Stem Cell [PDF]

Citation preview

Nomer ID Klaster Tipe Penelitian



LAPORAN AKHIR HASIL PENELITIAN RISET UNGGULAN KLASTER TAHUN ANGGARAN 2009



Pembentukan tim sel punca Universitas Gadjah Mada dan Isolasi, purifikasi, dan plurifikasi progenitor adult stem sel



Tim Peneliti drh. Yuda Heru Fibrianto, MP., PhD. dr. Arief Budiyanto, PhD., SpKK. dr. Rahadyan, PhD., SpOT, FICS.



KLASTER KEDOKTERAN - KESEHATAN UNIVERSITAS GADJAH MADA 2009



UGM/RU/2008/ Kesehatan Kesehatan



HALAMAN PENGESAHAN USUL PENELITIAN HIBAH KLASTER



1.



Judul



2.



Peneliti a. Nama Lengkap b. NIP c. Jenis Kelamin d. Golongan/ Jabatan Fungsional e. Strata Pendidikan f. Fakultas/Jurusan g. Bidang lmu h. Alamat Kantor i. Telepon/Faks j. E-mail k. Alamat Rumah Telepon/Faks Anggota a. Peneliti 1 b. Peneliti 2



3.



4. 5.



Jangka Waktu Penelitian Pembiayaan



: Pembentukan tim stem sel Universitas Gadjah Mada dan Isolasi, purifikasi, dan plurifikasi progenitor adult stem sel : drh. Yuda Heru Fibrianto, MP., PhD. : 132139520 : Laki-laki : III c / Lektor Kepala : S3 : Kedokteran Hewan : Fisiologi : Jl. Fauna 2 Karangmalang Yogyakarta : 0274 560864 / 0274 560861 : [email protected] : Kebondalem I No. 1 Magelang Jawatengah : 0293364723 : dr. Arief Budiyanto, PhD., SpKK : dr. Rahadyan Magetsari, PhD., SpOT., FICS : 7 bulan Rp 150.000.000,00 (seratus limapuluh juta rupiah)



Menyetujui, Ketua klaster Kedokteran-Kesehatan,



Prof. dr. Suparyati Soenarto, PhD., SpA(K) NIP. 194402051974122001



Yogyakarta, 20 Maret 2009 Ketua Peneliti,



drh. Yuda Heru Fibrianto, MP., PhD. NIP. 196902181995121001



Menyetujui, Ketua Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat UGM



Prof.Dr-Tech.Ir. Danang Parikesit, MSc. NIP. 196506031990031002



ABSTRAK



Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan tim sel punca Universitas Gadjah Mada dan tekhnik isolasi dan plurifikasi adult stem sel untuk mendapatkan sel linenya. Tim ini terdiri dari gabungan staf peneliti dari fakultas kedokteran hewan, kedokteran, farmasi, biologi dan peternakan. Tim sel punca UGM ini dikelompokkan menjadi tiga kelompok kerja dari litbang, etika dan klinis sesuai dengan keahliannya. Adult stem sel diambil dari darah plasenta yang telah dimintakan inform consent dan etikal clearance dari pasien yang melahirkan. Tim sel punca Fakultas Kedokteran telah terbentuk dengan ketua Prof. Samekto sedangkan unit pelayanan sel punca RS. Dr. Sardjito juga telah terbentuk dengan ketua Dr. Hasto Wardoyo, SpOG (K). Kultur sel punca dari darah plasenta dan wharton jelly tengah dilakukan. Sel feeder yang berasal dari kulit sisa sirkumsisi yang telah diberi inform consent telah dilakukan dan dibudidayakan sehingga terbentuk sel line-nya. Darah plasenta telah diberi heparin dibawa kelaboratorium dan dilakukan sentrifugasi 200G selama 30 menit sebanyak 2 kali, supernatan dan buffy coat dipipisahkan ke tabung 50 ml dan disentrifuse 3000 G selama 30 menit. Supernatan dibuang dan buffy coat yang tertinggal dicuci dengan DMEM + 10 % fetal bovine serum (FBS), 1 mM glutamine, 25 mM NaHCO3, 1% minimal essential medium (MEM) larutan asam amino nonessential, 1% larutan penicillin-streptomycin-antimycotic dan disentrifuse selama 30 menit. Supernatan dibuang dan sisanya dikultur kedalam feeder sel dengan pertumbuhan/konfluensi 50% kedalam inkubator 5%CO2 pada suhu 38°C dan kelembamam 5% CO2 dan 95% udara. Setelah 15 menit, cairan dan darah dicuci dan diganti dengan medium baru dan diamati setiap hari. Pada heri ke 7, telah terbentuk koloni sel astrosit yang diduga adalah mesenchimal sel. Setiap 7 hari media diganti dan sel diamati setiap hari. Data hasil penelitian ditampilkan secara deskriptif Wharton Jelly yang didapat dari tali pusat juga juga ditanam. Setelah dicuci dengan media DMEM + 10% serum, wharton jelly di triming dan dimasukkan kedalam kultur disk yang mengandung feeder sel confluensi 50% dan dimasukkan kedalam inkubator 5%CO2 pada suhu 38°C dan kelembamam 5% CO2 dan 95% udara. Setiap 7 hari media diganti dan sel diamati setiap hari. Pada hari ini juga telah telihat pertumbuhan sel astrosit yang diduga sel mesenchimal. Hasil dilaporkan secara deskriptif.



A. PENDAHULUAN 1. Latar Belakang (permasalahan dan manfaat) Banyak penyakit kritis pada manusia tidak dapat diobati dan disembuhkan oleh tekhnologi kedokteran yang paling baru sekarang ini. Penyakit ini sering merusak organ manusia yang hasilnya menyebabkan organ manusia tersebut secara normal tidak dapat berfungsi secara normal. Para peneliti yakin bahwa stem cell manusia adalah obat yang sangat baik untuk menyembuhkan penyakit kritis tersebut. Stem sel adalah sumber dari semua sel di dalam individu, dan ini merupakan sebuah sumber bagi pengobatan sel. Pengobatan sel sekarang ini merupakan sebuah jalan revolusi untuk mengatasi penyakit dan kerusakan dengan keuntungan medis yang luas. Pengobatan stem sel mempunyai potensi penerapan dalam mengatasi berbagai penyakit dan kelemahan dari otak, organ dalam, tulang dan banyak jeringan lainnya. Contoh penyakit ini meliputi stroke, alzheimer’s, Parkinson, penyakit jantung, osteoporosis, diabetes yang tergantung insulin, leukimia, luka bakar dan kerusakan sunsum tulang belakang. Baru-baru ini, penelitian dari stem sel dewasa beserta aplikasinya telah diperbolehkan dilakukan di Indonesia, dan beberapa sudah dipraktekkan untuk pengobatan penyakit infark jantung, tetapi penelitiannya masih belum dijalankan dengan intensif sehingga masih sangat diperlukan untuk penelitian dengan seksama. 2. Keaslian Penelitian adult stem sel di indonesia pada manusia belum pernah dilakukan. 3. Tujuan Membuat tim yang siap dan mumpuni dalam penelitian dan pelayanan stem sel di UGM serta diperolehnya sel line dari adult stem sel. B. STUDI PUSTAKA Stem sel (sel punca) adalah sumber dari semua sel di dalam individu, dan ini merupakan sebuah sumber bagi pengobatan sel yang sekarang ini merupakan sebuah jalan revolusi untuk mengatasi penyakit dan kerusakan dengan keuntungan medis yang luas. Sel punca dapat dikategorikan menjadi 2 macam kategori besar berdasarkan sumbernya yaitu sel punca dewasa yang berasal dari organisme dewasa dan sel punca embrio, sel punca yang berasal dari inner sel mass embrio stadium blastula. Sel punca dewasa dan embrio dapat digunakan untuk pengobatan stem cell (Bongso dkk., 2005). Di Indonesia telah dimulai penelitian dan pengobatan stem stem dengan menggunakan adult stem sel (Permenkes, 2009), hal ini dikarenakan adult stem sel tidak menemui hambatan yang dikarenakan masih adanya ketidakjelasan tentang etika mengenai embrionik stem sel. Adult stem sel yang banyak diteliti adalah stem sel mesenkimal dan hematopoietik stem sel. Adult stem sel mesenkim (MSCs) merupakan wakil dari tipe adult stem sel yang memberikan variasi sel termasuk osteosit, chondrosit, adiposit dan bentuk lain dari sel jaringan ikat lain seperti dalam tendon (Beyer dan Meireles, 2006). Sedangkan hematopoiesis adalah perwakilan dari adult stem



sel yang merupakan pioneer stem sel. Penelitian akhir-akhir ini telah mengindikasikan bahwa sel mesenkim ini mampu berdifferensiasi menjadi sel jantung ataupun sel lain yang bukan berasal dari mesodermal seperti sel hati dan saraf apabila menemukan lingkungan yang cocok untuk pertumbuhannya (Wagner dkk., 2005; 2006). Hematopoietic stem cells (HSCs) adalah precursor multipotent yang mempunyai kapasitas memperbaharui diri sendiri dan berkemampuan untuk meregenerasi semua tipe sel berbeda yang menyusun sistem pembentuk darah (Bonnet, 2002; McCulloch and Till, 2005). Transplantasi HSC membentuk dasar dari pengobatan konsolidasi dalam penanganan kangker dan digunakan untuk mengobati atau memperbaiki sejumlah gangguan hematologik dan genetis (Shizuru et al., 2005; Steward and Jarisch, 2005). Dengan beberapa keberatan (McCormack and Rabbitts, 2004), HSC juga sebuah target attraktif sel populasi untuk pengobatan gen karena dengan mudah dapat diperoleh untuk dimodifikasi genetik ex vivo dan memberikan untuk kemungkinan menopang ekspresi transgene dalam sel darah tepi sirkulasi sepanjang kehidupan dari sebuah individu (Hawley, 2001; Moayeri et al., 2005). Identifikasi dan pengkayaan HSC dapat dilakukan dengan melihat atau mendeteksi penanda sel permukaan. Semua aktivititas HSC pada sunsum tulang tikus dewasa terkandung dalam populasi sel yang ditandai dengan ekspresi dari reseptor c-kit tyrosine kinase (reseptor untuk faktor stem sel, SCF), antigen-1 stem sel (Sca-1, Ly-6A/E), kadar rendah dari Thy-1.1 antigen permukaan sel (Thy-1.1 lo), dan tidak ada atau kadar rendah dari ekspresi dari banyak antigen permukaan sel ditemukan pada sel yang berdiferensiasi ke berbagai turunan (Shizuru et al., 2005). HSC tikus secara variabel mengexpresikan sialomucin CD34, tergantung pada stadium perkembangan dan siklus sel (Ito et al., 2000; Matsuoka et al., 2001; Sato et al., 1999). Penelitian telah mengidentifikasi sejumlah antigen permukaan sel tambahan yang menandai HSC tikus, meliputi: keluarga TIE dari reseptor tyrosine kinase (Arai et al., 2004); endoglin, sebuah reseptor growth faktor penyokong perubahan (Chen et al., 2002); endomucin, sebuah sialomucin mirip CD34 (Matsubara et al., 2005); CD150, anggota dari keluarga reseptor SLAM (Kiel et al., 2005; Yilmaz et al., 2006); CD201, reseptor protein C endothel (Balazs et al., 2006); dan prion protein (Zhang et al., 2006b). reseptor untuk thrombopoietin (TPO), c-Mpl, juga terekspresi pada 70% c-Kit Lin Sca-1 HSC (Solar et al., 1998). Pada manusia, protokol klinis meliputi pengkayaan untuk HSC umumnya menggunakan ekspresi CD 34 (Civin et al., 1996b; Shizuru et al., 2005), dimana diekspresikan pada 0,2-3% dari sel inti pada darah tali pusat, sunsum tulang dan darah tepi yang dikerahkan (Civin et al., 1984; Krause et al., 1996; Sutherland et al., 1996). Populasi HSC yang diperkaya secara rutin diperoleh dengan seleksi positif untuk CD34/CD133 dan/atau dengan penipisan turunan sel, menggunakan monoklonal antibodi penanda yang mengenal penanda differensiasi dalam konteks dari metode imunomagnetik atau pengenalan sel yang diaktivasi fluoresen. Strategi lain yang telah digunakan untuk identifikasi dan HSC diperkaya berdasar pada pola pengecatan pewarna berfluoresen (Bertoncello et al., 1985; Goodell et al., 1996; Leemhuis et al., 1996; Storms



et al., 1999), Rhodamine 123 (yang lebih teristimewa akumulasi pada mitochondria aktif) dan Hoechst 33342 (bis-benzimidazole yang berikatan ke bagian lengkung kecil adenine-thymine DNA) adalah dua pewarna vital fluoressen yang telah secara rutin digunakan untuk menandai populasi precursor hematopoietic (Bertoncello et al., 1985; Leemhuis et al., 1996). Pengecatan rhodamine 123 dari sel sunsum tulang tikus memprlihatkan bahwa HSC dengan potensi terpopulasi waktu panjang tercat secara suram sedangkan prekursor hematopoietic yang terpopulasi waktu pendek akan tercat lebih terang (Bertoncello et al., 1991; Spangrude and Johnson, 1990; Zijlmans et al., 1995). Sedangkan sel sunsum tulang tikus yang diperkaya untuk repopulasi waktu lama tercat paling lmah dari kdua cat yang ada (Bertoncello and Williams, 2004; Leemhuis et al., 1996). Penurunan kadar warna dengan cat ini umumnya merefleksikan sebuah keadaan metabolik dan mitotik yang tidak aktif (Spangrude and Johnson, 1990).



C. METODE PENELITIAN (sesuai dengan keperluan) Membuat tim kerja sel punca UGM Pembuatan tim kerja stem sel universitas gadjah Mada dengan mengadakan diskusi dan sharing ide dan telaah texbook dan analisis jurnal sehingga didapatkan prioritas dalam penelitian dan penerapan stem sel • Penasehat : – Prof. Dr. Retno S. Soedibyo, MSc., Apt • Tim kerja sel punca dikelompokkan menjadi 3 kelompok kerja seuai dengan tupoksinya • Pokja litbang – Yuda heru fibrianto, PhD. Koordinator - FKH – Eggi arguni PhD. – FK – Rina Susilowati, PhD. - FK – Riris istighfari jenie, MSi, Apt. - Farmasi – Sigit Bintoro, MSc. - Fapet – Aris purwantoro, MSi - FKH – Mona airin, MSi – FKH – Ronny Martien, DR. Rer. Nat., MSi - farmasi • Pokja etikolegal, – Prof. Dr. Soenarto S., SpTHT - FK – Prof. Dr. Yati Soenarto., SpPA - FK • Pokja aplikasi klinis – Arief Budiyanto, PhD., SpKK - FK – Widodo, SpKK - FK



– – – – – – – – –



Sunardi Radiono, SpKK - FK Rahadyan, PhD., SpOT, FICS - FK Krisdanarti, SpPD, SpJP - FK Johan Kurnianda, SpPD, SpHO - FK Kartika, SpPD - FK Samekto Wibowo, Prof. DR. SpSS - FK Yudha Patria, PhD. SpA – FK Setyo Budhi, drh. MP. - FKH Sudarminto, drh., MSi - FKH



Pembuatan feeder sel dari sel fibroblas • Sel feeder adalah sel fibroblas yang diambil dari kulit yang diambil saat melakukan oprasi. • Kulit dibersihkan secara aseptik dan dibiopsi dan secepatnya diproses dalam D-PBS (Life technologies). • Setelah dicuci, kulit dicacah dalam dish kultur diikuti pemisahan antar sel dengan pemberian 0.25% (w/v) trypsin yang mengandung 1 mM EDTA 1 - 2 jam pada 38°C. • Sel yang sudah ditripsin dicuci sekali lagi dengan sentrifugasi (300xg, 2 menit) dan dimasukkan kdalam cawan Petri 100 mm selama 6-8 hari dalam DMEM + 10% fetal bovine serum (FBS), 1 mM glutamine, 25 mM NaHCO3, 1% minimal essential medium (MEM) asam amino nonessential, 1% larutan penicillin-streptomycin-antimycotic pada suhu 38°C dan kelembamam 5% CO2 dan 95% udara • Pada hari ke 6-8 dilakukan penggantian kultur dan pasase dengan tripsinisasi dan larutan kultur DMEM, sel yang tidak menempel atau benda ikutan dibersihkan, sedangkan sel yang menempel dikultur sampai penuh dan dilakukan pasase beberapa kali. • Sel yang sudah banyak dapat disimpan dalam larutan DMEM yang ditambah 10% DMSO dan 10% serum untuk dibekukan dan dipakai bilamana perlu. • 2-3 hari sebelum dilakukan kultur stem sel, dilakukan pengkulturan sel feeder fibroblas ini Isolasi, purifikasi dan plurifikasi prekursor sel punca setelah perlakuan G-CSF (dilakukan setelah inform consent dan ethical clearence diperoleh) • Pasien di injeksi dngan G-CSF selama 1 minggu selama berturut-turut • Pengambilan darah tepi dengan antikoagulan dengan fosfat buffered saline (PBS) yang mengandung 0,6% antikoagulan sitrat dekstroseA (ACD-A cat. no. C3821; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)1:3 • 35 ml larutan darah tali pusat atau darah tepi 12 ml Ficoll-Paque PLUS



(cat. no. 17-1440-02; GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ). Sentrifuse pada 375g untuk 30 menit pada suhu ruang . koleksi sel pada antar permukaan, larutkan dengan PBS mengandung 0.6% ACD-A, dan sentrifus pada 375g 10 min pada suhu ruang. Beri larutan pelisis eritrosit (0.15MNH4Cl, 1,0 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7.2–7.4) dan inkubasi 10 menit pada suhu ruang. Sentrifuse pada 375g 10 menit dan cuci sekali lagi dalam PBS.Darah disentrifugasi 300 x g, 10 menit untuk memisahkan sel darah putih, serum dan sel darah merah • Sel darah putih yang sudah terpisahkan ditanam ke dalam cawan Petri 100 mm yang telah mengandung sel feeder selama 6-8 hari dalam DMEM + 10% fetal bovine serum (FBS), 1 mM glutamine, 25 mM NaHCO3, 1% minimal essential medium (MEM) asam amino nonessential, 1% larutan penicillin-streptomycin-antimycotic pada suhu 38°C dan kelembamam 5% CO2 dan 95% udara. • Sel yang tidak melekat diambil, sedangkan sel yang menempel dipertahankan sampai sel berkembang penuh. • Pemindahan sel ke media yang baru dilakukan dengan cara tripsinisasi 0.1% dan 0.02% EDTA dua kali dalam seminggu selama dua bulan dan apabila perbanyakan sel mencukupi, sel disimpan dalam larutan nitrogen cair pada suhu -196 ºC dalam larutan pembeku sel (80% DMEM, 10% DMSO dan 10% FBS). • Uji identifikasi untuk CD34 dan 43 sebagai ciri utama adanya multipotensi dengan menggunakan RT-PCR. • Dilakukan juga uji dengan pengecatan Hoech untuk mengetahui berapa prosentase dari masing masing stem sel Pada tahun ini diharapkan didapatkan sel line untuk bekal penelitian selanjutnya untuk pengembangan ke arah sel yang diinginkan dan akan ditransplantasikan ke klinisnya.



HASIL Telah dilakukan kultur sel fibroblas dari sel kulit sisa sirkumsisi yang digunakan untuk sel feeder bagi kultur sel punca. Kultur sel punca dari darah plasenta dan wharton jelly tengah dilakukan. Sel feeder yang berasal dari kulit sisa sirkumsisi yang telah diberi inform consent telah dilakukan dan dibudidayakan sehingga terbentuk sel line-nya. Darah plasenta telah diberi heparin dibawa kelaboratorium dan dilakukan sentrifugasi 200G selama 30 menit sebanyak 2 kali, supernatan dan buffy coat dipipisahkan ke tabung 50 ml dan disentrifuse 3000 G selama 30 menit. Supernatan dibuang dan buffy coat yang tertinggal dicuci dengan DMEM + 10 % fetal bovine serum (FBS), 1 mM glutamine, 25 mM NaHCO 3, 1% minimal essential medium (MEM) larutan asam amino nonessential, 1% larutan penicillin-streptomycin-antimycotic dan disentrifuse selama 30 menit. Supernatan dibuang dan sisanya dikultur kedalam feeder sel dengan pertumbuhan/konfluensi 50% kedalam inkubator 5%CO2 pada suhu 38°C dan kelembamam 5% CO2 dan 95% udara. Setelah 15 menit, cairan dan darah dicuci dan diganti dengan medium baru dan diamati setiap hari. Pada heri ke 7, telah terbentuk koloni sel astrosit yang diduga adalah mesenchimal sel. Setiap 7 hari media diganti dan sel diamati setiap hari. Wharton Jelly yang didapat dari tali pusat juga juga ditanam. Setelah dicuci dengan media DMEM + 10% serum, wharton jelly di triming dan dimasukkan kedalam kultur disk yang mengandung feeder sel confluensi 50% dan dimasukkan kedalam inkubator 5%CO2 pada suhu 38°C dan kelembamam 5% CO2 dan 95% udara. Setiap 7 hari media diganti dan sel diamati setiap hari.



Gambar. Darah plasenta yang telah dikultur 15 menit dan kemudian dibilas 2 X dengan PBS dan 1 x dengan DMEM. Terlihat sel yang menempel (panah)



Gambar. Darah plasenta yang telah dikultur 3 hari. Terlihat sel yang menempel (panah) dan berkembang



Gambar. Darah plasenta yang telah dikultur 3 hari. Terlihat sel yang menempel (panah) dan berkembang



Gambar. Darah plasenta yang telah dikultur 3 hari. Terlihat sel yang menempel (panah) dan berkembang kearah sel stellat (10x20)



Gambar. Darah plasenta yang telah dikultur 3 hari. Terlihat sel yang menempel (panah) dan berkembang kearah sel stellat (10x20)



Gambar. Pengkulturan wharton jelly (panah putih) hari 1, 3 dan 5 setelah passase hari ke 21. Tampak adanya pertumbuhan sel punca dan pengelompokan sel punca (tanda panah) tersebut Hasil lain dari program ini adalah telah dilakukan seminar pada seminar nasional di Jakarta pada tanggal 30 mei 2009 di Hotel Acasia Jakarta dengan judul Pusat Sel Punca Universitas Gadjah Mada dan Programnya (leaflet dan makalah terlampir) Hasil yang lain adalah dilakukan peningkatan jejaring kinerja dengan swasta (saat ini telah dilakukan pendekatan untuk penandatanganan pembaharuan MOU dengan PT. Biofarma dan UGM yang telah kadaluwarsa di tahun 2008) dalam kerjasama penelitian sel punca.



F. DAFTAR PUSTAKA Arai, F., Hirao, A., Ohmura, M., Sato, H., Matsuoka, S., Takubo, K., Ito, K., Koh, G. Y., and Suda, T. (2004). Tie2/angiopoietin]1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell 118, 149–161. Balazs, A. B., Fabian, A. J., Esmon, C. T., and Mulligan, R. C. (2006). Endothelial protein C receptor (CD201) explicitly identifies hematopoietic stem cells in murine bone marrow. Blood 107, 2317– 2321. Bertoncello, I., and Williams, B. (2004). Hematopoietic stem cell characterization by Hoechst 33342 and rhodamine 123 staining. Methods Mol. Biol. 263, 181–200. Bertoncello, I., Bradley, T. R., Hodgson, G. S., and Dunlop, J. M. (1991). The resolution, enrichment, and organization of normal bone marrow high proliferative potential colony]forming cell subsets on the basis of rhodamine-123 fluorescence. Exp. Hematol. 19, 174–178. Bertoncello, I., Hodgson, G. S., and Bradley, T. R. (1985). Multiparameter analysis of transplantable hemopoietic stem cells. I. The separation and enrichment of stem cells homing to marrow and spleen on the basis of rhodamine-123 fluorescence. Exp. Hematol. 13, 999–1006. Bongso A dan Lee EH. Stem cell: Their definition, classification and Sources dalam stem cell. 2005. World Scientific. 1-13.



Bonnet, D. (2002). Haematopoietic stem cells. J. Pathol. 197, 430–440. Chen, C. Z., Li, M., de Graaf, D., Monti, S., Gottgens, B., Sanchez, M. J., Lander, E. S., Golub, T. R., Green, A. R., and Lodish, H. F. (2002). Identification of endoglin as a functional marker that defines long-term repopulating hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 15468–15473. Civin, C. I., Trischmann, T., Kadan, N. S., Davis, J., Noga, S., Cohen, K., Duffy, B., Groenewegen, I., Wiley, J., Law, P., Hardwich, A., Oldham, F., and Gee, A. (1996). Highly purified CD34-positive cells reconstitute hematopoiesis. J. Clin. Oncol. 14, 2224–2233. Civin, C., Strauss, L. C., Brovall, C., Fackler, M. J., Schwartz, J. F., and Shaper, J. H. (1984). Antigenic analysis of haematopoiesis. III. A haematopoietic progenitor cell surface antigen defined by a monoclonal antibody raised against KG1a cells. J. Immunol. 133, 157–165. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., and Mulligan, R. C. (1996). Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797–1806. Hawley, R. G. (2001). Progress toward vector design for hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Gene Ther. 1, 1–17. Ito, T., Tajima, F., and Ogawa, M. (2000). Developmental changes of CD34 expression by murine hematopoietic stem cells. Exp. Hematol. 28, 1269–1273. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., and Morrison, S. J. (2005). SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell 121, 1109–1121. Kogler G, Sensken S, Airey JA, Trapp T, Muschen M, Feldhahn N, Liedtke S, Sorg RV, Fischer J, Rosenbaum C. (2004). A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential. J Exp Med 200:123-135. Krause, D. S., Fackler, M. J., Civin, C. I., and May, W. S. (1996). CD34: Structure, biology, and clinical utility. Blood 87, 1–13. Leemhuis, T., Yoder, M. C., Grigsby, S., Aguero, B., Eder, P., and Srour, E. F. (1996). Isolation of primitive human bone marrow hematopoietic progenitor cells using Hoechst 33342 and rhodamine 123. Exp. Hematol. 24, 1215–1224. Matsubara, A., Iwama, A., Yamazaki, S., Furuta, C., Hirasawa, R., Morita, Y., Osawa, M., Motohashi, T., Eto, K., Ema, H., Kitamura, T., Vestweber, D., and Nakauchi, H. (2005). Endomucin, a CD34-like sialomucin, marks hematopoietic stem cells throughout development. J. Exp. Med. 202, 1483–1492. Matsuoka, S., Ebihara, Y., Xu, M., Ishii, T., Sugiyama, D., Yoshino, H., Ueda, T., Manabe, A., Tanaka, R., Ikeda, Y., Nakahata, T., and Tsuji, K. (2001). CD34 expression on long-term repopulating hematopoietic



stem cells changes during developmental stages. Blood 97, 419–425. McCulloch, E. A., and Till, J. E. (2005). Perspectives on the properties of stem cells. Nat. Med. 11, 1026–1028. Moayeri, M., Hawley, T. S., and Hawley, R. G. (2005). Correction of murine hemophilia A by hematopoietic stem cell gene therapy. Mol. Ther. 12, 1034–1042 Planat-Benard V, Menard C, Andre M, Puceat M, Perez A, Garcia-Verdugo M, Penicaud L, Casteilla L. 2004. Circ Res, 94, 223–229. Sato, T., Laver, J. H., and Ogawa, M. (1999). Reversible expression of CD34 by murine hematopoietic stem cells. Blood 8, 2548–2554. Sauvageau, G., Iscove, N. N., and Humphries, R. K. (2004). In vitro and in vivo expansion of hematopoietic stem cells. Oncogene 23, 7223– 7232. Shizuru, J. A., Negrin, R. S., and Weissman, I. L. (2005). Hematopoietic stem and progenitor cells: Clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu. Rev. Med. 56, 509–538. Solar, G. P., Kerr, W. G., Zeigler, F. C., Hess, D., Donahue, C., de Sauvage, F. J., and Eaton, D. L. (1998). Role of c-mpl in early hematopoiesis. Blood 92, 4–10. Spangrude, G. J., and Johnson, G. R. (1990). Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7433–7437. Steward, C. G., and Jarisch, A. (2005). Haemopoietic stem cell transplantation for genetic disorders. Arch. Dis. Child 90, 1259–1263. Storms, R. W., Trujillo, A. P., Springer, J. B., Shah, L., Colvin, O. M., Ludeman, S. M., and Smith, C. (1999). Isolation of primitive human hematopoietic progenitors on the basis of aldehyde dehydrogenase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9118–9123. Sutherland, D. R., Anderson, L., Keeney, M., Nayar, R., and Chin]Yee, I. (1996). The ISHAGE guidelines for CD34þ cell determination by flow cytometry. J. Hematother. 5, 213–226. Wagner W, Feldman RE,Jr., Seckinger A, Maurer MH, Wein F, Blake J, Krause U, Kalenka A, Burgers HF, Saffrich R, Wuchter P, Kuschinsky W, and Ho AD (2006). The heterogenecity of human mesenchymal stem cell preparations Evidence from simultaneous analysis of proteomesand transcriptomes. Exp Hematol 34:536-548. Wagner W, Wein F, Seckinger A, Frank-hauser M, Wirkner U, Krause U, Blake J, Schwager C, Eckstein V, Ansorge W, and Ho AD (2005). Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. Exp Hematol 33:1402-1416. Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., and Morrison, S. J. (2006). SLAM family markers are conserved among hematopoietic stem cells from old and reconstituted mice and markedly increase their purity. Blood 107, 924–930.



Zhang, C. C., Kaba, M., Ge, G., Xie, K., Tong, W., Hug, C., and Lodish, H. F. (2006a). Angiopoietin-like proteins stimulate ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. Nat. Med. 12, 240–245. Zhang, C. C., Steele, A. D., Lindquist, S., and Lodish, H. F. (2006b). Prion protein is expressed on long-term repopulating hematopoietic stem cells and is important for their self-renewal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 2184–2189. Zijlmans, J. M., Visser, J. W., Kleiverda, K., Kluin, P. M., Willemze, R., and Fibbe, W. E. (1995). Modification of rhodamine staining allows identification of hematopoietic stem cells with preferential short-term or long-term bone marrow-repopulating ability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8901–8905



LAMPIRAN Seminar Nasional sel Punca



PUSAT STEM SEL UNIVERSITAS GADJAH MADA DAN PROGRAMNYA Yuda Heru Fibrianto*1 *Bagian Fisiologi Fakultas Kedokteran Hewan UGM, Jl. Fauna 2, Karangmalang Yogyakarta, 55281, [email protected] Pusat sel punca Universitas Gadjah Mada Yogyakarta ABSTRAK Pusat stem sel Universitas Gadjah Mada merupakan pusat kajian dan penelitian stem sel yang terdiri dari gabungan staf peneliti dari fakultas kedokteran hewan, kedokteran, farmasi, biologi dan peternakan yang bertempat di laboratorium pusat penelitian terpadu dan di laboratorium tekhnologi kedokteran. Tim stem sel UGM dikelompokkan menjadi tiga kelompok kerja dari litbang, etika dan klinis sesuai dengan keahliannya, sehingga terjalin kesesuaian ide, penelitian dan aplikasi pra-klinis dan klinis. Program dari pusat studi ini adalah untuk penelitian stem sel dari tekhnik isolasi dan plurifikasi adult stem sel sampai stem sel hasil rangsangan (induce pluripotent stem cell, iPS) untuk mendapatkan sel line, protokol differensiasi dan aplikasi. Pendahuluan Banyak penyakit kritis pada manusia tidak dapat diobati dan disembuhkan oleh tekhnologi kedokteran yang paling baru sekarang ini. Penyakit ini sering merusak organ manusia yang hasilnya menyebabkan organ manusia tersebut secara normal tidak dapat berfungsi secara normal. Para peneliti yakin bahwa stem cell manusia adalah obat yang sangat baik untuk menyembuhkan penyakit kritis tersebut. Stem sel adalah sumber dari semua sel di dalam individu, dan ini merupakan sebuah sumber bagi pengobatan sel. Pengobatan sel sekarang ini merupakan sebuah jalan revolusi untuk mengatasi penyakit dan kerusakan dengan keuntungan medis yang luas. Pengobatan stem sel mempunyai potensi penerapan dalam mengatasi berbagai penyakit dan kelemahan dari otak, organ dalam, tulang dan banyak jeringan lainnya. Contoh penyakit ini meliputi stroke, Alzheimer’s, Parkinson, penyakit jantung, osteoporosis, diabetes yang tergantung insulin, leukimia, luka bakar dan kerusakan sunsum tulang belakang. Penelitian stem sel dewasa beserta aplikasinya telah diperbolehkan dilakukan di Indonesia, dan beberapa sudah dipraktekkan untuk pengobatan penyakit infark jantung, tetapi penelitiannya masih belum dijalankan dengan intensif sehingga masih sangat diperlukan untuk penelitian dengan seksama disamping itu, pluripoten stem (iPS) sel hasil induksi telah dihasilkan dari fibroblas tikus dan manusia dengan transduksi retroviral dari empat faktor transkripsi, sel iPS hasil buatan ini terlihat sama dengan stem sel yang berasal dari embrio (embrionik stem sel) dalam penampakan gene dan berkompeten untuk menghasilkan chimera germ sel. Pembentukan sel iPS manusia ini memberikan sebuah metode untuk memproduksi sel stem dari pasien untuk dipelajari status penyakitnya di dalam kultur atau laboratorium sehingga kita perlu untuk melakukan penelitian dari iPS ini karena sel ini yang berpotensi pluripotensi sangat supel dalam aplikasinya. 1



Disampaikan pada seminar sehari ASPI: Penelitian Multisenter Sel Punca di Indonesia, Hotel Acacia, Jakarta, 30 mei 2009



Sel punca (Stem sel) Sel punca (Stem sel) adalah sumber dari semua sel di dalam individu, dan ini merupakan sebuah sumber bagi pengobatan sel yang sekarang ini merupakan sebuah jalan revolusi untuk mengatasi berbagai penyakit dan kerusakan dengan keuntungan medis yang luas. Pengobatan dengan menggunakan sel punca mempunyai potensi penerapan dalam mengatasi berbagai penyakit dan kelemahan dari otak, organ dalam, tulang dan banyak jaringan lainnya. Contoh penyakit ini meliputi stroke, alzheimer’s, Parkinson, penyakit jantung, osteoporosis, diabetes yang tergantung insulin, leukimia, luka bakar dan kerusakan sunsum tulang belakang. Sel punca dapat dikategorikan menjadi 2 macam kategori besar berdasarkan sumbernya yaitu sel punca dewasa yang berasal dari organisme dewasa dan sel punca embrio, sel punca yang berasal dari inner sel mass embrio stadium blastula. Kedua macam sel punca ini dapat digunakan untuk pengobatan sel punca (Bongso dkk., 2005). Di Indonesia telah dimulai penelitian dan pengobatan stem stem dengan menggunakan sel punca dewasa (Permenkes, 2009), hal ini dipilih karena sel punca dewasa tidak menemui hambatan dalam bidang etika, sedangkan sel punca embrio masih banyak ketidakjelasan tentang etika dan banyak perdebatan yang timbul karenanya, walaupun sudah banyak negara yang membolehkannya (Burley, 2005) termasuk amerika baru-baru ini setelah terpilihnya presiden Barak Obama (Anonim, 2009). Sel punca dewasa yang banyak diteliti adalah sel punca mesenkimal dan hematopoietik. Sel punca mesenkim (MSCs) merupakan wakil dari tipe sel punca dewasa yang memberikan variasi sel termasuk osteosit, chondrosit, adiposit dan bentuk lain dari sel jaringan ikat lain seperti dalam tendon (Beyer dan Meireles, 2006). Sedangkan hematopoiesis adalah perwakilan dari sel punca dewasa yang merupakan pioneer dari sel punca, dimana penelitian akhir-akhir ini telah diperoleh hasil dimana sel punca ini mampu berdifferensiasi menjadi sel jantung ataupun sel lain yang bukan berasal dari mesodermal seperti sel hati dan saraf apabila menemukan lingkungan yang cocok untuk pertumbuhannya (Wagner dkk., 2005; 2006). Walaupun demikian, para peneliti yakin bahwa sel punca embrio adalah sumber sel punca yang mempunyai potensi untuk mempertahankan keadaan tidak terdifferensiasi, dan juga sel turunannya memperlihatkan penanda sel punca permukaan yang jelas, mempunyai aktivitas telomerase yang tinggi, memperlihatkan tipe karyotype normal dan mempunyai potensi untuk berdifferensiasi kedalam berbagai tipe sel dalam kondisi in Vitro ataupun in vivo. Oleh karena itu, sel hESC mempunyai potensi kemampuan untuk pengembangan dengan pengobatan transplantasi sel untuk menangani berbagai penyakit manusia karena kemampuannya untuk menjadi berbagai macam sel dari berbagai organ dalam tubuh atau bersifat pluripotensi (Reubinof dkk, 2000; Thomson dkk, 1998), sehingga telah membangkitkan keingintahuan pada kemampuan transplantasi sel punca embrio (embrionic stem cell/ES) ini untuk penyembuhan sel dalam bidang pengobatan manusia (Trouson, 2001; Trouson dan Pera 2001). Debat etika yang menyelimuti “therapeutic cloning,” seperti halnya kesulitan tekhnik dan proses yang tidak efisien (Hochedlinger dkk., 2006), telah memacu penyelidikan untuk memperoleh tekhnik pemrograman ulang dari sel somatik dengan faktor penentu pluripotensi (Maherali dkk., 2007; Takahashi dkk., 2006; 2007; Wernig dkk., 2007; Yu dkk., 2007, Okita dkk., 2007). Strategi yang baru ini dikenal dengan istilah induksi pluripotensi stem sel (iPS cells) dan pada penelitian berkelanjutan dewasa ini, fibroblas tikus dan manusia telah diprogram in vitro kedalam sel pluripoten mirip



stem sel (dinamakan “pluripoten induksi stem sel” atau iPS) melalui transduksi retrovirus dari kombinasi faktor transkripsi (Maherali dkk., 2007; Takahashi dkk., 2006; 2007). Ini telah diperoleh dengan seleksi untuk memprogram ulang sel dengan mengaktifkan kembali penanda endogen pluripotensi Oct4 gene atau Nanog atau dengan mengkloning koloni berdasar pada kriteria morfologinya (Maherali dkk., 2007; Takahashi dkk., 2006; 2007; Wernig dkk., 2007; Yu dkk., 2007). Sel iPS yang dihasilkan dari fibroblas tikus dan manusia sangat mirip dengan sel ES secara kriteria genetik, epigenetik dan perkembangannya. Bagaimanapun, ini tetap jadi ditentukan apakah sel iPS yang diperoleh dari fibroblas dewasa dapat dipergunakan untuk memperbaiki fungsi fisiologis dari jaringan sakit in vivo karena masalah asal sel dan mekanisme induksi dari iPS sel tetap sukar untuk dipahami. Telah dilaporkan pembentukan sel iPS dari sel hati tikus dewasa dan sel epitel lambung. Sel iPS hasil buatan ini terlihat sama dengan stem sel yang berasal dari embrio (embrionik stem sel) dalam penampakan gene dan berkompeten untuk menghasilkan chimera germ sel. Dengan transduksi retrovirus dengan empat faktor transkripsi, Oct 3/4, Sox2, Klf4, dan c-Myc, sel fibroblast tikus dewasa telah diprogram ulang ke keadaan tidak terdifferensiasi yang mirip dengan stem sel embrio (Okita dkk., 2007; Takahashi dkk., 2006), dan sel ini telah dinamai sel pluripoten induksi (iPS). Sesudah itu, sel iPS manusia dihasilkan dengan menggunakan dua pasang faktor transkripsi yang berbeda (Takahashi dkk., 2007; Yu dkk., 2007). Pembentukan sel iPS manusia memberikan sebuah metode untuk memproduksi sel stem dari pasien untuk dipelajari status penyakitnya di dalam kultur atau laboratorium (Takahashi dkk., 2007; Park dkk., 2008), walaupun secara essensial mekanisme dari induksi sel iPS, belum dikpahami secara menyeluruh. Efisiensi yang rendah dari pembentukan sel iPS dari berbagai penelitian menyarankan penggunaan asal sel tersebut yang mungkin menyebabkan stem sel tidak berdifferensiasi secara tetap dan juga integrasi retrovirus kedalam tempat khusus tidak disyaratkan untuk induksi sel iPS (Yamanaka dkk., 2007), meskipun demikian sel iPS telah dihasilkan dari penelitian yang dilakukan oleh Aoi dkk. (2008) yang menggunakan sel epitel. Dengan menggunakan model tikus untuk penyakit anemia sel, tikus dapat selamat setelah transplantasi dengan progenitor hematopoietik yang diperoleh secara in vitro dari iPS autologus. Penyembuhan ini diperoleh setelah koreksi dari allel hemoglobin manusia sakit dengan target gen khusus. Hasil ini memberikan bukti nyata dari prinsip dalam penggunaan faktor transkripsi untuk menginduksi pemrograman ulang yang dikombinasikan dengan gene transfeksi serta sel terapi untuk pengobatan penyakit pada tikus. Masalah yang timbul sehubungan dengan penggunaan retrovirus dan onkogene untuk program ulang, membutuhkan penanganan terlebih dahulu sebelum sel iPS dapat dipertimbangkan untuk pengobatan manusia. Kesembuhan sel sakit anemia mengindikasikan bahwa memanfaatkan sel autologus turunan iPS untuk tujuan pengobatan memberikan ikhtisar beberapa janji yang diberikan sebelumnya oleh cloning terapi: (1) tidak membutuhkan pemakaian obat penekan kekebalan untuk mencegah penolakan dari sel tranplantasi yang tidak cocok, (2) kesempatan untuk memperbaiki kelainan genetik dengan rekombinasi homolog, dan (3) kesempatan secara berulang mendifferensiasi sel iPS kedalam tipe sel yang diinginkan untuk melanjutkan pengobatan (Hanna dkk., 2007). Walaupun pemrograman ulang dari sel somatik manusia kedalam sel iPS sekarang telah diperoleh (Takahashi dkk., 2007; Yu dkk., 2007), aplikasi pengobatan masa depan dari sel iPS pada manusia mendapatkan beberapa rintangan yang dihadapi: (1) menghindari penggunaan oncogene berbahaya sebagai



bagian dari faktor pemrograman ulang (Okita dkk., 2007), (2) menghindari penggunaan penghantar gene dari vektor retrovirus yang membawa resiko pemasukan mutagenes, dan (3) pengembangan yang sehat, kuat dan nyata protokol differensiasi untuk sel iPS manusia. Tim kerja sel punca UGM Pembuatan tim kerja stem sel universitas gadjah mada dengan pusat studi tersendiri dengan beranggotakan dari seluruh komponen sumber daya manusia yang ada di universitas dari berbagai bidang ilmu. Program utama adalah mengadakan diskusi dan sharing ide serta telaah texbook dan analisis jurnal sehingga didapatkan prioritas dalam penelitian dalam mengidentifikasi, isolasi, multiplikasi dan penerapan stem sel baik sel punca dewasa maupun iPS sehingga alur penelitian yang ada bisa dilaksanakan secara konphrehensif dan tepat guna dalam melakukan kegiatan penelitian dan penerapannya tanpa mengindahkan kaidah bioetika. Dari beberapa hasil sementara tim kerja SCC-UGM adalah sebagai berikut: • Penasehat : – Prof. Dr. Retno S. Soedibyo, MSc., Apt • Tim kerja sel punca dikelompokkan menjadi 3 kelompok kerja seuai dengan tupoksinya • Pokja litbang – Yuda heru fibrianto, MSi., PhD. Koordinator - FKH – Eggi arguni PhD. – FK – Rina Susilowati, PhD. - FK – Riris istighfari jenie, MSi, Apt. - Farmasi – Sigit Bintoro, MSc. - Fapet – Aris purwantoro, MSi - FKH – Mona airin, MSi – FKH – Ronny Martien, DR. Rer. Nat., MSi - farmasi • Pokja etikolegal, – Prof. Dr. Soenarto S., SpTHT - FK – Prof. Dr. Yati Soenarto., SpPA - FK • Pokja aplikasi klinis – Arief Budiyanto, PhD., SpKK - FK – Widodo, SpKK - FK – Sunardi Radiono, SpKK - FK – Rahadyan, PhD., SpOT, FICS - FK – Krisdanarti, SpPD, SpJP - FK – Johan Kurnianda, SpPD, SpHO - FK – Kartika, SpPD - FK – Samekto Wibowo, Prof. DR. SpSS – FK – Prof. M. Anwar, SPOG (K) – FK



– – – –



Hasto, SpOG (K) – (FK) Yudha Patria, PhD. SpA – FK Setyo Budhi, drh. MP. - FKH Sudarminto, drh., MSi - FKH



Program SCC-UGM Program yang akan dilakukan di stem cell center universitas gadjah mada adalah: (1) isolasi dan plurifikasi stem sel dewasa yang berasal dari hematopoietik maupun dari plasenta, (2) mengembangkan iPS dan differensiasi serta aplikasi preklinik maupun klinis, (3) membuat universal iPS sehingga didapatkan pluripotensi stem sel yang siap pakai bagi siapa saja yang membutuhkan, (4) membuat hubungan dan korelasi dari berbagai pusat studi stem sel dari rumah sakit, pusat studi maupun universitas dalam sharing ilmu dan hasil pengembangan yang sudah didapatkan. Beberapa tekhnik yang kita kembangkan dan beberapa protokol yang ada di SCC-UGM adalah sebagai berikut: Pembuatan feeder sel dari sel fibroblas • Sel feeder adalah sel fibroblas yang diambil dari kulit yang diambil saat melakukan operasi. • Kulit dibersihkan secara aseptik dan dibiopsi dan secepatnya diproses dalam DPBS (Life technologies). • Setelah dicuci, kulit dicacah dalam dish kultur diikuti pemisahan antar sel dengan pemberian 0.25% (w/v) trypsin yang mengandung 1 mM EDTA 1 - 2 jam pada 38°C. • Sel yang sudah ditripsin dicuci sekali lagi dengan sentrifugasi (300xg, 2 menit) dan dimasukkan kdalam cawan Petri 100 mm selama 6-8 hari dalam DMEM + 10% fetal bovine serum (FBS), 1 mM glutamine, 25 mM NaHCO3, 1% minimal essential medium (MEM) asam amino nonessential, 1% larutan penicillin-streptomycinantimycotic pada suhu 38°C dan kelembamam 5% CO2 dan 95% udara • Pada hari ke 6-8 dilakukan penggantian kultur dan pasase dengan tripsinisasi dan larutan kultur DMEM, sel yang tidak menempel atau benda ikutan dibersihkan, sedangkan sel yang menempel dikultur sampai penuh dan dilakukan pasase beberapa kali. • Sel yang sudah banyak dapat disimpan dalam larutan DMEM yang ditambah 10% DMSO dan 10% serum untuk dibekukan dan dipakai bilamana perlu. • 2-3 hari sebelum dilakukan kultur stem sel, dilakukan pengkulturan sel feeder fibroblas ini Isolasi, purifikasi dan plurifikasi prekursor sel punca setelah perlakuan GCSF (dilakukan setelah inform consent dan ethical clearence diperoleh) • Pasien di injeksi dngan G-CSF selama 1 minggu selama berturut-turut • Pengambilan darah tepi dengan antikoagulan dengan fosfat buffered saline (PBS)



yang mengandung 0,6% antikoagulan sitrat dekstroseA (ACD-A cat. no. C3821; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)1:3 • 35 ml larutan darah tali pusat atau darah tepi 12 ml Ficoll-Paque PLUS (cat. no. 17-1440-02; GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ). Sentrifuse pada 375g untuk 30 menit pada suhu ruang . koleksi sel pada antar permukaan, larutkan dengan PBS mengandung 0.6% ACD-A, dan sentrifus pada 375g 10 min pada suhu ruang. Beri larutan pelisis eritrosit (0.15MNH4Cl, 1,0 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7.2–7.4) dan inkubasi 10 menit pada suhu ruang. Sentrifuse pada 375g 10 menit dan cuci sekali lagi dalam PBS.Darah disentrifugasi 300 x g, 10 menit untuk memisahkan sel darah putih, serum dan sel darah merah • Sel darah putih yang sudah terpisahkan ditanam ke dalam cawan Petri 100 mm yang telah mengandung sel feeder selama 6-8 hari dalam DMEM + 10% fetal bovine serum (FBS), 1 mM glutamine, 25 mM NaHCO3, 1% minimal essential medium (MEM) asam amino nonessential, 1% larutan penicillin-streptomycin-antimycotic pada suhu 38°C dan kelembamam 5% CO2 dan 95% udara. • Sel yang tidak melekat diambil, sedangkan sel yang menempel dipertahankan sampai sel berkembang penuh. • Pemindahan sel ke media yang baru dilakukan dengan cara tripsinisasi 0.1% dan 0.02% EDTA dua kali dalam seminggu selama dua bulan dan apabila perbanyakan sel mencukupi, sel disimpan dalam larutan nitrogen cair pada suhu -196 ºC dalam larutan pembeku sel (80% DMEM, 10% DMSO dan 10% FBS). • Uji identifikasi untuk CD34 dan 43 sebagai ciri utama adanya multipotensi dengan menggunakan RT-PCR. • Dilakukan juga uji dengan pengecatan Hoech untuk mengetahui berapa prosentase dari masing masing stem sel Transfeksi cDNA faktor transkripsi dan EGFP gene kedalam sel fibroblast Plasmid pEGFP-N1 yang mengkode variasi sinar merah dari GFP type liar yang telah dioptimalisasi untuk berpendar lebih terang dan terekspresi dalam sel mamalia lebih tinggi dan cDNA faktor transkripsi (OCT 4 dan Nanog) dari Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA). Sehari sebelum transfeksi sel fibroblast dengan kepekatan penuh (pasase ke 3-5) ditripsinisasi, dihitung dan ditempatkan kedalam 35 mm kultur dish sampai dicapai kepekatan 80% pada hari transfeksi. Satu mikroliter cDNA dan Satu mikroliter (1 µg) pEGFP-N1 serta 3 µl FuGENE-6 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) dicampur dengan 97 µl DMEM bebas serum. Setelah 15 menit diinkubasi pada temperature kamar, 101 µl larutan campuran medium dan cDNA ditambahkan kedalam 2 ml kultur media. Sel diinkubasi selama 2–3 hari dalam sel feeder sampai kepekatan 100% dan dipasase sekali untuk untuk didapatkan pertautan yang stabil dari gene cDNA dan EGFP kedalam kromosom sel fibroblast. Untuk meningkatkan laju transfeksi gene kedalam sel, sel yang sudah tertransfeksi dilanjutkan dengan berbagai perlakuan dengan menggunakan penghambat siklus sel (puromycine) untuk memperoleh atau ditemukannya laju transfeksi sel yang paling tinggi (100%). Penstabilan iPS sel line Sel feeder disiapkan 6-48 jam sebelum sel hasil induksi diperoleh dan akan dipasase. Kalau memungkinkan diharapkan akan digunakan sel feeder yang segar dengan jumlah passase yang minimal. Sel iPS dikultur pada sel feeder dalam medium kultur sel



pada 37ºC dan 5% CO2. setelah 6 hari dalam kultur diamati pembentukan koloni dibawah mikroskop. Subkultur dilakukan secara mekanik setiap 5-7 hari dengan memisahkan koloni sel yang tidak berdifferensiasi kedalam kumpulan sel yang terdiri dari 200-300 sel menggunakan pipet pasteur yang dibengkokkan dibawah mikroskop inverted. Kelompok sel yang telah dipisahkan dipasase kedalam disk lapisan feeder sel yang baru dengan medium yang sama. Setelah mengalami proliferasi yang berkelanjutan sekitar 40 kali pasase, didapatkan sel line iPS sel. Pada saat awal kultur sel medium ditambahi dengan faktor inhibisi leukimia (hLIF; Chemicon, Temecula, CA). Pembekuan dan penanaman kembali sel iPS Pembekuan Sel iPS scara mekanik dipisahkan kedalam kelompok 200-300 sel/kelompok. Lima kelompok sel pada waktu bersamaan dipindahkan kedalam 25 µl larutan pembeku 1 (DMSO 10% dan 10% ethilen glycol dalam medium) dan diinkubasi pada 37ºC dan 5% CO2 selama 1 menit. Kelompok sel dipindah kedalam 25 µl larutan pembeku 2 (DMSO 20%, 20% ethilen glycol dan 0,5 M sukrose dalam medium) dan diinkubasi pada 37ºC dan 5% CO2 selama 30 detik. Masukkan kelompok sel kedalam EM-grid (Pelco, Redding, CA; cat. no. 3 HGC #400) dengan menggunakan pipet kapiler dibawah mikroskop dan secepatnya dimasukkan kedalam cryovial (Nunc; cat. no. 368632) dan disimpan pada -196ºC. Penanaman kembali (thawing) sel iPS EM-grid dimasukkan kedalam 25 µl larutan thawing 1 (0,2 M sukrose dalam kultur media iPS) dan diinkubasi pada 37ºC dan 5% CO 2 selama 1 menit, dilanjutkan pemindahan kelompok sel kedalam 25 µl larutan thawing 2 (0,1 M sukrose dalam kultur media iPS) dan diinkubasi pada 37ºC dan 5% CO 2 selama 5 menit dan kelompok sel dicuci dalam 25 µl medium kultur dan diinkubasi pada 37ºC dan 5% CO2 selama 10 menit dan sel dimasukkan kedalam lapisan feeder sel yang baru. Lebih dari 10 kelompok sel dimasukkan kedalam lapisan feeder yang baru dan dikultur secara bersamaan. Dish ditempatkan pada 37ºC dan 5% CO2 dan tidak diganggu selama 48 jam. Ekspressi penanda permukaan sel Koloni sel iPS (8-10 koloni) ditumbuhkan dalam dish 4 sumuran dengan 500 µl larutan. Pada saat analisa, kultur media iPS diambil dan sel dicuci dengan 1XDPBS yang mengandung 0,9 mM Ca2+ (CaCl2) dan 0,5 mM Mg2+ (MgCl2) (Life Technologi; cat. no. 14080055). Koloni difixe-kan dengan 500 µl 4% paraformaldehid (Sigma; cat. no. P6148) selama 30 menit dan selanjutnya dicuci 3 kali untuk 3 manit dalam 500 µl larutan 1XDPBS dengan Ca2+ dan Mg2+. Aktivitas peroksidase endogen dipadamkan dengan inkubasi fixed koloni dengan 500 µl larutan 0,3% H2O2 selama 30 menit pada 26ºC. Koloni dicuci dengan DPBS selama 5 menit. Kit Vectastain ABC (Vector, Burlingame, CA; cat. no. PK-6103) digunakan untuk mengecat penanda permukaan sel dengan cara protokol perusahaan. Kit terdiri dari Bloking serum, Biotinil antibodi dan reagen vecstain ABC. Antibodi primer dilarutkan dengan menggunakan Bloking serum sesuai kebutuhan: SSEA-1 (pengencran 1:1000); SSEA-3; SSEA-4 (cat. no. MC-813-70); TRA1-60 (1:1000 Dilution; Chemicon; cat. no. MAB4360); TRA-1-80 (pengenceran 1:1000 dilution; Chemicon; cat. no. MAB4381); dan Oct-4 (pengenceran 1:1000 dilution; Santa Cruz Biotechnology, Sata Cruz, CA; cat. no. SC-5279).



DAFTAR PUSTAKA Aoi T., Yae K., Nakagawa M., Ichisaka T, Okita K, Takahashi K., Chiba T., Yamanaka S., 2008. Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells. Science 321(5889):699-702 Bongso A dan Lee EH. Stem cell: Their definition, classification and Sources dalam stem cell. 2005. World Scientific. Pp. 1-13. Burley J. 2005. Stem Cells and Translational Medicine Ethics, Law, and Policy in Stem cells : from bench to bedside World Scientific Publishing Co. Pp. 186-211 Hanna J., Wernig M, Markoulaki S., Sun CW., Meissner A., Cassady JP., Beard C., Brambrink T., Wu LC., Townes TM., Jaenisch R., 2007. Treatment of Sickle Cell Anemia Mouse Model with iPS Cells Generated from Autologous Skin. Science 318(5858):1920-3 Hochedlinger K. and Jaenisch R., 2006. Nuclear reprogramming and pluripotency. Nature 441(7097):1061-7 Maherali N, Sridharan R, Xie W, Utikal J, Eminli S, Arnold K, Stadtfeld M, Yachechko R, Tchieu J, Jaenisch R, Plath K, Hochedlinger K. 2007. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell 1(1):55-70 Okita K., Nakagawa M., Hyenjong H., Ichisaka T., Yamanaka S., 2008. Generation of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. Science 322(5903):949-53 Okita K., Ichisaka T, and Yamanaka S. 2007. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 448(7151):313-7 Park IH., Zhao R, West JA, Yabuuchi A, Huo H, Ince TA, Lerou PH, Lensch MW. and Daley GQ. 2008. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 451(7175):141-6 Reubinoff BE, Pera MF, Fong CY, Trounson A dan Bongso A. Embrionic stem cell lines from human blastocyst: Somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 2000; 18(4):399-404. Takahashi K., Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. 2007. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131(5):861-72. Takahashi K., and Yamanaka S. 2006. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126(4):663-76 Thomson JA, Itskovits-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshal VS, dan Jones JM. Embrionic stem cell lines derived from human blastocyst. Science 1998; 282:1145-1147. Trounson A dan Pera M. Human embrionic stem cell. Fertil. Steril. 2001; 76(4):660-661. Trounson A. 2001. The derivation and potential use of human embrionic stem cell lines. Reprod. Fertil. Dev. 13:523-532. Wagner W, Feldman RE,Jr., Seckinger A, Maurer MH, Wein F, Blake J, Krause U, Kalenka A, Burgers HF, Saffrich R, Wuchter P, Kuschinsky W, and Ho AD. 2006. The heterogenecity of human mesenchymal stem cell preparations Evidence from simultaneous analysis of proteomesand transcriptomes. Exp Hematol 34:536-548. Wagner W, Wein F, Seckinger A, Frank-hauser M, Wirkner U, Krause U, Blake J, Schwager C, Eckstein V, Ansorge W, and Ho AD. 2005. Comparative



characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. Exp Hematol 33:1402-1416. Wakayama T, Shinkai Y, Tamashiro KL, Niida H, Blanchard DC, Blanchard RJ, Ogura A, Tanemura K, Tachibana M, Perry AC, Colgan DF, Mombaerts P, Yanagimachi R. 2001. Cloning of mice to six generation. Nature 407(6802):318-319 Wakayama T, Tabar V, Rodriguez I. 2001. Differentiation of embryonic stem cell lines generated from adult somatic cekks by nuclear transfer. Science 292(5517):740743. Wernig M., Meissner A, Foreman R, Brambrink T, Ku M, Hochedlinger K, Bernstein BE, Jaenisch R. 2007. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent EScell-like state. Nature 448(7151):318-24. Yamanaka S. 2007. Strategies and new developments in the generation of patient-specific pluripotent stem cells. Cell Stem Cell.1(1):39-49 Yamanaka S., Poksay KS., Arnold KS., Innerarity TL. 1997. A novel translational repressor mRNA is edited extensively in livers containing tumors caused by the transgene expression of the apoB mRNA-editing enzyme. Genes Dev. 11(3):32133 Yu J., Vodyanik MA., Smuga-Otto K., Antosiewicz-Bourget J., Frane JL., Tian S., Nie J., Jonsdottir GA., Ruotti V., Stewart R., Slukvin II., Thomson JA. 2007. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318(5858):1917-20.



Lampiran 2. Nota kesepahaman ugm dan Biofarma



NOTA KESEPAKATAN KERJASAMA ANTARA PT. BIO FARMA (PERSERO) DENGAN UNIVERSITAS GADJAH MADA Nomor : 08231/DIR/XI/2009 Nomor : 7269/P/HT/2009 TENTANG PENDIDIKAN, PELATIHAN, PENELITIAN, DAN PENGABDIAN KEPADA MASYARAKAT Pada hari ini Selasa, tanggal Tiga, bulan November, tahun Dua ribu sembilan (3-112009), pihak-pihak yang bertanda tangan dibawah ini: 1. PT BIO FARMA (PERSERO), Perseroan Terbatas yang Akta Pendirian Anggaran Dasarnya telah mendapatkan pengesahan dari Menteri Kehakiman Republik Indonesia pada tanggal 5 Maret 1998 Nomor C2-1423 HT.01.01.Th.98 dan telah diumumkan dalam Berita Negara Republik Indonesia tanggal 16 Juli 2002 Nomor 57, Tambahan Nomor 6884, dan telah mengalami beberapakali perubahan, terakhir berdasarkan Akta tanggal 2907-2008 (dua puluh sembilan Juli dua ribu delapan) Nomor 58, yang dibuat dihadapan Fathiah Helmi, Sarjana Hukum, Notaris di Jakarta, dan telah memperoleh persetujuan Menteri Hukum dan Hak Asasi Manusia Republik Indonesia dengan Surat Keputusannya tanggal 12-09-2008 (Dua belas September dua ribu delapan) Nomor AHU-61576.AH.01.02.Tahun 2008 tentang Persetujuan Akta Perubahan Anggaran Dasar Perseroan, dalam perbuatan hukum ini diwakili secara sah oleh Drs. Iskandar, MM., sebagai Direktur Utama berdasarkan Keputusan Nomor KEP-196/MBU/209 tanggal 17 September 2009, yang bertindak untuk dan atas nama PT Bio Farma (Persero), yang berkedudukan dan berkantor pusat di Jalan Pasteur Nomor 28, Bandung 40161, yang selanjutnya disebut sebagai PIHAK PERTAMA. 2. Universitas Gadjah Mada, Perguruan Tinggi Badan Hukum Milik Negara yang ditetapkan melalui Peraturan Pemerintah Nomor 153 Tahun 2000 dalam hal ini diwakili oleh Prof. Ir. Sudjarwadi, M.Eng., PhD., Rektor Universitas Gadjah Mada, yang diangkat berdasarkan Keputusan Majelis Wali Amanat Universitas Gadjah Mada Npmor 16/SK/MVA/2007 tanggal 25 Mei 2007, dalam hal ini bertindak untuk dan atas nama Universitas Gadjah Mada, berkedudukan di Bulaksumur, Depok, Sleman, Daerah Istimewa Yogyakarta, yang selanjutnya disebut PIHAK KEDUA. Untuk selanjutnya PIHAK PERTAMA dan PIHAK KEDUA secara bersama-sama disebut PARA PIHAK atau masing-masing disebut PIHAK.



PARA PIHAK terlebih dahulu menerangkan hal-hal sebagai berikut: 1. Bahwa PIHAK PERTAMA adalah Badan Usaha Milik Negara di Indonesia yang bergerak dalam bidang produksi vaksin dan antisera untuk mendukung Program Imunisasi Nasional serta memenuhi kebutuhan pasar eksport. 2. Bahwa PIHAK KEDUA sebagai Perguruan Tinggi Badan Hukum Milik Negara yang menyelenggarakan Pendidikan Tinggi dan bergerak dalam bidang pendidikan, penelitian dan pengabdian kepada masyarakat. Berdasarkan hal-hal tersebut di atas PARA PIHAK sepakat untuk mengadakan kerjasama dengan syarat-syarat dan ketentuan sebagai berikut: Pasal 1 TUJUAN DAN RUANG LINGKUP (1) Nota Kesepakatan Kerjasama ini bertujuan mengadakan kerjasama kelembagaan dengan memanfaatkan sumber daya yang dimiliki oleh PARA PIHAK demi kemajuan bersama yang berguna untuk Bangsa dan Negara. (2) Ruang lingkup Nota Kesepakatan Kerjasama ini mencakup: a. Penyelenggaraan Pendidikan, Pelatihan dan Penelitian di bidang Produk Biologi terutama vaksin dan antisera; b. Penyelenggaraan Kegiatan Ilmiah, Seminar dan Lokakarya; c. Peningkatan dan Pengembangan Kompetensi Sumber Daya Manusia; d. Pengembangan incubator bisnis berbasis riset; dan e. Kegiatan lain yang disepakati secara tertulis oleh PARA PIHAK.



Pasal 2 PELAKSANAAN KEGIATAN (1) Pelaksanaan dari Nota Kesepakatan Kerjasama ini akan dilaksanakan berdasarkan suatu Perjanjian tersendiri yang disepakati oleh PARA PIHAK dengan tetap mendasarkan pada Nota Kesepakatan Kerjasama ini serta disesuaikan dengan sumber daya yang dimiliki oleh PARA PIHAK. (2) Pelaksanaan Perjanjian sebagaimana dimaksud pada ayat (1) diatas, PARA PIHAK sepakat untuk menunjuk wakil dari PARA PIHAK. (3) Perjanjian yang dimaksud pada ayat (1) diatas merupakan bagian yang tidak terpisahkan dari Nota Kesepakatan Kerjasama ini. Pasal 3 PEMBIAYAAN



Pembiayaan yang timbul dari pelaksanaan Nota Kesepakatan Kerjasama ini akan diatur dalam Perjanjian tersendiri yang disepakati oleh PARA PIHAK. Pasal 4 KERAHASIAAN (1) PARA PIHAK sepakat untuk saling bertukar data dan informasi mengenai hal-hal yang berhubungan dengan pelaksanaan Nota Kesepakatan Bersama ini dan yang semata-mata hanya digunakan untuk kepentingan yang berhubungan dengan maksud dan tujuan Nota Kesepakatan Bersama ini. (2) Selain yang tercantum dalam Nota Kesepakatan Bersama ini, merupakan kewajiban masing-masing pihak untuk menjaga kerahasiaan data dan informasi. Masing-masing pihak tidak dapat dipersalahkan/dituntut baik Pidana maupun Perdata apabila terjadi keterbukaan data dan informasi sehubungan dengan keadaan tersebut dibawah ini: a. Apabila keterbukaan data dan informasi secara nyata diperlukan untuk kepentingan umum atau telah dengan sendirinya diketahui oleh masyarakat umum; b. Apabila keterbukaan data dan informasi telah terjadi sebelum tanggal Nota Kesepakatan Bersama ini berlaku, dengan dilampirkan bukti yang autentik; dan c. Apabila keterbukaan data dan informasi diwajibkan secara hukum dan/atau diminta secara sah oleh Putusan Pengadilan yang telah berkekuatan hukum tetap. Selain ketentuan yang berlaku di atas PARA PIHAK sepakat untuk menjaga kerahasiaan seluruh data dan informasi baik sebagian maupun keseluruhan kepada pihak ketiga atau pihak lainnya baik pribadi maupun bersama-sama tanpa persetujuan tertulis dari pihak lainnya. Pasal 5 JANGKA WAKTU (1) Nota Kesepakatan Kerjasama ini berlaku 3 (tiga) tahun, sejak tanggal ditandatangani oleh PARA PIHAK dan dapat diperpanjang berdasarkan kesepakatan tertulis PARA PIHAK. (2) Dalam hal salah satu pihak bermaksud mengakhiri Nota Kesepakatan Bersama ini, maka pihak yang bersangkutan harus memberitahukannya secara tertulis kepada pihak lainnya, paling lambat diterima 6 (enam) bulan sebelumnya. (3) Nota Kesepakatan Kerjasama ini dapat berakhir atau batal dengan sendirinya apabila: a. Dikemudian hari ada ketentuan perundang-undangan yang secara khusus mengatur dan bertentangan dengan ruang lingkup Nota Kesepakatan Kerjasama; dan



b. Tidak tercapainya tujuan PARA PIHAK sesuai ketentuan Pasal 1 di atas. Pasal 6 PENYELESAIAN PERSELISIHAN (1) Penyelesaian perselisihan akibat salah penafsiran atau perselisihan yang timbul dalam pelaksanaan Nota Kesepakatan Kerjasama ini akan diselesaikan secara musyawarah. (2) Apabila musyawarah untuk mencapai mufakat sebagaimana dimaksud pada ayat (1) tidak tercapai, PARA PIHAK sepakat untuk menyelesaikan perselisihan tersebut melalui Badan Arbitrase Nasional Indonesia (BANI) yang keputusannya bersifat final. Pasal 7 LAIN-LAIN (1) Perubahan atas Nota Kesepakatan Kerjasama ini dapat dilakukan berdasarkan kesepakatan tertulis PARA PIHAK. (2) Hal-hal yang belum diatur dalam Nota Kesepakatan Bersama ini akan diatur dan ditetapkan kemudian dalam adendum yang disepakati secara tertulis oleh PARA PIHAK serta merupakan bagian yang tidak terpisahkan dari Nota Kesepakatan Kerjasama ini. Demikian Nota Kesepakatan Kerjasama ini dibuat dan ditandatangani pada hari dan tanggal tersebut di atas dalam rangkap 2 (dua) bermaterai cukup, masing-masing mempunyai kekuatan hukum yang sama.



PIHAK PERTAMA PT BIO FARMA (PERSERO)



Drs. Iskandar, MM Direktur Utama



PIHAK KEDUA UNIVERSITAS GADJAH MADA



Prof. Ir. Sudjarwadi, M.Eng., PhD. Rektor