisis. Lebih lanjut, spetroskopi UV-VIS sangat kuantitatif dan jumlah sinar yang diserap oleh sampel diberikan oleh ungkapan hukum



Lambert-Beer.



Dengan



mengukur



transmitans



larutan



sampel,



dimungkinkan untuk menentukan konsentrasinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Karena spektroskopi UV-VIS sangat sensitif dan spektrometernya dapat dibuat dengan ukuran yang sangat kecil, metoda ini khususnya sangat bermanfaat untuk analisis lingkungan, dan khususnya cocok untuk pekerjaan di



lapangan. Hukum Lambert-Beer dipenuhi berapapun panjang gelombang sinar yang diserap sampel. Panjang gelombang sinar yang diserap oleh sampel bergantung pada struktur molekul sampelnya. Jadi spektrometri UV-VIS dapat digunakan sebagai sarana penentuan struktur. Spektroskopi Infra merah (IR) Dibandingkan dengan panjang gelombang sinar ultraviolet dan tampak, panjang gelombang infra merah lebih panjang dan dengan demikian energinya lebih rendah. Energi sinar inframerah akan berkaitan dengan energi vibrasi molekul. Molekul akan dieksitasi sesuai dengan panjang gelombang yang diserapnya. Vibrasi ulur dan tekuk adalah cara vibrasi yang dapat diekstitasi oleh sinar dengan bilangan gelombag (jumlah gelombang per satuan panjang) dalam rentang 1200-4000 cm–1. Hampir semua gugus fungsi organik memiliki bilangan gelombang serapan khas di daerah. Ahli kimia klinis Henry Bence Jones (1813-1873) menggunakan spektroskopi emisi untuk mendeteksi lithium dalam urin dan pada jaringan lain termasuk lensa dihapus dari mata pasien katarak dan bekerja dengan Agustus Dupre (1835-1907), digunakan analisis fluoresensi untuk mendeteksi kina dalam darah dan jaringan lain. Pengenalan spektrofotometer komersial UV pertama, oleh Arnold O. Beckman (1900-2004), Namun, kelompok-kelompok seperti yang dipimpin oleh Bernand B. Brodie (1907-1989) melanjutkan untuk menggunakan instrumen untuk mengembangkan kuantitatif. Brodie mendirikan beberapa aturan dasar untuk sukses meansurement obat dan racun lainnya dalam spesimen biologi, banyak yang masih berlaku hari ini. Seperti dengan pengembangan spektrofotometer UV praktis, kepentingan militer, Kali ini dalam obat antimaterials, juga mendorong kemajuan di spektrophotofluorimetry.



Brodie



dan



Sidney



Udenfriend



(1918-2001)



menggunakan fluorimeter Coleman sederhana filter untuk mengukur quinacrine dalam plasma, tetapi jelas bahwa jika panjang gelombang eksitasi dapat bervariasi banyak molekul lebih dapat dianalisis menggunakan teknik ini. Robert L.



Bowman



(1916-1995)



mengembangkan



spectrophotofluorimeter



monokromator pertama ganda, yang dengan kolaborasi dari Perusahaan Instrumen Amerika, dipamerkan pada Konferensi 1956 Tickets Pittburgh sebagai



AMINO-Bowman SPF. Senyawa organik terkonjugasi menyerap UV (190-400 nm) atau terlihat (400-700 nm) cahaya semakin besar derajat konjugasi semakin besar tingkat penyerapan pada panjang gelombang lebih lama. Dengan demikian, senyawa yang sangat terkonjugasi seperti β-karoten dan hemoglobin menyerap di bagian terlihat spektrum dan berwarna. Senyawa aromatik terkonjugasi kurang menyerap dalam daerah UV spektrum. Namun, kemajuan besar diikuti penemuan fundamental dalam spektrokopi studi tentang penyerapan radiasi elektromagnetik oleh senyawa kimia, dan spektrometri, studi kuantitatif dari fenomena ini. Instrument yang digunakan untuk mempelajari serapan atau emisi radiasi elektromagnetik sebagai fungsi dari panjang gelombang disebut “spectrometer” atau spektrofotometer. Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spectrometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkamsinar dari spectrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas



cahaya



yang



ditransmisikan



atau



yang



diarbsorbsi.



Jadi



spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Kelebihan spektrofotometer dibandingkan dengan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar putih dapt lebih terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma, grating ataupun celah optis. Pada fotometer filter, sinar dengan panjang gelombang yang diinginkandiperoleh dengan berbagai filter denganberbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. Pada fotometer filter, tidak mungkin diperoleh panjang gelombang yang benarbenar monokromatis, melainkan suatu trayekpanjang gelomabang 30-40 nm. Sedangkan pada spektrofotometer, panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spectrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengarbsorbsi untuk larutan sample dan blangko ataupun pembanding. PRINSIP SPEKTROFOTOMETER UV-VIS Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopik yang memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak (380-



780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri UV-Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur transmitansi, reflektansi dan absorbsi dari cuplikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Spektrofotometer UV-Vis menggunakan cahaya sebagai tenaga yang mempengaruhi substansi senyawa kimia. Cahaya yang digunakan merupakan foton yang bergetar dan menjalar secara lurus dan merupakan tenaga listrik dan magnet yang keduanya saling tagak lurus. Tenaga foton bila mmepengaruhi senyawa kimia, maka akan menimbulkan tanggapan (respon), sedangkan respon yang timbul untuk senyawa organik ini hanya respon fisika atau Physical event. Tetapi bila sampai menguraikan senyawa kimia maka dapat terjadi peruraian senyawa tersebut menjadi molekul yang lebih kecil atau hanya menjadi radikal yang dinamakan peristiwa kimia atau Chemical event. Sehingga dari uraian maka prinsip dasar dari spektrofotometer UV-Vis adalah didasarkan pada interaksi antara materi dengan radiasi elektromagnetik. Prinsip kerja spektrofotometer UV-VIS didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Cahaya dari sumber cahaya diuraikan oleh monokromator, kemudian cahaya monokromator dilewatkan pada sampel. Cahaya ini sebagian diserap oleh sampel dan sebagian lagi dilewatkan yang kemudian ditangkap oleh detektor yang diubah menjadi sinyal-sinyal listrik yang kemudian diterjemahkan oleh alat pengukur dan kemudian ditampilkan dengan kuantitasnya. Besar energi yang diserap tertentu dan menyebabkan elektron tereksitasi yang memiliki energi yang lebih tinggi. Serapan tidak terjadi seketika pada daerah ultraviolet-visible untuk semua struktur elektronik, tetapi hanya pada sistem-sistem terkonjugasi, struktur elektronik dengan adanya ikatan 𝜋 dan non bonding elektron. Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan pada hukum Lambert Beer, yaitu bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It).



Cara kerja alat spektrofotometer UV-Vis yaitu dimana sinar dari sumber radiasi diteruskan menuju monokromator. Cahaya dari monokromator diarahkan terpisah melalui sampel dengan sebuah cermin berotasi. Detektro menerima cahaya dari sampel secara bergantian secara berulang-ulang, sinyal listrik dari detektor diproses, diubah ke digital dan dilihat hasilnya, selanjutnya perhitungan dilakukan dengan komputer yang sudah terprogram. Secara



sederhana



Instrumen



spektrofotometri



yang



disebut



spektrofotometer terdiri dari : sumber cahaya – monokromator – sel sampel – detektor – read out (pembaca).



Fungsi masing-masing bagian: 1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan berbagai macam rentang panjang gelombang. Untuk sepktrofotometer 



VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram







UV-VIS menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator.



2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monaokromatis. Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalan gratting atau lensa prisma dan filter optik. Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah menjadi spektrum cahaya. Sedangkan filter optik berupa lensa berwarna sehingga cahaya yang diteruskan sesuai dengan warnya lensa yang dikenai cahaya. Ada banyak lensa warna dalam satu alat yang digunakan sesuai dengan jenis pemeriksaan. 3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel



UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca dan plastik



dapat



menyerap



UV



sehingga



penggunaannya



hanya



pada



spektrofotometer sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan lebar 1 cm. 4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya menjadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor : 



Kepekaan yang tinggi







Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi







Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.







Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.







Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.



5. Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik yang berasal dari detektor. Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam spektrofotometri: a. Pada saat pengenceran alat-alat pengenceran harus betul-betul bersih tanpa adanya zat pengotor. b. Dalam penggunaan alat-alat harus betul-betul steril. c. Jumlah zat yang harus dipakai harus sesuai dengan yang telah ditentukan. d. Dalam penggunaan spektrofotometri uv, sampel harus jernih dan tidak keruh. e. Dalam penggunaan spektrofotometri uv-vis, sampel harus berwarna. Serapan dapat terjadi jika foton atau radiasi yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga. Jika sinar monokratik dilewatkan melalui suatu lapisan larutan dengan ketebalan (db), maka penurunan intensitas sinar (dl) karena melewati lapisan larutan tersebut berbanding langsung dengan intensitas radiasi (l), konsentrasi spesiaes yang menyerap (c), dan dengan ketebalan lapisan larutan (db). Secara matematis, pernyataan ini dapat dituliskan: -dl = klcdb



Bila diintegralkan maka diperoleh persamaan berikut: I = I0 e-kbc dan bila persamaan diatas diubah menjadi logaritma basisi 10, maka akan diperoleh persamaan: I = I0 10-kbc dimana : k/2,303 = a maka persamaan diatas dapat diubah menjadi persamaan: log I0/I = abc



atau



A = abc (Hukum Lambert-Beer)



dimana : A = Absorban a = absorptivitas b = tebal kuvet (cm) c = konsentrasi bila Absorbansi (A) dihubungkan dengan Transmittan (T) = I/I0 maka dapat diperoleh A = log



1 𝑇



. Absorptivitas (a) merupakan konstanta yang tidak



tergantung pada konsentrasi, tebal kuvet, dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel. Tetapi bergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang radiasi. Cahaya yng diserap diukur dengan absorbansi (A) sedangkan cahaya yng dihamburkan diukur sebagai transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum lambertbeer atau Hukum Beer, berbunyi: “Jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal larutan”. Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk menghitung banyaknya cahaya yang hamburkan:



𝑰𝒕



T = 𝑰𝒐



atau



𝑰𝒕



%T = 𝑰𝒐  100%



dan absorbansi dinyatakan dengan rumus: A= - log T = -log



𝑰𝒕 𝑰𝒐



dimana I0 merupakan intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah intensitas cahaya setelah melewati sampel. Rumus yang diturunkan dari Hukum Beer dapat ditulis sebagai: A= a . b . c atau A = ε . b . c



dimana: A



= absorbansi



b/l



= tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga umumnya 1 cm)



c



= konsentrasi larutan yang diukur



ε



= tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam



molar) a



= tetapan absorptivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam ppm).



Faktor-faktor yang sering menyebabkan kesalahan dalam menggunakan spektrofotometer dalam mengukur konsentrasi suatu analit: 1. Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk warna. 2. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa, namun kuvet dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik. 3. Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan.



APLIKASIH SPEKTROFOTOMETER UV VIS Prinsip Kerja Spektrofotometer Uv-Vis Prinsip kerja spektrofotometri UV-Vis adalah interaksi yang terjadi antara energy yang berupa sinar monokromatis dari sumber sinar dengan materi yang berupa molekul. Besar energy yang diserap tertentu dan menyebabkan electron tereksitasi dari ground state ke keadaan tereksitasi yang memiliki energy lebih tinggi. Serapan tidak terjadi seketika pada daerah ultraviolet-visible untuk semua struktur elektronik tetapi hanya pada system-sistem terkonjugasi, struktur elektronik dengan adanya ikatan p dan non bonding electron. Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan hukum Lambert Beer, bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It). Berdasarkan teori tersebut, pinsip kerja dari alat ini adalah suatau cahaya monokromatik akan melalui suatu media yang memiliki suatu konsentrasi tertentu, maka sakan membentuk spectrum cahaya, namun ketika melewati monokromator, cahaya yang keluar hanya akan terdapat satu cahaya yaitu yang sesuai dengan setting awal, misalnya warna hijau. Setelah keluar dari monokromator, cahaya akan menembus sampel atau larutan yang kemudian menuju detector dimana cahaya yang di hasilkan dari sampel akan di ubah menjadi listrik yang kemudian akan terbaca hasil pada read out (monitor). Spectrum cahaya yang dapat terlihat oleh mata terentang antara 400 nm sampai 800 nm. Pada tekhnik sptrofotometri, cahaya dari sumber cahaya diuraikan menggunakan prisma sehingga di peroleh cahaya monokromatis yang diserap oleh zat yang akan diperiksa. Cahaya monokromatis merupakan cahaya satu warna dengan satu panjang gelombang, sehingga cahaya yang diserap oleh larutan berwarna dapat diukur. Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah



cahaya



tampak



(visible).



Cahaya



visible



termasuk



spektrum



elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat



oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible). Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan



sebagai



sumber



lampu.



Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilii warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil. Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein). Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin. Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sample. Warna yang diserap oleh suatu senyawa merupakan warna komplementer dari warna yang teramati. Beberapa warna yang diamati dan warna komplementernya terdapat pada tabel berikut ini : PANJANG



WARNA



WARNA



GELOMBANG



TERLIHAT



KOMPLEMENTER



700



Inframerah



Sinar dari sumber cahaya akan dibagi menjadi dua berkas oleh cermin yang berputar pada bagian dalam spektrofotometer. Berkas pertama akan melewati kuvet berisi blanko, sementara berkas kedua akan melewati kuvet berisi sampel. Blanko dan sampel akan diperiksa secara bersamaan. Adanya blanko, berguna untuk menstabilkan absorbsi akibat perubahan voltase dari sumber cahaya. Berdasarkan teknik optika sinar, terdiri dari: 1. Spektrofotometer Optika Sinar Tunggal (Single Beams Optic). a.



Semua cahaya melewati seluruh sel sampel.



b. Contoh alat spektrofotometer single beam adalah spektronik 20. c.



Alat ini merupakan desain paling awal tetapi masih banyak digunakan baik dalam pengajaran maupun laboratorium industry



2. Spektrofotometer Optika Sinar Ganda (Double Beams Optic). a.



Cahaya terbagi ke dalam dua arah/berkas.



b.



Berkas cahaya pertama melewati sel pembanding, dan cahaya yang lainnya melewati sel sampel.



c.



Berkas cahaya kemudian bergabung kembali, masuk ke detektor.



d.



Detektor merespon cahaya netto dari kedua arah.



e.



Beberapa alat double beam memiliki dua detektor, sampel dan sinar penghubung diukur pada waktu yang sama.



Cara Kerja Spektrofotometer Uv-Vis Spektroskopi UV-Vis digunakan untuk cairan berwarna. Sehingga sampel yang akan diidentifikasi harus diubah dalam senyawa kompleks. Analisis unsur berasal dari



jaringan



tanaman, hewan, manusia harus diubah dalam



bentuk larutan, misal analisis



kafein dalam kopi bubuk di kota manado



menggunakan spektrofotometri uv-vis. Sampel kopi menggunakan 6 jenis kopi bubuk yang ada di kota Manado. Iden tifikasi dilakukan



dengan metode parry, sedangkan



kadar kafein ditentukan menggunakan spektrofotometerUVVis. Hasil identifi kasi menunjukkan bahwa 6



sampel



kopi



seluruh



bubuk



yang



ada



dikota



Manado mengandung kafein.



Spectra elektronik senyawaan dalam fasa uap kadang-kadang menunjukkan struktur halus vibrasi yang dapat teramati, namun dalam fasa-fasa mampat, tingkat energy molekul demikian terganggu oleh tetanggga-tetangga dekatnya, sehingga sering kali hanya tampak pita lebar. Semua molekul dapat menyerap radiasi dalam daerah UV-tampak karena mereka mengandung electron, baik sekutu maupun menyendiri, yang dapat dieksitasikan ke tingkat energy yang lebih tinggi. Panjang gelombang pada absorpsi akan terjadi bergantung pada betapa kuatnya electron itu terikat dalam molekul. Ada



jurnal



lain



dari



kelompok



saya



yaitu:



adaptif probe serat optik untuk spektrofotometer genesys 10s uv-vis generasi kedua. Dalam hal ini



mepreparasi



sampel



dengan



cara



mebuat



diencerkan menjadi 5 variasi konsentrasi. Hasil absorbansi Panjang



dan gelombang



panjang maksimum



tertinggi dimana Rhodamin B dapat menyerap



larutan pengujian



RHodamin



B



dan



menghasilkan



nilai



gelombang merupakan cahaya secara



maksimum. puncak maksimum.



Jarak Celah Probe Optik 0.2 cm dan 0,4 cm. adapun juranla yang lainnya yaitu: Penetapan levofloksasin dalam sediaan tablet dengan metode spektrofotometri UV-VIS. Pelarut yang digunakan adalah akuabidestilata. Panjang gelombang pengukuran 289 nm. Validasi metode yang dilakukan meliputi keterulangan, linearits, batas deteksi, batas kuantitasi dan ketelitian. Ketepatan diuji dengan penetuan nilai recovery dengan metode penambahan baku. Metode diaplikasikan untuk menetapkan kadar levofloksasin dalam sediaan farmasi tablet.



Electron dalam suatu ikatan kovalen tunggal terikat dengan kuat, dan diperlukan radiasi berenergi tinggi atau panjang gelombang pendek, untuk eksitasinya. Misalnya, alkana, yang hanya mengandung ikatan tunggal C – H dan C – C tidak menunjukkan serapan di atas 160 nm. Metana menunjukkan suatu puncak pada 122 nm yang ditandai sebagai *. Ini berarti bahwa suatu electron



dalam orbital ikatans-stransisi (bonding) sigma dieksitasikan ke orbital anti ikatan (antibonding) sigma. Jika suatu molekul mengandung sebuah atom seperti klor yang mempunyai pasangan electron menyendiri, sebuah electron tak terikat (nonbonding) dapat dieksitasikan ketingkat energy yang lebih tinggi. Karena electron nonbonding tak terikat terlalu kuat seperti electron bonding sigma, maka absorbsinya terjadi pada panjang gelimbang yang lebih panjang. Electron dalam ikatan rangkap dan ganda tiga agak mudah dieksitasikan ke orbital yang lebih tinggi. Suatu transisi * bila sebuah electron pi ditingkatkan dari suatup-pdilambangkan dengan orbital bonding-pi ke suatu orbital antibonding pi. Penyerapan energy dalam transisi semacam itu biasanya lebih intensif daripada dalam *. Dalam molekul tergonjugasi (yakni molekul yang memilikis-stransisi ikatan-ikatan rangkap berselang seling dengan ikatan rangkap) absorbs bergeser ke panjang gelombang yang lebih panjang. Prosedur Pemakaian Spektrofometer 1. Putar tombol on-off (disebelah kira) kekanan. Biarkan 15 menit untuk memanaskan alat. Atur tombol sampai menunjuk angka nol pada petunjuk %T. 2. Putar tombol pengatur panjang gelombang (yang ada di sebelah atas alat) untuk memilah panjang gelombang sesuai panjang gelombang yang diinginkan. 3. Masukkan kuvet yang berisi paling sedikit 3 ml aquadest kedalam tempat sampel (sebelum memasukkan kuvet, pastikan kuvet dalam keadaan kering dengan mengeringkannya dengan kertas tissue (tutup penutup sampel. 4. Putar tombol pengatur cahaya (tombol yang terletak disebelah kanan) sehingga %T menunjuk angka 100 atau A menunjuk angka nol. 5. Angkat kuvet yang berisi aquadest deri tempat sampel dengan tutup. Ganti isi kuvet dengan larutan lampu, baca serapannya. 6. Ganti larutan blanko dalam kuvet dengan larutan standar atau larutan uji, baca serapannya. Hal-Hal Yang Harus Diperhatikan Dalam Analisis Spektrofotmetri Uv-Vis 1. Pada tiap pemeriksaan jangan lupa menutup tempat kuvet 2. Tabung kuvet yang akan dibaca harus dalam keadaan bersih.



3. Bila pada dinding tabung kuvet terdapat udara, hilangkan dengan menjentik-jentikkan tabung dengan jari. 4. Jangan sampai menumpahakan cairan yang diperiksa kedalam lubang tempat kuvet atau pada alat. 5. Pastikan bahwa larutan yang akan diperiksa sudah tercampur dengan baik sebelum dilakukan pengukuran. 6. Pengukuran selalu di kerjakan dalam duplo. 7. Penetapan pada panjang gelombang yang berbeda pada tiap panjang gelombang alat harus di tera dengan aquadest (A) harus menunjuk angka nol atau 100%T Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometri Uv-Vis terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis dengan spektrofotometri Visibel Karena senyawa tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi senyawa yang berwarna. Berikut adalah tahapan-tahapan yang harus diperhatikan : a) Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis hal ini perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan merubah menjadi senyawa lain atau direaksikan dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi beberapa persyaratan yaitu: 



Reaksinya selektif dan sensitive







Reaksinya cepat, kuantitatif dan reprodusibel (ajeg)







Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama



Keselektifan dapat dinaikkan dengan mengatur pH, pemakaian masking agent, atau penggunaan teknik ekstraksi. b) Waktu operasional (operating time) Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu operasional ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan. Pada saat awal terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna ini meningkat smpai waktu tertentu hingga diperoleh absorbansi yang stabil.



Semakin lama waktu pengukuran, maka ada kemungkinan senyawa yang berwarna tersebut menjadi rusak atau terurai sehingga intensitas warnanya turun akibatnya absorbansinya juga turun. Karena alasan inilah, maka untunk pengukuran senyawa berwarna (hasil suatu reaksi kimia) harus dilakukan pada saat waktu operasional. c) Pemilihan panjang gelombang Panjang gelombvang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang ynag mempunyai absorbansi maksimal. Untuk memilih panjang gelombang maksimal, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsenterasi tertentu. Kadang-kadang dijumpai keadaan yang mana pemakaian panjang gelombang maksimal kurang baik. Hal ini karena karena misalnya, selain zat yang akan dianalisis, juga terdapat zat lain yang mempunyai absorbansi pada panjang gelombang tersebut. Ada beberapa variable yang dapat mempengaruhi absorbansi yaitu jenis pelarut, pH larutan, suhu, konsentrasi dan zat-zat pengganggu. d) Pembuatan kurva baku Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianilisis dengen berbagai konsenterasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi (y) dengan konsentrasi (X). bila hokum Lamber-Beer terpenuhi, maka kurva baku berupa garis lurus. e) Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan Absorban yang terbaca pada spektrofotometri hendaknya antara 0,2 sampai 0,8 atau 15% sampai 70% jika dibaca sebagai transmitansi. Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa kesalahan dalam pembacaan T adalah 0,005 atau 0,5% (kesalahan fotometri) Proses Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri Ketika cahaya dengan panjang berbagai panjang gelombang (cahaya polikromatis) mengenai suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu saja yang akan diserap. Di dalam suatu molekul yang memegang peranan penting adalah elektron valensi dari setiap atom yang ada hingga terbentuk suatu



materi. Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi), berputar (rotasi) dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi. Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahan elektron dari keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron ini disebut transisi elektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah cahaya inframerah maka elektron yang ada dalam atom atau elektron ikatan pada suatu molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi). Sedangkan gerakan berputar elektron terjadi pada energi yang lebih rendah lagi misalnya pada gelombang radio. Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi suatu suatu yang ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam sel sampel disinari dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. Ketika cahaya mengenai sampel sebagian akan diserap, sebagian akan dihamburkan dan sebagian lagi akan diteruskan. Pada spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang mengenai permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang dapat diukur adalah It/I0 atau I0/It (perbandingan cahaya datang dengan cahaya setelah melewati materi (sampel)). Proses penyerapan cahaya oleh suatu zat dapat digambarkan sebagai berikut: Gambar Proses penyerapan cahaya oleh zat dalam sel sampel. dari gambar terlihat bahwa zat sebelum melewati sel sampel lebih terang atau lebih banyak di banding cahaya setelah melewati sel sampel Kalibrasi Spektrofotometri Uv-Vis Yang perlu dikalibrasi adalah panjang gelombang dan absorbansi. a. Kalibrasi Panjang gelombang Menggunakan filter gelas helium oksida yang mempunyai panjang gelombang acuan (nm) , pasang filter gelas holium oksida pada kompartemen sampel dan kompartemen pembanding dibiarkan kosong (udara) , Scan spektrum serapan holium oksida, bandingkan panjang gelombang spektrum yang diperoleh dengan data panjang gelombang acuan. b. Kalibrasi Absorbans



Buat larutan kalium dikromat 50 + 0,5 mg dalam 1 liter 0,005 mol/L asam sulfat (larutan A) , Buat larutan kalium dikromat 100 + 1 mg dalam 1 liter 0,005 mol/L asam sulfat (larutan B) , buat larutan 0,005 mol/L asam sulfat sebagai pembanding dan bandingkan hasilnya dengan data acuan (+ 2%) c. Cara Pemeliharaan Cara pemeliharaan spektrofotometer UV Vis adalah kompartment sampel selalu dibersihkan, suhu penyimpanan stabil, meja permanen, gunakan stabilizer, masukkan kuvet tegak lurus, alat harus selalu diperiksa, kuvet yang digunakan harus bersih. Sebelum digunakan, biarkan mesin warming-up selama 15-20 menit. Spektrofotometer sebisa mungkin tidak terpapar sinar matahari langsung, karena cahaya dari matahari akan dapat mengganggu pengukuran. Simpan spektrofotometer di dalam ruangan yang suhunya stabil dan diatas meja yang permanen. Pastikan kompartemen sampel bersih dari bekas sampel. Saat memasukkan kuvet, pastikan kuvet kering. Lakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban secara teratur. d. Aplikasi UV / Vis spektroskopi secara rutin digunakan dalam kuantitatif penentuan larutan dari logam transisi ion dan sangat dikonjugasikan senyawa organik, studi fotoelektrokimia lapisan tipis CdS hasil deposisi metode CBD, meneliti pengaruh kelembaban terhadap absorbansi optik lapisan gelatin dan dalam penentuan konsentrasi suatu larutan yang belum diketahui konsentrasinya menggunakan larutan standar. Aplikasi Spektrofotometri UV-Vis 1. Analisis kuantitatif a. Penetapan Fe(II) sebagai kompleks dengan o-fenantrolin (VIS) b. Penetapan nitrat dalam makanan daging olahan c. Penetapan kafein dalam berbagai kemasan minuman kaleng 2. Titrasi Fotometri Mendeteksi titik ekivalen titrasi, dimana analit, pereaksi, atau hasil titrasi mengabsorbsi radiasi 3. Analisis



Kadar



Asam



Spektrofotometri UV-Vis



Benzoat



dan



Kafein



Menggunakan



Metode



Analisis kadar asam benzoat dan kafein menggunakan metode spektrofotometri UV-Vismenggunakan instrumen Spektrofotometer UV-Visible Pharmaspec UV-1700 merek Shimadzu. Kurva kalibrasi asam benzoat dibuat dari larutan standar asam benzoat 5 ppm, 10 ppm, dan 20 ppm.Kurva kalibrasi kafein dibuat dari larutan standar 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm dan 50 ppm. Aspek kualitatif dan kuantitatif spektrofotometri UV-Vis Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif. i.



Aspek kualitatif Data spektra UV-Vis secara tersendiri tidak dapat digunakan untuk



identifikasi kualitatif obat atau metabolitnya.Akan tetapi jika digabung dengan cara lain seperti spektroskopis infra merah,resonansi magnet inti, dan spektroskopis massa, maka dapat digunakan untuk maksud identifikasi / analisis kualitatif suatu senyawa tersebut.Data yang diperoleh dari spektroskopis UV dan Vis adalah panjang gelombang maksimal,intensitas,efek pH, dan pelarut; yang semuanya itu dapatyang sudah dipublikasikan (publissed data ). ii.



Aspek kuantitatif Dalam aspek kuantitatif,suatu berkas radiasi di kenakan pada cuplikan



(larutan sampel) dan intensitas sinar radiasi yang di teruskan di ukur besarnya. Radiasi yang di serap oleh cuplikan di tentukan dengan membandingkan intensitas sinar yang di teruskan dengan intensitas sinar yang di serap jika tidak ada spesies penyerap lainnya. Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui suatu satuan luas pensmpsng perdetik.Serapan dapat terjadi jika foton /radiasi yang mengenai cuplikan memiliki energy yang sama dengan energy yang di butuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga.Kekuatan



radiasi



juga



mengalami



penurunan



dengan



adanya



penghamburan dan pemantulan cahaya, akan tetapi penurunana karena hal ini snagat kecil di bandingkan dengan proses penyerapan.