Proposal Kelompok 4 - C - Minyak Atsiri [PDF]

Citation preview

IDENTIFIKASI KOMPONEN PENYUSUN MINYAK ATSIRI DARI KULIT JERUK PURUT (Citrus histrix) SERTA UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP Staphylococcus aureus dan Escherichia coli



Nama Kelompok : 1. Sely Nugrahaning Putri



(1041811120)



2. Venita Lutfia Ningrum



(1041811130)



3. Windi Laksmita



(1041811133)



4. Yasirli Amrine



(1041811135)



SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI YAYASAN PHARMASI SEMARANG PROGRAM STUDI S1 FARMASI 2021



ii



DAFTAR ISI



DAFTAR ISI..................................................................................................................................ii BAB I .............................................................................................................................................. 1 PENDAHULUAN ......................................................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang ...................................................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah ................................................................................................................. 2 1.3 Batasan Masalah ................................................................................................................... 2 1.4 Tujuan Penelitian .................................................................................................................. 2 1.5 Manfaat Penelitian ................................................................................................................ 2 BAB II ............................................................................................................................................. 4 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................................................... 4 2.1 Definisi Minyak Atsiri .......................................................................................................... 4 2.2 Jeruk Purut............................................................................................................................. 4 2.3 Minyak Atsiri Kulit Jeruk Purut .......................................................................................... 6 2.4 Destilasi Uap Air................................................................................................................... 7 2.5 Kromatografi Gas-Spektrometri Massa ............................................................................... 8 2.6 Staphylococcus aureus ......................................................................................................... 8 2.6.1 Defenisi Staphylococcus aureus ................................................................................... 8 2.6.2 Klasifikasi Staphylococcus aureus ............................................................................... 9 2.6.3 Morfologi Staphylococcus aureus ................................................................................ 9 2.6.4 Patogenitas Staphylococcus aureus ........................................................................... 10 2.7 Escherichia coli ................................................................................................................... 10 2.7.1 Definisi Escherichia coli ............................................................................................. 10 2.7.2 Klasifikasi Dan Morfologi .......................................................................................... 11 2.7.3 Patogenitas ................................................................................................................... 12 BAB III ......................................................................................................................................... 13 METODE PENELITIAN .......................................................................................................... 13 3.1 Jenis Penelitian .................................................................................................................... 13 3.2 Obyek Penelitian ................................................................................................................. 13



iii



3.2.1 Sampel dan Teknik Sampling ..................................................................................... 13 3.2.2 Alat ............................................................................................................................... 13 3.2.3 Bahan ........................................................................................................................... 13 3.3 Variabel Penelitian .............................................................................................................. 13 3.3.1 Variabel Bebas ............................................................................................................. 13 3.3.2 Variabel Terikat ........................................................................................................... 14 3.3.3 Variabel Kontrol .......................................................................................................... 14 3.4 Rancangan Penelitian ......................................................................................................... 14 3.4.1 Isolasi Minyak Atsiri Jeruk Purut (Citrus histrix) ..................................................... 14 3.4.2 Uji Aktifitas Antibakteri ............................................................................................. 14 3.5 Pengukuran Zona Hambat .................................................................................................. 15 3.6 Analisis Kualitatif Kromatografi Gas dan Spektrokopi Massa (GC-MS) ....................... 16 3.7 Analisis Data ....................................................................................................................... 16 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................. 17



1



BAB I PENDAHULUAN



1.1 Latar Belakang Minyak atsiri atau dikenal sebagai minyak eteris (aetheric oil) merupakan hasil dari metabolisme sekunder suatu tanaman. Aroma yang dimiliki minyak atsiri bergantung dari jenis tanaman penghasilnya, selain itu minyak atsiri dari tanaman yang berbeda juga memiliki kandungan zat yang tidak sama. Minyak atsiri pada umumnya mengandung beberapa komponen senyawa seperti Citronelal, Citronelol, Limonen, βPinene dan sabinene (Muhtadin et al, 2013). Kulit jeruk merupakan salah satu limbah yang dapat diolah dan menghasilkan produk yang memiliki nilai jual tinggi berupa minyak atsiri. Minyak atsiri kulit jeruk diperoleh dengan cara destilasi, karena prosesnya mudah dan tidak mahal. Destilasi yang dilakukan menggunakan destilasi uap air langsung, dimana sampel dan air berada di tempat yang sama dengan sekat diantara keduanya. Proses destilasi ini terjadi di dalam ketel dimana uap air mengalir menuju tumpukan bahan tumbuh-tumbuhan sehingga minyak atsiri tersuling bersama-sama dengan uap air. Setelah pengembunan minyak atsiri akan membentuk lapisan yang terpisah dengan air selanjutnya minyak yang dihasilkan dikumpulkan (Guenther 1987). Jeruk purut (Citrus histrix) adalah tanaman yang banyak dijumpai sehingga mudah dijangkau oleh masyarakat. Tanaman ini berasal dari genus Citrus merupakan tanaman penghasil minyak atsiri. Tumbuhan ini merupakan tumbuhan perdu yang biasanya dimanfaatkan buah dan daunnya sebagai bumbu penyedap masakan. Dalam perdagangan internasional dikenal sebagai kaffir lime (Miftahendrawati, 2014). Escherichia coli merupakan bakteri gram negatif yang menyebar secara mudah dari tangan yang menyentuh makanan atau air yang telah terkontaminasi dan menyebabkan adanya transfer gen secara horizontal. Sedangkan, Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif penyebab infeksi tersering di dunia. Tingkat keparahan infeksinya pun bervariasi, mulai dari infeksi minor di kulit (furunkulosis dan impetigo), infeksi traktus urinarius, infeksi trakrus respiratorius, sampai infeksi pada mata dan Central Nervous System (CNS) (DeLeo FR, 2010).



2



Penelitian ini perlu dilakukan, sebab masih jarang ditemukannya pemanfaatan kulit jeruk purut sebagai antibakteri dari bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Kulit jeruk purut memiliki kandungan minyak atsiri salah satunya senyawa limonen. Menurut (Vuuren & Viljoen, 2007; Zahi et al., 2015; Zahi et al., 2017) limonen telah dilaporkan memiliki aktivitas antibakteri. Sehingga kulit jeruk purut memiliki potensi dan dapat digunakan masyarakat sebagai bahan alami yang dapat digunakan sebagai antibakteri. 1.2 Rumusan Masalah 1. Bagaimana hasil analisis komponen minyak atsiri kulit jeruk purut (Citrus histrix) menggunakan GC-MS ? 2. Apakah minyak atsiri kulit jeruk purut (Citrus histrix) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli ? 1.3 Batasan Masalah 1. Bagian tanaman yang digunakan adalah kulit jeruk purut (Citrus histrix) 2. Proses ekstraksi kulit jeruk purut (Citrus histrix) menggunakan metode destilasi uap 3. Pengujian aktivitas antibakteri menggunakan bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli 4. Identifikasi komponen minyak atsiri kulit jeruk purut (Citrus histrix) menggunakan GC-MS 1.4 Tujuan Penelitian 1. Untuk mengetahui hasil identifikasi komponen minyak atsiri kulit jeruk purut (Citrus histrix) menggunakan GC-MS 2. Untuk mengetahui aktivitas daya hambat minyak atsiri kulit jeruk purut (Citrus histrix) terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli 1.5 Manfaat Penelitian 1. Dapat mengetahui adanya aktivitas antibakteri dari minyak atsiri kulit jeruk purut (Citrus histrix)



3



2. Menambah wawasan mengenai limbah buangan kulit jeruk untuk mendapatkan manfaat lainnya



4



BAB II TINJAUAN PUSTAKA



2.1 Definisi Minyak Atsiri Minyak atsiri atau minyak esensial ini hamper diperoleh dari seluruh bagian tanaman, diantaranya adalah bunga, daun, biji, kulit kayu, buah, kulit buah, akar atau rimpang. Minyak atsiri adalah salah satu metabolit sekunder dari tanaman yang berbentuk minyak dengan karakteristik yaitu mudah menguap (volatile). Kandungan utama dari minyak atsiri yang dimiliki hamper seluruh tanaman adalah terpen, aseton, fenol, aldehid, alcohol, ester dan asam (Valentine S. dan Rimadani P., 2017).



2.2 Jeruk Purut



Menurut (Levang, 1991, Ortiz, 2002 dan Tjitrosoepomo, 2010), klasifikasi jeruk purut adalah sebagai berikut : Divisi



: Spermatophyta



Sub divisi



: Angiospermae



Kelas



: Dicotyledoneae



Bangsa



: Rutales



Suku



: Rutaceae



Sub Suku



: Aurantioideae



Marga



: Citrus



Jenis



: Citrus hystrix D.C Tanaman jeruk purut (Citrus hystrix D. C) merupakan salah satu dari



suku rutaceae. Citrus hystrix yang disebut 'limau purut' di Malaysia, 'jeruk purut' di Indonesia dan 'som makrut' di Thailand. Tanaman ini berasal dari Asia dan dibudidayakan di seluruh bagian dunia yang lebih hangat (Nor, 1999). Jeruk purut



5



memiliki kulit buah dengan aroma wangi yang agak keras. Ukuran buahnya lebih kecil dari kepalan tangan, bentuknya bulat tetapi banyak tonjolan dan berbintil. Kulit buahnya tebal dan berwarna hijau tua polos atau berbintik-bintik (Simanihuruk, 2013). Tanaman ini mempunyai ciri-ciri fisik yang khas, baik pada penampilan buah maupun daunnya sehingga mudah dikenali. Tinggi tanaman ini sekitar 3 -5 m Buahnya berukuran lebih kecil dari kepalan tangan manusia atau berdiameter sekitar 5 7,5 cm, berbentuk seperti buah pir, berkulit tebal dengan karakter permukaannya yang berkerut-kerut, berwarna hijau. Buah yang masak benar akan berwarna sedikit kekuningan. Daging buah berwarna kekuningan, mempunyai rasa yang sangat asam dan kadang-kadang agak pahit (Wijaya, 2010 dan Othman, 2016). Bagian kulit luar buah ini disebut flavedo karena adanya kandungan flavonoid. Sedangkan kulit bagian dalam disebut albedo nama yang berasal dari latin (albus = putih) memiliki warna kuning gading atau kuning pucat dan kenyal dalam tekstur (Ortiz, 2002). Buah jeruk memiliki beberapa lapisan, antara lain: a) Exocarp atau flavedo, yang merupakan bagian terluar buah, warnanya yang sebagian besar tergantung pada suhu di mana ia berkembang. Bagian ini mengandung kelenjar minyak esensial yang diproduksi oleh buah. b) Endocarp, yang merupakan bagian terdalam dari pericarp dan merupakan bagian dari membran locular. c) Mesocarp atau albedo, yang merupakan bagian antara, berwarna putih dan bernas (Ancillo dan Medina, 2015). Daun jeruk perut ini berbentuk khas yakni berbentuk oval dan memiliki ujung yang tumpul serta tangkai daun bersayap lebar yang terlihat seperti dua daun yang berjajar. Daun jeruk purut ini berwarna hijau kekuningan juga memiliki aroma yang sangat segar (Sarwono dalam Wijaya. 2010).



Bagian atas daun memiliki warna lebih gelap dari pada bagian bawah



daun (Ortiz, 2002). Akar tanaman jeruk berupa akar tunggang dengan 2 fungsi utama sebagai pelekat pada tanah dan sebagai penyerapan. Kedalaman akar tergantung pada batang bagian bawah di dalam tanah. Di tanah berpasir, sistem akar dapat menembus hingga 5 atau 6 m, sedangkan pada tanah liat sistem akar akan lebih dangkal. Kemudian untuk batang khususnya yang bagian bawah dan bagian percabangannya biasanya ada yang menyatu diatas tanah tetapi ada pula cabang utama beada di ketinggian yang berbeda. Hal ini bergantung pada varietas pohon. Kanopi pohon dibentuk oleh sistem percabangan ditambah daun. Tunas muda biasanya memiliki duri yang kuat. Duri



6



adalah cabang yang dimodifikasi, dengan kumpulan pembuluh darah, memiliki kuncup pada kapak mereka (Ortiz, 2002).



2.3 Minyak Atsiri Kulit Jeruk Purut Minyak atsiri merupakan senyawa yang pada umumnya berwujud cairan, diperoleh dari bagian tanaman, akar kulit, batang, daun, buah, biji, maupun dari bunga dengan cara penyulingan. Minyak atsiri juga bias diperoleh dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut organic atau dengan cara dipress (Hardjono,S., 2004). Menurut penelitian yang dilakukan oleh A. Sry Iryani dan Agustina Deka (2018) menjelaskan kandungan yang diperoleh dari minyak atsiri kulit jeruk purut dari uji GC-MS menunjukan adanya 27 komponen yang teridentifikasi dari minyak atsiri kulit jeruk purut dan 4 komponen besar dengan puncak tertinggi yakni limonene sebesar 16,45%, sabinene sebesar 11,13%, β-citronellol sebesar 8,25% dan citronellal sebesar 7,64%. No.



Komponen Kimia



Kandungan



1.



α-pinene



2,94%



2.



Sabinene



11,13%



3.



Β-pinene



1,15%



4.



Limonene



16,45%



5.



D-carene



0,72%



6.



γ-terpenine



2,01%



7.



α-terpinole



1,20%



8.



Linalool



3,64%



9.



Cyclohexen



0,08%



10.



Citronella



7,64%



11.



Isopulegol



0,60%



12.



Β-citronellol



8,25%



13.



Geraniol



0,55%



14.



Perilla alcohol



0.08%



15.



Citronello acid



0,26%



7



16.



Octenoic acid



0,34%



17.



D-elemene



0,98%



18.



β-elemene



1,22%



19.



Dodecanal



0,14%



20.



Trans-caryophyllene



0,13%



21.



Germacrene-β



0,59%



22.



α-humulene



0,11%



23.



Germacrene-β



0,79%



24.



Β-selinene



0,21%



25.



α-farnesene



4,69%



26.



Spathulenol



0,08%



27.



α-sinensal



0,21%



Total



66,19%



2.4 Destilasi Uap Air Destilasi Uap Air adalah metode destilasi yang bertujuan untuk memisahkan suatu substansi dari campurannya yang tidak saling campur atau menurunkan titik didih komponen campuran yang memiliki titik didih tinggi dengan bantuan uap air. Air akan masuk kedalam jaringan sel tanaman yang mengakibatkan pecahnya dinding sel tanaman sehingga minyak yang terkandung didalamnya akan terdorong keluar. Destilasi uap air ada yang dilakukan secara langsung, ada pula yang dilakukan secara terpisah. Hal ini tergantung pada peletakan sampel. Dimana untuk destilasi uap air secara langsung, sampel diletakan diatas sekat yang dibawahnya sudah terdapat air. Sedangkan untuk cara terpisah sampel dan air diletakan pada dua tempat berbeda (Abdjul, dkk., 2021). Minyak atsiri yang dihasilkan dari proses penyulingan, bukanlah suatu senyawa murni, melainkan minyak tersebut merupakan suatu campuran dengan beberapa senyawa organic lainnya. Dari percobaan yang dilakukan Sari, dkk (2013) menggunakan destilasi uap air langsung dengan lama waktu destilasi selama 3-4 jam terhitung dari destilat pertama turun menghasilkan rendemen sebesr 0,26%. Hidayati (2012) memvariasikan lama waktu dan suhu destilasi uap air secara tidak langsung yang berpengaruh terhadap rendemen dan kadar limonene pada minyak atsiri kulit jeruk Pontianak.



8



2.5 Kromatografi Gas-Spektrometri Massa Kromatografi Gas (KG) adalah jenis kromatografi yang dipakai dalam kimia organic untuk memisahkan senyawa dan analisis. Pemisahan senyawa berdasarkan perbandingan distribusinya terhadap fasa diam dan fasa gerak. Komponen yang mudah menguap maupun komponen yang stabil terhadap panas akan bermigrasi melalui kolom yang berisi fasa diam dengan suatu kecepatan yang tergantung pada rasio distribusinya. Senyawa yang lebih terdistribusi pada fasa diam akan tertahan dan keluar dari kolom dengan waktu yang lebih lama daripada senyawa yang terdistribusi pada fase gerak (Rohman dan Gandjar, 2007). Kadar suatu senyawa dalam sampel dapat ditentukan dengan kromatografi gas dengan cara membandingkan antara luas senyawa dengan jumlah luas sampel, kadar senyawa diberikan dalam bentuk prosentase dengan persamaan Persen (%) Komponen = Luas komponen / Jumlah luas semua sampel X 100% Spektrometri massa merupakan metode analisis kualitatid suatu senyawa berdasarkan pola fragmentasinya. Senyawa yang dianalisis dengan spektrometri massa akan diubah menjadi ion molecular yang kemudian akan dipecah berdasarkan pola fragmentasinya (Day dan Underwood, 1999). Fragmen-fragmen disusun menurut kenaikan massa fragmentasinya (m/z atau m/e), yaitu dari kiri ke kanan, sedangkan intensitas puncak sebanding dengan kelimpahan fragmennya. Kelimpahan fragmen tersebut didasarkan pada kestabilan. Kestabilan dipengaruhi oleh kemampuannya untuk beresonansi. Semakinstabil suatu fragmen maka kelimpahan relatifnya akan semakin tinggi (Supratman, 2010).



2.6 Staphylococcus aureus 2.6.1 Defenisi Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus merupakan bakteri fakultatif anaerob. Bakteri ini tumbuh pada suhu optimum 37 ºC, tetapi membentuk pigmen paling baik pada suhu kamar (2025 ºC). Koloni pada perbenihan padat berwarna abu-abu sampai kuning keemasan, berbentuk bundar, halus, menonjol, dan berkilau. Lebih dari 90% isolat klinik menghasilkan S. aureus yang mempunyai kapsul polisakarida atau selaput tipis yang berperan dalam virulensi bakteri (Jawetz et al., 2008). Pada lempeng agar, koloninya



9



berbentuk bulat, diameter 1-2 mm, cembung, buram, mengkilat dan konsistensinya lunak. Pada lempeng agar darah umumnya koloni lebih besar dan pada varietas tertentu koloninya di kelilingi oleh zona hemolisis (Syahrurahman et al., 2010). 2.6.2 Klasifikasi Staphylococcus aureus Menurut Syahrurahman et al., (2010) klasifikasi Staphylococcus aureus adalah sebagai berikut : Domain



: Bacteria



Kingdom



: Eubacteria



Ordo



: Eubacteriales



Famili



: Micrococcaceae



Genus



: Staphylococcus



Spesies



: Staphylococcus aureus



2.6.3 Morfologi Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram-Positif berbentuk bulat berdiameter 0,7-1,2 μm, tersusun dalam kelompok-kelompok yang tidak teratur seperti buah anggur, fakultatif anaerob, tidak membentuk spora, dan tidak bergerak. Berdasarkan bakteri yang tidak membentuk spora, maka S.aureus termasuk jenis bakteri yang paling kuat daya tahannya. Pada agar miring dapat tetap hidup sampai berbulan-bulan, baik dalam lemari es maupun pada suhu kamar. Dalam keadaan kering pada benang, kertas, kain dan dalam nanah dapat tetap hidup selama 6-14 minggu (Syahrurahman et al., 2010).



Gambar 1. Staphylococcus aureus (Toelle dan Lenda., 2014)



10



2.6.4 Patogenitas Staphylococcus aureus Sebagian bakteri S.aureus merupakan flora normal pada kulit, saluran pernafasan, dan saluran pencernaan makanan pada manusia. Bakteri ini juga ditemukan di udara dan lingkungan sekitar. S.aureus yang patogen bersifat invasif, menyebabkan hemolisis, membentuk koagulase, dan mampu meragikan manitol. S.aureus yang terdapat di folikel rambut menyebabkan terjadinya nekrosis pada jaringan setempat (Jawetzet al., 2008). Toksin yang dihasilkan dari S.aureus (Staphilotoksin, Staphylococcal enterotoxin, dan Exfoliatin) memungkinkan organismeini untuk menyelinap pada jaringan dan dapat tinggal dalam waktu yang lama padadaerah infeksi, menimbulkan infeksi kulit minor (Bowersox, 2007). Koagulasi fibrin di sekitar lesi dan pembuluh getah bening, sehingga terbentuk dinding yang membatasi proses nekrosis. Selanjutnya disusul dengan sebukan sel radang, di pusat lesi akan terjadi pencairan jaringan nekrotik, cairan abses ini akan mencari jalan keluar di tempat yang resistensinya paling rendah. Keluarnya cairan abses diikuti dengan pembentukan jaringan granulasi dan akhirnya sembuh (Syahrurahman et al., 2010). Staphylococcus aureus menyebabkan sindrom infeksi yang luas. Infeksi kulit dapat terjadi pada kondisi hangat yang lembab atau saat kulit terbuka akibat penyakit seperti eksim, luka pembedahan, atau akibat alat intravena (Gillespieet al, 2008). Infeksi S.aureus dapat juga berasal dari kontaminasi langsung dari luka, misalnya infeksi pasca operasi Staphylococcus atau infeksi yang menyertai trauma. Jika S.aureus menyebar dan terjadi bakterimia, maka dapat terjadi endokarditis, osteomielitis hematogenous akut, meningitis atau infeksi paru-paru. Setiap jaringan ataupun alat tubuh dapat diinfeksi oleh bakteri S.aureus dan menyebabkan timbulnya penyakit dengan tanda-tanda yang khas, yaitu peradangan, nekrosis dan pembentukan abses. S.aureus merupakan bakteri kedua terbesar penyebab peradangan pada rongga mulut setelah bakteri Streptococcus alpha. S.aureus menyebabkan berbagai jenis peradangan pada rongga mulut seperti parotitis, cellulitis, angular cheilitis, dan abses periodontal Djais (Najlah, 2010).



2.7 Escherichia coli 2.7.1 Definisi Escherichia coli



11



Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif, tidak berspora, motil berbentuk flagel peritrik, berdiameter ± 1,1 – 1,5 µm x 0,2 – 0,6 µm. E. coli dapat bertahan hidup dimedium sederhana menghasilkan gas dan asam dari glukosa dan memfermentasi laktosa. Pergerakan bakteri ini motil, tidak motil, dan peritrikus, ada yang bersifat aerobik dan anaerobik fakultatif (Elfidasari et al. 2011). 2.7.2 Klasifikasi Dan Morfologi Klasifikasi bakteri Escherichia coli : Kingdom



: Bacteria



Divisi



: Proteobacteria



Classis



: Gammaproteobacteria



Ordo



: Enterobacteriales



Family



: Enterobacteriaceae



Genus



: Escherichia



Species



: Escherichia coli



Bakteri E. coli adalah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif fakultatif anaerobic yang mempunyai alat gerak berupa flagel dan tersusun dari sub unit protein yang disebut flagelin, yang mempunyai berat molekul rendah dengan ukuran diameter 12-18 nm dan dengan panjang 12 nm, kaku dan berdiameter lebih kecil dan tersusun dari protein, pili dapat berfungsi sebagai jalan pemindahan DNA saat konjugasi. Selain itu, mempunyai kapsul atau lapisan lendir yang merupakan polisakarida tebal dan air yang melapisi permukaan luar sel (Ikmalia 2008). Bakteri E. colimempunyaitiga jenis antigen, yaitu antigen O, antigen K dan atigen H. Antigen-O yang merupakan inti dari lipopolisakarida dan unit-unit polisakarida, biasnya antigen-O berhubungan dengan penyakit khusus pada manusia, misalnya tipe spesifik O dari E. coli ditemukan pada diare. Antigen-K yang merupakan kapsul dari polisakarida, sedangkan antigen-H merupakan antigen flagella (Wibowo et al. 2008).



12



2.7.3 Patogenitas Bakteri E. coli adalah salah satu bakteri yag digunakan sebagai indikator adanya kontaminasi feces dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air, makanan, dan minuman. E. coli menjadi patogen jika jumlah bakteri dalam saluran pencernaan meningkat atau berada di luar usus, menghasilkan enterotoksin sehingga menyebabkan terjadinya bebarapa infeksi yang berasosiasi dengan enteropatogenik kemudian menghasilkan enterotoksin pada sel epitel. Manifestasi klinik infeksi oleh E. coli bergantung pada tempat infeksi dan tidak dapat dibedakan dengan gejala infeksi yang disebabkan oleh bakteri lain (Ismail 2012).



13



BAB III METODE PENELITIAN



3.1 Jenis Penelitian Jenis penelitian ini dilakukan secara eksperimental. Penelitian dilakukan meliputi pengumpulan bahan baku dalam proses isolasi minyak atsiri kulit jeruk purut (Citrus histrix). Pengujian aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli dan Staphilococcus aureus. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Yayasan Pharmasi Semarang.



3.2 Obyek Penelitian 3.2.1 Sampel dan Teknik Sampling Sampel yang digunakan adalah jeruk purut (Citrus histrix) yang diambil dari Kec. Weleri, Kab. Kendal, Provinsi Jawa Tengah. Teknik sampling yang digunakan dalam penelitian ini adalah teknik sampling acak atau random sampling, dimana setiap sampel memiliki kesempatan yang sama untuk di uji. 3.2.2 Alat Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah seperangkat alat destilasi uap, corong pisah, erlenmeyer, neraca analitik, gelas ukur, botol tempat minyak atsiri, aluminium foil, cakram kertas saring, cawan petri,mikro pipet, api bunsen, rotari evaporator, dan seperangkat alat GC-MS. 3.2.3 Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu kulit jeruk purut, bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli, etanol 96%, amoksisilin, nutrien agar, kalsium klorida (CaCl2) anhidrat, natrium klorida (NaCl)..



3.3 Variabel Penelitian 3.3.1 Variabel Bebas



14



Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi minyak atsiri kulit jeruk purut (Citrus histrix) 3.3.2 Variabel Terikat Variabel terikat dalam penelitian ini adalah uji aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. 3.3.3 Variabel Kontrol Variabel kontrol dalam penelitian ini adalah sterilitas dan kemurnian minyak atsiri jeruk perut (Citrus histrix), suhu inkubasi, pengukuran yang tepat pada zona hambat aktivitas bakteri staphylococcus aureus dan escherichia coli, Validasi Kromatografi Gas dan Spektrokopi Massa (GC-MS).



3.4 Rancangan Penelitian 3.4.1 Isolasi Minyak Atsiri Jeruk Purut (Citrus histrix) Metode yang digunakan untuk mengisolasi minyak atsiri adalah destilasi uap. Kulit buah jeruk purut segar sebanyak ± 4,5 kg di destilasi secara bertahap, setiap kali destilasi menggunakan ±2 dan 2,5 kg kulit buah jeruk purut segar. Kulit buah jeruk purut dipotong kecil-kecil, dimasukkan ke dalam dandang yang telah berisi air. Hasil dari destilasi uap adalah campuran minyak dengan air yang selanjutnya minyak dibebaskan dari sisa-sisa air dalam corong pisah. Destilat ditambahkan natrium klorida (NaCl) agar minyak yang teremulsi terpisah. Minyak atsiri yang di dapatkan kemudian ditambahkan dengan CaCl2 untuk mengikat air agar didapatkan minyak murni. Minyak atsiri yang diperoleh, kemudian dianalisis



menggunakan Kromatografi gas-



spektroskopi massa (KG-SM) serta digunakan untuk uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphilococcus aureus. 3.4.2 Uji Aktifitas Antibakteri a. Pembuatan Media Agar Sebanyak 4 gram serbuk Nutrien Agar (NA) dimasukkan ke dalam gelas erlenmeyer dan ditambahkan 200 mL aquades. Selanjutnya dipanaskan di atas penangas air sampai mendidih dan diaduk dengan magnet stirer sampai homogen.



15



b. Pembuatan Suspensi Bakteri Stok kultur dari bakteri uji (Escherichia coli dan Staphilococcus aureus), dibiakkan di dalam 50 mL media nutrien broth yang terdapat di dalam erlenmeyer. Biakan ini kemudian diinkubasi pada temperatur 37°C selama 24 jam. Selanjutnya biakan dapat digunakan dalam uji aktivitas antibakteri. c. Uji Aktivitas Antibakteri Pengujian aktivitas antibakteri minyak atsiri kulit buah jeruk purut dilakukan pada konsentrasi 100 ppm ; 75 ppm ; 50 ppm ; dan 25 ppm. Sebanyak 1ml larutan biakan aktif bakteri dimasukan kedalam cawan petri steril dan ditambahkan 10ml media nutrient agar yang telah dicairkan. Setelah itu dihomogenkan dengan cara digoyang (membentuk angka 8) dan dibiarkan hingga memadat. Kertas cakram steril direndam dalam minyak atsiri kulit buah jeruk purut dengan konsentrasi 100 ppm ; 75 ppm ; 50 ppm ; dan 25 ppm selama 30 menit kemudian diletakan diatas permukaan media. Kontrol positif yang digunakan adalah Amoxycillin 250 ppm sedangkan Etanol 96% sebagai kontrol negatif. Ketas cakram tersebut kemudian diletakan diatas permukaan media bakteri menggunakan pinset dan ditekan sedikit. Media bakteri yang sudah terdapat senyawa bakteri diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Diameter zona hambat yang terbentuk diukur menggunakan penggaris untuk menentukan efektifitas antibakteri. Zona bening yang terbentuk diukur diameternya dengan jangka sorong. (Volk dan Wheeler, 1993).



3.5 Pengukuran Zona Hambat Luas zona hambat dihitung dengan rumus sebagai berikut : Lz = Lav - Ld Dimana : Lz = Luas zona hambat (mm) Lav = Luas zona hambat dengan kertas saring (mm) Ld = Luas diameter kertas saring (mm) Kategori zona hambat menurut Susanto, dkk (2012) antara lain adalah : Diameter



Kekuatan daya hambat



16



≤5 mm



Lemah



6 – 10



Sedang



11 – 20



Kuat



≥ 21 mm



Sangat Kuat



3.6 Analisis Kualitatif Kromatografi Gas dan Spektrokopi Massa (GC-MS) Minyak atsiri selanjutnya dianalisis mengunakan GC-MS dengan pengaturan sebagai berikut : gas helium sebagai gas pembawa, kecepatan alir gas 1 mL/min, temperatur injektor 300oC sampai 180oC pada 4oC /min kemudian 180 oC sampai 250oC pada 10oC. Spektra massa direkam pada 30 sampai 450 m/z.



3.7 Analisis Data Data yang diperoleh berupa nilai diameter zona hambat hasil uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan menggunakan uji anova (Yitnosumarto, 1993). Untuk mengetahui pengaruh konsentrasi minyak atsiri terhadap aktivitas antibakteri Escherichia coli dan Staphilococcus aureus apabila :  Fhitung ≥ Ftabel maka perlakuan variable kosentrasi minyak atsiri terdapat pengaruh sehingga H0 ditolak berarti variasi konsentrasi berpengaruh pada aktivitas antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphilococcus aureus.  Fhitung ≤ Ftabel maka variasi konsentrasi minyak atsiri terdapat pengaruh sehingga H0 diterima.



17



DAFTAR PUSTAKA



Abdjul N, M. Paputungan, dan S. Duengo. 2012. Analisis Komponen Minyak Atsiri Pada Tanaman Nilam Hasil Destilasi Uap Air Dengan Menggunakan KG-SM. A.Sry Iryani & Agustina deka. 2018. Pembuatan Minyak Atsiri Dari Kulit Jeruk Purut (Citrus Hystrix) dengan metode ekstraksi. Prosiding Seminar Hasil Penelitian (SNP2M). Bowersox, J. 2007. Experimental Staph Vaccine Broadly Protective in Animal Studies. Polish Journal of Microbiology. Day dan Underwood. 1999. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga. DeLeo. FR, M. Otto, B. N. Kreiswirth, and H.F Chambers. 2010. Community-associated meticillin-resistant



Staphylococcus



aureus.Laboratory



of



Human



Bacterial



Pathogenesis, Rocky Mountain Laboratories, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Hamilton, MT 59840, USA. Elfidasari, D. et al., 2011. Perbandingan Kualitas Es di Lingkungan Universitas Al Azhar Indonesia dengan Restoran Fast Food di Daerah Senayan dengan Indikator Jumlah Escherichia coli Terlarut. Jurnal Al-Azhar Indonesia Seri Sains dan Teknologi, Vol.1(No.1). Gandjar, I. Dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Gillespie & Bamford. 2008. Mikrobiologi Medis dan Infeksi Edisi Ketiga.Jakarta : Erlangga. Guenther, E. 1987. Minyak Atsiri jilid I (Terjemahan). Jakarta : UI Press. Hidayati. 2012. Distilasi Minyak Atsiri Dari Kulit Jeruk Pontianak dan Pemanfaatannya Dalam Pembuatan Sabun Aromatik. Ikmalia, 2008. Analisa Profil Protein Isolat Escherichia coli S1 Hasil Iradiasi Sinar Gamma[Skripsi]. Jakarta : Fakultas sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta Ismail, D. 2012. Uji Bakteri Escherichia coli Pada Minuman Susu Kedelai Bermerek dan Tanpa merek di kota surakarta. Naskah publikasi, Fakultas Kedokteran. Universitas Muhammadiyah Surakarta. Jawetz et al., 2008.Medical Microbiology. 24th ed. North America: Lange Medical book. Levang, Patrice Dan Hubert De Foresta. 1991. Economic Plants Of Indonesia. Bogor : Orstom & Seameo Biostrop.



18



Miftahendrawati. 2014. Efek Antibakteri Ekstrak Daun Jeruk Purut (Citrus hystrix) Terhadap Bakteri Streptococcus mutans (in vitro), Skripsi, Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Hasanuddin Makassar, Makassar Muhtadin, A.F. Wijaya,R. Prihatini.P dan Mahfud.2013. Pengambilan Minyak Atsiri dari Kulit Jeruk Segar dan Kering dengan Menggunakan Metode Steam Distillation. Jurnal Teknologi POMITS. Vol.2 No.1. Surabaya : Institut Teknologi Sepuluh November. Najlah,F.L. 2010. Efektifitas ekstrak daun jambu biji daging buah putih (psidium guajava Linn) pada konsentrasi 5%, 10%, dan 15% terhadap zona radikal bakteri Staphylococcus aureus. Skripsi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta. Nor, O. M. 1999. Volatile Aroma Compounds In Citrus Hystrix Oil. Trop. Agric. And Fd. Sc. Ortiz, Jesus M. 2002. Botany : Taxonomy, Morphology And Physiology Of Fruits, Leaves And Flowers. In G. Dugo. & A. D. Giacomo, Citrus (P.16). London: Taylor And Francis. Othman, Sna, Dkk. 2016. Essential Oils From The Malaysian Citrus (Rutaceae) Medicinal Plants. Medicines Review. Sari, R., F.N.A. Mustari., dan S. Wahdaningsih. 2013. Aktivitas Antibakteri Minyak Atsiri Kulit Jeruk Pontianak Terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. ISSN : 1410-5918 Sastrohamidjojo, Hardjono. 2004. Kimia Minyak Atsiri. Yogyakarta : Gadjah Mada University Press. Simanihuruk, N. 2013. Ekstraksi Minyak Atsiri Dari Kulit Jeruk Purut (Citrus Hystrix D, C.) Di Balai Latihan Transmigrasi Pekanbaru Sebagai Bahan Aktif Minyak Gosok. Pengolahan Hasil Pertanian. Supratman. U., 2010. Elusidasi Struktur Senyawa Organik. Bandung: Widya Padjajaran. Susanto, D. S., dan Rega. 2012. Studi Kandungan Bahan Aktif Tumbuhan Meranti Merah (Shorea lepsula Miq) Sebagai Sumber Senyawa Antibakteri. Mulawarman scientifie. 11 (2) 181-190 Syahrurahman, A., et al. 2010. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran. Edisi Revisi. Binarupa Aksara Publisher.Jakarta Tjitrosoepomo, G. 2010. Taksonomi Tumbuhan (Spermatophyta). Yogyakarta : Gajah Mada University Press.



19



Toelle, N.N., et al. 2014. Identifikasi dan Karakteristik Staphylococcus Sp dan Streptococcus Sp dari Infeksi Ovarium Pada Ayam Petelur Komersial. Jurnal Ilmu Ternak Politeknik Pertanian Negeri Kupang. Valentine S. & Rimadani P. 2017. Review Artikel : Pemanfaatan Minyak Atsiri Pada Tanaman Sebagai Aromaterapi Dalam Sediaan-Sediaan Farmasi. Farmaka. Vol.15 No. 2 Volk dan Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar Jasad V. Jakarta: Erlangga. Vuuren, S. F. van, & Viljoen, A. M. 2007. Antimicrobial activity of limonene enantiomers and 1,8-cineole alone and in combination. Flavour and Fragrance Journal, 22(6), 540– 544. Wibowo, R M. haryadi & Wahyui, agnesia endang trihapsari, 2008. Studi Patogenisitas Eschericia coli Isolat Unggas pada Ayam Pedaging Umur 15 Hari. Jurnal Veteriner, Vol.9 No.2, pp.87–93. Wijaya, C. 2010. Potensi Pemanfaatan. Food Review Indonesia, 54-57. Yitnosumarto. 1993. Percobaan Perancangan Analisa dan Interpretasi. Jakarta: Penerbit PT. Gramedia Pustaka Utama. Zahi, M. R., Liang, H., & Yuan, Q. 2015. Improving the antimicrobial activity of d-limonene using a novel organ gel-based nano emulsion. Food Control, 50, 554–559. Zahi, M. R., El Hattab, M., Liang, H., & Yuan, Q. 2017. Enhancing the antimicrobial activity of d-limonene nano emulsion with the inclusion of ε-polylysine. Food Chemistry, 221, 18–23.