Laporan Pewarnaan Gram [PDF]

Citation preview

1



I.



TUJUAN Tujuan dari praktikum adalah :



1.



mempelajari teknik pewarnaan Gram pada bakterinis bakteri



2.



Mengamati berbagai morfologi sel bakteri berdasarkan pengecatan Gram



3.



Mengelompokkan jenis bakteri berdasarkan pengecatan Gram



II.



DASAR TEORI Mikroorganisme dipelajari di laboratorium untuk banyak tujuan. Salah satu



mikroorganisme yang dipelajari adalah bakteri. Dalam mengamati bakteri tidaklah mudah karena bakteri berukuran sangat kecil dan transparan jika disuspensiskan dalam medium cair. Bahkan walaupun dengan bantuan mikroskop pun, bakteri hidup tetap susah untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Untuk itulah, dibutuhkan suatu metode khusus dalam mengamati dan mengidentifikasi suatu bakteri. Metode tersebut adalah perwarnaan biologis dan prosedur perwarnaan dengan bantuan mikroskop. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari. Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan halhal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998). Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) : 1.



Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar.



2.



Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.



3.



Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.



1



Terdapat beberapa teknik pewarnaan untuk visualisasi, diferensiasi, dan pemisahan bakteri dalam hal karakteristik morfologis dan struktur seluler. Beberapa teknik pewarnaan tersebut ialah: 1.



Pewarnaan Sederhana Pewarnaan sederhana dilakukan untuk mengetahui ukuran, bentuk, dan tata letak sel.



Pewarnaan sederhana merupakan pemberian pewarnaan pada bakteri atau jasad renik dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan yang sudah difiksasi. Lapisan tadi digenangi dengan larutan pewarna selama jangka waktu tertentu, kemudian larutan itu dicuci dengan air dan kaca objeknya dikeringkan dengan kertas pengisap. Biasanya sel-sel itu terwarnai secara merata. Akan tetapi, pada beberapa organisme, terutama bilamana zat pewarna itu biru metilen, beberapa granula didalam sel tampak terwarnai tampak lebih gelap dibanding bagian-bagian sel lainnya. 2.



Pewarnaan Diferensial Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau



bagian-bagian sel mikroba disebut pewarnaan diferensial. Dengan teknik ini biasanya digunakan lebih dari satu larutan zat pewarna atau reagen pewarnaan. Contoh pewarnaan diferensial antara lain: pewarnaan gram, pewarnaan giemsa, pewarnaan tahan asam, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul, dan pewarnaan flagella. 3.



Pewarnaan Negatif Pewarnaan negatif merupakan pewarnaan untuk menelaah morfologi dengan prosedur



dan reagen yang memiliki pengaruh yang sangat lemah terhadap mikroorganisme. Metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi untuk mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Pewarnaan ini ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti Spirochaeta. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiotomo, 1990).



4.



Pewarnaan Gram Salah satu teknik



pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling sering



digunakan adalah pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram pertama kali diuraikan dalam suatu publikasi pada tahun 1884 oleh ahli bakteriologi Denmark, Cristian Gram. Beliau mengembangkan teknik pewarnaan ini selagi mencari suatu metode untuk membedakan antara Pneumokokus sp. dan bakteri Klebsiella pneumonia. Pada pewarnaan gram, bakteri yang terwarnai dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna utama (Kristal Violet). Bakteri gram-positif akan tetap mempertahankan zat warna utama (Kristal Violet) walau telah dicuci dengan larutan dekolorisasi. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasi kedua tipe bakteri berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Proses pewarnaan gram memerlukan 4 jenis reagen atau zat warna. Zat warna pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Zat warna yang digunakan sebagai pewarna utama atau dasar adalah zat warna Kristal Violet (Gram A). Zat warna kedua adalah zat warna pemekat (mordant). Fungsi dari zat warna ini adalah untuk memekatkan warna utama pada dinding bakteri. Zat warna atau reagen yang umum digunakan adalah larutan Yodium (Gram B). Zat warna ketiga disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci atau tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci. Bakteri dengan dinding sel yang tebal akan mengalami dehidrasi sehingga pori-pori menciut dan menyebabkan zat warna utama tidak dapat keluar. Sedangkan bila komponen dinding sel bakteri tersebut tipis, maka bakteri tersebut tidak akan mengalami dehidrasi sehingga pori-porinya membukan dan menyebabkan zat warna utama akan keluar dan mudah. Larutan yang digunkan sebagai dekolorisasi adalah larutan Alkohol (Gram C). Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila bakteri tersebut dapat mempertahankan warna utama maka warna pembanding tidak dapat masuk ke pori-pori dinding sel dan warna dinding bakteri tersebut akan berwarna seperti zat warna utama dan bila bakteri tersebut tidak dapat memperthankan warna utama maka warna tandingan dapat masuk ke pori-pori dinding



sel dan memberi warna pada dinding selnya. Salah satu contoh larutan yang umum digunkan sebagai zat warna tandingan adalah Safranin (Gram D). Berikut di bawah ini adalah tabel langkah-langkah dalam prosedur serta hasil pewarnaan gram pada setiap tahap: Tabel 2.1 Langkah-langkah Prosedur Beserta Hasil Pewarnaan Gram Larutan dan Urutan Penggunaannya



Reaksi dan Tampang Bakteri Gram positif Gram negative



Ungu Kristal/Kristal Violet (UK)



Sel berwarna ungu



Sel berwaran ungu



Larutan Iodium (I)



Kompleks UK-I terbentuk didalam sel; sel tetap berwarna ungu



Kompleks UK-I terbentuk didalam sel; sel tetap berwarna ungu



Alkohol



Dinding sel mengalami dehidrasi, pori-pori menciut; daya rembes dinding sel dan membran menurun, UK-I tak dapat keluar dari sel; sel tetap ungu



Lipid terekstraksi dari dinding sel, pori-pori mengembang; kompleks UK-I keluar dari sel; sel menjadi tak berwarna



Safranin



Sel tak terpengaruhi; sel tetap ungu



Sel menyerap zat pewarna ini; sel menjadi merah



Menurut Hadiotomo (1990), bakteri Gram-Positif dan bakteri Gram-Negatif memiliki karakteristik dan sifat yang berbeda. Perbedaan antara bakteri Gram-Positif dan GramNegatif tersebut terlihat pada Tabel 2: Tabel 2.2. Ciri-Ciri Bakteri Gram-Positif dan Bakteri Gram-Negatif PERBEDAAN RELATIF



CIRI



GRAM POSITIF



Struktur Dinding Sel



Komposisi dinding sel



GRAM NEGATIF



Tebal (15-80 mm)



Tipis (10-15 mm)



Berlapis tunggal (mono)



Berlapis tiga (multi)



Kandungan lipid rendah (1-4%) Kandungan lipid tinggi (11Peptidoglikan lapisan



sebagai



tunggal,



ada



22%)



komponenPeptidoglikan



utama merupakan lebih dari 50%lapisan berat kering sel bakteri



ada



kaku



dalam,jumlahnya



didalam sebelah sedikit,



merupakan 10% berat kering



Asam tekoat



Tidak ada asam tekoat Kerentanan



terhadap Lebih rentan



Kurang rentan



penisilin Pertumbuhan dihambat oleh Pertumbuhan dihambat denganPertumbuhan zat warna dasar (UK)



nyata



Persyaratan nutrisi



Relatif



tidak



begitu



dihambat rumit



pada



banyakRelatif sederhana



spesies Resistensi



terhadap Lebih resisten



Kurang resisten



gangguan fisik



Dengan metode pewarnaan gram, selain dapat mengelompokkan jenis bakteri menjadi Gram-Positif dan Gram-Negatif, juga dapat melihat berbagai morfologi dari suatu bakteri. Sel-sel individu bakteri dapat berbentuk seperti elips, bola, batang (silindris) atau spiral (heliks). Masing-masing ciri ini penting dalam mencirikan morfologi suatu spesies (Pelczar dan Chan, 2010).



Walau bentuk bakteri sangat bervariasi, namun secara umum hanya dibagi menjadi tiga tipe bentuk, yaitu: 1.



Kokus (Coccus) adalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola dan mempunyai beberapa variasi sebagai berikut:



2.



•



Mikrococcus, jika kecil dan tunggal. Contoh : Neisseria gonorrhoeae.



•



Diplococcus, jka berganda dua-dua. Contoh: Diplococcus pneumonia.



•



Tetracoccus, jika bergandengan empat dan membentuk bujur sangkar.



•



Sarcina, jika bergerombol membentuk kubus.



•



Staphylococcus, jika bergerombol.



•



Streptococcus, jika bergandengan membentuk rantai.



Basil (Bacillus) adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder, dan mempunyai variasi sebagai berikut:



3.



•



Monobacillus, hanya berbentuk satu batang tunggal. Contoh: Salmonella typhi.



•



Diplobacillus, jika bergandengan dua-dua.



•



Streptobacillus, jika bergandengan membentuk rantai. Contoh: Bacillus anthracis.



Spiral (Spirilum) adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai variasi sebagai berikut: •



Vibrio, (bentuk koma), jika lengkung kurang dari setengah lingkaran (bentuk koma). Contoh: Vibrio cholera.



•



Spiral, jika lengkung lebih dari setengah lingkaran. Contoh: Spirillum.



•



Spirochete, jika lengkung membentuk struktur yang fleksibel.



Bentuk tubuh/morfologi bakteri dipengaruhi oleh keadaan lingkungan, medium, dan usia. Walaupun secara morfologi berbeda-beda, bakteri tetap merupakan sel tunggal yang dapat hidup mandiri bahkan saat terpisah dari koloninya. Berbagai bentuk dari bakteri dapat dilihat pada Gambar 2.3:



Gambar2.3 Berbagai Morfologi Sel Bakteri (Sumber:ttp://id.wikipedia.org/wiki/Bakteri) Langkah awal sebelum melakukan proses pewarnaan adalah mempersiapkan spesimen mikroba yang akan diwarnai. Adapun langkah-langkah utama dalam mempersiapkan spesimen mikroba yang diwarnai untuk pemeriksaan mikroskopik ialah: 1.



Penempatan olesan atau lapisan tipis spesimen pada kaca objek.



2.



Fiksasi olesan itu pada kaca objek, biasanya dengan pemanasan, sehingga menyebabkan organisme melekat pada kaca objek. Aplikasi warna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau



reagen (pewarnaan diferensial) III. ALAT DAN BAHAN Alat: 1.



Gelas obyek



2.



Gelas penutup



3.



Mikroskop



4.



Loop inokulasi



5.



Nampan pewarnaan



6.



Bunsen



7.



Tisu



8.



Botol semprot Bahan:



•



Biakan bakteri:



1.



Escherichia coli



2.



Pseudomonas aeruginosa



3.



Staphylococcus aureus



4.



Bacillus megaterium



5.



Bakteri X1



6.



Bakteri X2



•



Bahan kimia:



1.



Alkohol



2.



Minyak emersi



3.



Aquades



4.



Kristal violet (Gram A)



5.



Yodium (Gram B)



6.



Alkohol 95% (Gram C)



7.



Safranin (Gram D)



IV.



CARA KERJA



1.



Bersihkan gelas obyek dan gelas penutup menggunakan alkohol.



2.



Buatlah smear suspensi bakteri pada gelas obyek, kemudian dikeringanginkan lalu fiksasi panas dengan melewatkan pada nyala api bunsen.



3.



Tetesi smear bakteri dengan zat warna kristal violet (Gram A) selama 1 menit.



4.



Cuci dengan aiir yang mengalir (dari botol semprot) secara perlahan diatas smear bakteri.



5.



Tambahkan yodium (Gram B), biarkan lagi selama 1 menit, lalu cuci lagi dengan air.



6.



Dekolorisasi dengan etil alkohol 95% (Gram C) selama 30 detik, lalu cuci lagi dengan air.



7.



Tahap terakhir, tambahkan safranin (Gram D) selama 30 detik, cuci lagi dengan air lalu keringkan.



8.



Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 X dengan terlebih dahulu gelas penutup ditetesi minyak emersi.



9.



Tentukan bentuk dan kelompokkan apakah tergolong bakteri Gram positif atau Gram negatif.



V.



Hasil Pengamatan 5.1 Tabel Hasil Pengamatan Data Kelas



Bacillus Kel



Staphylococcus



Escherichia



Pseudomonas



aureus



coli



aeruginosa



megaterium Bentuk Gram



1



Basil



+



2



Basil



+



3



Basil



+



4



Basil



+



Bentuk Coccus bergerombol Coccus bergerombol Coccus bergerombol Coccus bergerombol



Gram



Bentuk Gram Bentuk



Gram



Bakteri X1 Bentuk



Bakteri X2



Gram



Bentuk



Gram



-



Kokoid



-



Basil



-



Coccus



-



Basil



-



-



Kokoid



-



Basil



-



Basil



-



Basil



-



+



Kokoid



-



Basil



+



Basil



-



Basil



-



+



Kokoid



-



Basil



-



Coccus



-



Basil



-



Tabel 5.2 .Hasil pengamatan kelompok 2



Gambar



Spesies Bakteri



Bentuk Sel



Gram



Bacillus megaterium



Basil (batang)



Positif



Staphylococcus aureus



Coccus (bulat)



Negatif



bergerombol



Esherichia coli



Pseudomonas aeruginosa



Kokoid (batang pendek)



Basil (batang)



Negatif



Negatif



VI.



Bakteri X1



Basil (batang)



Negatif



Bakteri X2



Basil (batang)



Negatif



PEMBAHASAN Proses visualisasi bakteri yang masih hidup tidaklah mudah, karena bakteri mempunyai



ukuran yang kecil, transparan dan umumnya tidak berwarna apabila disuspensikan dalam medium cair. Keberhasilan dalam proses pewarnaan Gram, dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya: ketebalan smear, fiksasi (apabila terlalu lama dapat merusak dinding sel bakteri), lama pewarnaan, masa kadaluarsa zat warna, umur biakan (tidak boleh terlalu tua, umur



biakan ideal adalah 24 jam), dan proses pengeringan cukup dikering-aginkan tanpa perlu diusap dengan kertas tisu, hal ini mengakibatkan hasil pewarnaan gram akan bercampur dengan kotoran yang terdapat pada kertas tisu. Perbedaan dasar antara bakteri Gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme Gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme Gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri Gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri Gram negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Pada pengamatan ini, bakteri yang digunakan ialah E.coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus megaterium, serta dua bakteri yang tidak disebutkan nama spesiesnya. Hasil pengamatan dijelaskan dalam sub bab berikut: 1.



Escherchia coli Klasifikasi : Kingdom



: Bacteria



Filum



: Proteobacteria



Kelas



: Gammaproteobacteria



Ordo



: Enterobacteriales



Famili



: Enterobacteriaceae



Genus



: Escherchia



Spesies



: Escherchia coli (Wikipedia)



Hasil pengamatan dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 X, Escherchia coli dengan pewarnaan Gram termasuk dalam bakteri gram negatif, ditandai dengan sel yang berwarna merah dengan bentuk batang pendek (kokoid), koloninya berbentuk rantai panjang. Escherchia coli memiliki dinding sel dengan kandungan lipid yang tebal sehingga ketika ditambahkan kristal violet (Gram A) sebagai pewarna utama maka dinding sel bakteri Gram negatif akan menyerap zat warna tersebut dan sel berwarna biru keunguan. Setelah satu menit dan dicuci dengan air lalu diberi yodium (Gram B) untuk mengikat zat warna utama, kompkels UK-Y terbentuk di dalam sel, sehingga sel tetap berwarna biru keunguan. Tahap ketiga ditetesi alkohol 95%, lipid pada dinding sel terekstraksi, pori-pori mengembang, kompleks UK-Y keluar dari sel dan sel menjadi tidak berwarna (terdekolorisasi). Selanjutnya



diberi safranin (Gram D) sebagai pewarna tandingan, sel menyerap zat pewarna ini dan menjadi merah (Pelczar dan Chan, 2008). 2.



Bacillus megaterium Klasfikasi: Kingdom



: Bacteria



Filum



: Firmicutes



Kelas



: Bacilli



Ordo



: Bacillales



Famili



: Bacillaceae



Genus



: Bacillus



Spesies



: Bacillus megaterium (Wikipedia)



Pewarnaan Gram pada Bacillus megaterium diawali dengan membuat suspensi bakteri pada gelas objek. Suspensi diratakan (smear) pada gelas objek dengan loop inokulasi agar koloni bakteri dapat menyebar rata dan tidak bertumpuk. Setelah itu, difiksasi panas di atas api bunsen kurang lebih sampai suspensi kering (tidak boleh lama-lama). Fiksasi panas bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas pewarna (Tortora, 2002). Kemudian smear bakteri ditambahkan zat warna Kristal Violet (Gram A) selama 1 menit dan setelah itu, dicuci dengan air mengalir (aquades dari botol semprot) secara perlahan. Lalu ditambahkan Gram B (Larutan Yodium) sebagai larutan mordant selama 1 menit, selanjutnya didekolorisasi dengan Alkohol (Gram C) selama 30 detik dan tahap terakhir adalah dengan menambahkan Safranin (Gram D) sebagai larutan tandingan selama 30 detik. Setiap pemberian larutan, smear bakteri dicuci dengan aquades yang mengalir dan dikeringanginkan. Pencucian dengan air mengalir dimaksudkan agar zat warna yang diberikan dapat hilang secara sempurna dan tidak tersisa, dikeringanginkan ( tidak diusap dengan kertas tisu) bertujuan agar warna melekat pada dinding bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai lagi, warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang baru dan tidak bercampur dengan kotoran yang terdapat pada kertas tisu. Kemudian hasil pewarnaan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 X agar dapat diamati bentuk dan warna sel bakteri. Pada



pengamatan di mikroskop dengan perbesaran 1000 X, terlihat Bacillus megaterium berbentuk batang (basil) dan merupakan bakteri gram positif karena menunjukkan warna birukeunguan. Bacillus megaterium masuk ke dalam bakteri gram positif penghasil spora dan memiliki sifat obligate aerob, yang berarti membutuhkan oksigen untuk hidup. Ukuran selnya kurang lebih sebesar 2 x 4-5 µ. Bacillus megaterium merupakan salah satu golongan Eubacteria terbesar yang ditemukan di tanah. Koloni bakteri ini umumnya dijumpai dalam keadaan saling melekat satu sama lain seperti rantai dimana sel-sel tersebut dapat melekat karena adanya polisakarida yang terdapat pada dinding sel. Bacillus megaterium dapat bertahan di kondisi lingkungan yang ekstrem seperti gurun pasir karena kemampuannya dalam membentuk endospora yang melindunginya dari keadaan yang ekstrem. Bakteri ini merupakan penghasil utama untuk vitamin B12 dan amidase penicillin yang digunakan untuk membuat penisilin. Selain itu, Bacillus megaterium juga dapat memproduksi enzim yang berfungsi untuk memodifikasi kortikosteroid (sintetik steroid) dan stabilitas yang baik serta juga menghasilkan beberapa asam amino dehidrogenase. Penisilin merupakan antibiotik alami yang dapat berfungsi untuk menekan pertumbuhan bakteri patogen seperti bakteri Vibrio sp. Menurut Tag, et all (1976) Bacillus megaterium menghasilkan bakteriosin berupa megacin. 3.



Staphylococcus aureus Klasifikasi : Kingdom



: Bacteria



Filum



: Firmicutes



Kelas



: Cocci



Ordo



: Bacillales



Famili



: Staphylococcaceae



Genus



: Staphylococcus



Spesies



: Staphylococcus aureus (Rosenbach 1884)



Pada saat pengamatan sel bakteri tampak berwarna ungu karena di dalam dinding sel bakteri Staphylococcus aureus memiliki dinding yang tebal sehinnga saat bakteri mengalami dehidrasi, pori-porinya menciut yang akhirnya menyebabkan warna utama tidak bisa keluar. Terakhir diberi pewarna tandingan yaitu safranin. Bakteri Staphylococcus aureus terwarnai



merah, ini tidak sesuai dengan literatur yang ada, seharusnya Staphylococcus aureus setelah diwarnai dengan safranin bakteri memiliki warna yang sama dengan warna utama, yaitu warna ungu, karena Staphylococcus aureus termasuk bakteri gram positif. Kemungkinan besar hal ini disebabkan karena terlalu lama dalam pemberian safranin. Selanjutnya diamati bentuknya dengan menggunakan mikroskop. Dari uraian di atas, dapat dilihat bahwa Staphylococcus aureus memiliki karakteristik mikroskopik bila diamati dibawah mikroskop cahaya yaitu berbentuk kokus, biasanya bergerombol seperti anggur dalam bentuk tidak teratur, berpasangan, maupun tunggal, tidak membentuk spora dan tidak berkapsul. 4.



Pseudomonas aerogenosa Klasifikasi: Kingdom



: Bacteria



Filum



: Proteobacteria



Kelas



: Proteobacteria



Ordo



: Pseudomonadales



Famili



: Pseudomonadaceae



Genus



: Pseudomonas



Spesies



: Pseudomonas aeruginosa (Bergey, 1994)



Bakteri Pseudomonas aeruginosa setelah melalui proses pewarnaan gram, terlihat sel terwarnai oleh warna merah. Hal ini dikarenakan, Genus Pseudomonas terdiri dari sejumlah bakteri gram negatif, sehingga ketika diberi pewarna tandingan safranin, maka sel akan terwarnai okeh pewarna tersebut dikarenakan lapisan dinding yang tipis, bakteri ini juga merupakan bakteri aerob, bergerak dengan flagel, kalase postif, oksidase positif, bersifat patogen oportunistik, yaitu memanfaatkan kerusakan pada mekanisme pertahanan inang untuk memulai suatu infeksi, dan menyebabkan infeksi pada manusia dengan ketahanan tubuh yang menurun. Bakteri ini berbentuk batang, berukuran 0,6 x 2 μm, bergerak aktif dengan flagel monotrika (flagel tunggal pada kutub), tidak berspora, tidak mempunyai selubung, dan bersifat gram negatif (Jawetz, et al, 1996). Selain itu bakteri Pseudomonas aeruginosa merupakan



bakteri



hirokarbonoklastik



yang



mampu



mendegradasi



berbagai



jenis



hidrokarbon. Keberhasilan penggunaan bakteri Pseudomonas aeruginosa dalam upaya



bioremediasi lingkungan akibat pencemaran hidrokarbon membutuhkan pemhaman tentang mekanisme interaksi antara bakteri Pseudomonas aeruginosa dengan senyawa hidrokarbon. 5.



Bakteri X1 Kultur bakteri ini diambil pada media padat (agar miring) dengan penampakan pada



media berwarna putih. Setelah dilakukan pewarnaan gram dengan zat warna kristal violet, larutan lugol atau yodium, alkohol, dan safranin dan dilakukan pengamatan dibawah mikroskop (perbesaran 1000x) didapatkan penampakan struktur morfologi bakteri X1 berbentuk basil (batang) dan berwarna merah. Warna merah menunjukkan bahwa bakteri X1 termasuk kelompok gram negatif. Berdasarkan data kelas, hasil pengamatan kelompok 1 dan 4 mendapati struktur morfologi bakteri X1 berbentuk coccus (bulat) sedangkan kelompok 2 dan 3 berbentuk basil (batang). Hasil pengamatan keempat kelompok tersebut mendapati bakteri X1 berwarna merah, hal ini menunjukkan bahwa bakteri X1 termasuk kelompok bakteri gram negatif. Dinding sel bakteri gram negatif mengandung rantai peptidoglikan yang tipis sehingga pada saat diberi zat warna kristal violet (warna ungu) sebagai zat warna utama, sel akan berwarna ungu, ketika diberi larutan lugol atau yodium (warna kuning), warna ungu pada sel akan tetap dipertahankan karena larutan lugol atau yodium merupakan pengikat zat warna utama yaitu kristal violet, setelah dilakukan dekolorisasi (penghilangan zat warna) dengan alkohol 95%, sel akan mengalami dehidrasi, lipid terekstraksi dari dinding sel, pori-pori dinding sel mengembang dan sel tidak mampu mempertahankan zat warna kristal violet (warna ungu) sehingga zat warna kristal violet tersebut keluar menuju lingkungan ekstraseluler dan sel menjadi tidak berwarna dan saat diberi zat warna tandingan yaitu safranin (warna merah), kondisi sel yang tidak mengandung zat warna menjadikan zat warna safranin terkonsentrasi menuju dalam sel, sel akan menyerap zat warna safranin tersebut dan hal ini menjadikan sel berwarna merah. Bakteri batang dan coccus gram negatif aerobik diantaranya termasuk famili Pseudomonadaceae, Azotobacteraceae, Rhizobiaceae, Methylococcaceae, Halobacteriaceae, Acetobacteriaceae, Legionellaceae dan Neisseriaceae. Sedangkan bakteri batang gram negatif fakultatif anaerobik diantaranya famili Enterobacteriacea termasuk didalamnya sub famili Escherichia (Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigella); famili Klebsiellae (Klebsiella, Enterobacter, Hofnia, Serrotia); famili Proteae (Proteus); famili Yersiniae (Yersinia); Erwineae (Erwinia).



6.



Bakteri X2 Selain bakteri X1 yang tanpa diketahui nama spesiesnya, pada praktikum ini juga



terdapat satu bakteri tanpa diketahui nama spesiesnya diberi label X2, kultur bakteri diambil dari media cair setelah dilakukan pewarnaan Gram, hasil yang diperoleh dari pengamatan ialah pada masing-masing kelompok 1-4, spesimen biakan bakteri tersebut tergolong dalam bakteri gram negatif setelah dilakukan pewarnaan gram, karena menampakan koloni sel yang berwarna merah,



dengan koloni berbentuk basil. Dari pengamatan yang dilakukan,



kemungkinan bakteri yang dimaksud ialah kelompok bakteri gram negatif, berbentuk basil, dimana bisa jadi bakteri tersebut tergolong dalam bakteri dengan memfermentasi laktosa, atau tidak memfermentasi laktosa, seperti yang dijelaskan dalam gambar di bawah ini.



Gambar 5.2 Bagan pengelompokan bakteri gram-negatif ( Sumber: http://id.wikipedia.org/wiki/Berkas:Gram_-_algorithm.png ) Untuk menentukan spesies bakteri yang dimaksud tersebut (X2), maka tidak cukup dengan melakukan pewarnaan gram saja, namun membutuhkan uji selanjutnya, misalnya dengan uji biokimia. VII. KESIMPULAN Dari hasil pengamatn dapat disimpulkan bahwa: 1.



Keberhasilan dalam proses pewarnaan Gram, dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya: ketebalan smear, fiksasi (apabila terlalu lama dapat merusak dinding sel bakteri), lama pewarnaan, masa kadaluarsa zat warna, umur biakan (tidak boleh terlalu



tua, umur biakan ideal adalah 24 jam), dan proses pengeringan cukup dikering-aginkan tanpa perlu diusap dengan kertas tisu, hal ini mengakibatkan hasil pewarnaan gram akan bercampur dengan kotoran yang terdapat pada kertas tisu. 2.



Bacillus subtilis berbentuk batang (basil) dan merupakan bakteri gram positif karena menunjukkan warna biru-keunguan, penghasil spora dan memiliki sifat obligate aerob, yang berarti membutuhkan oksigen untuk hidup.



3.



Escherichia coli dengan pewarnaan Gram termasuk dalam bakteri gram negatif, ditandai dengan sel yang berwarna merah dengan bentuk batang pendek (kokoid), koloninya berbentuk rantai panjang.



4.



Pseudomonas sp. bersifat gram negatif, berbentuk batang, berukuran 0,6 x 2 μm, bergerak aktif dengan flagel monotrika (flagel tunggal pada kutub), tidak berspora, tidak mempunyai selubung, dan



5.



Staphylococcus aureus merupakan gram positif berbentuk kokus, biasanya bergerombol seperti anggur dalam bentuk tidak teratur, berpasangan, maupun tunggal, tidak membentuk spora dan tidak berkapsul.



6.



Bakteri X1 berbentuk batang dan coccus gram negatif aerobik diantaranya termasuk famili



Pseudomonadaceae,



Azotobacteraceae,



Rhizobiaceae,



Methylococcaceae,



Halobacteriaceae, Acetobacteriaceae, Legionellaceae dan Neisseriaceae. Sedangkan bakteri batang gram negatif fakultatif anaerobik diantaranya famili Enterobacteriacea termasuk didalamnya sub famili Escherichia (Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigella); famili Klebsiellae (Klebsiella, Enterobacter, Hofnia, Serrotia); famili Proteae (Proteus); famili Yersiniae (Yersinia); Erwineae (Erwinia). 7.



Bakteri X2 kelompok bakteri gram negatif, berbentuk basil, dimana bisa jadi bakteri tersebut tergolong dalam bakteri dengan memfermentasi laktosa, atau tidak memfermentasi laktosa.



LAMPIRAN Gambar



Keterangan



Larutan untuk pewarnaan gram : 1. Kristal violet 2. Lugol atau Iodin atau Yodium 3. Alkohol 4. Safranin



Proses sterilisasi jarum inokulum dengan nyala api bunsen.



Pengambilan kultur murni bakteri (Bacillus megaterium; Staphylococcus aureus; Escherichia coli; Pseudomonas aeruginosa.; bakteri X1 dan X2) menggunakan jarum inokulum. Pembuatan smear suspensi bakteri : Untuk media padat terlebih dahulu obyek glass ditetesi aquades sekitar 1-2 tetes kemudian jarum inokulum dioleskan secara rata. Sedangkan untuk media cair tanpa ada penambahan aquades -



Dikeringanginkan kemudian dilakukan fiksasi panas dengan melewatkan pada nyala api bunsen



Penetesan 1 tetes zat warna kristal violet (Gram A) selama 1 menit. Zat warna kristal violet berwarna ungu.



Pencucian dengan aquades mengalir (dari botol semprot) secara perlahan diatas smear bakteri.



Penetesan 1 tetes zat warna lugol atau yodium (Gram B) selama 1 menit. Zat warna lugol berwarna kuning. Pencucian dengan aquades mengalir (dari botol semprot) secara perlahan diatas smear bakteri.



Dekolorisasi dengan 1 tetes etil alkohol 95% (Gram C) selama 30 detik.



Pencucian kembali dengan aquades mengalir (dari botol semprot) secara perlahan diatas smear bakteri.



Penambahan safranin (Gram D) selama 30 detik.



Pencucian kembali dengan aquades mengalir (dari botol semprot) secara perlahan diatas smear bakteri.



Hasil smear dan pewarnaan bakteri pada obyek glass ditutup dengan cover glass kemudian ditetesi minyak emersi dan diamati pada mikroskop pada perbesaran 1000x.



Hasil pengamatan Bacillus megaterium



Hasil pengamatan Staphylococcus aureus



Hasil pengamatan Escherichia coli



Hasil pengamatan Pseudomonas aeruginosa



Hasil pengamatan bakteri X1



Hasil pengamatan bakteri X2



DAFTAR PUSTAKA Dwijoseputro, d. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan. Fardiaz, Srikandi. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Jakarta: Gramedia Pustaka Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia. Hadiotomo, Ratna Sri. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: PT Gramedia. Hardiningsih, Riani, Rostiati Nonta Refina Napitupulu, dan Titin Yulinery. 2006. Isolasi dan Uji Resistensi Beberapa Isolat Lactobacillus pada pH Rendah. Biodiversitas Vol 7 No.1. Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1. Pelczar, Michael J dan E.C.S.Chan. 2010. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. Jakarta: UI Press. Suriawiria, U. 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: Gramedia. Sutedjo, M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta: Rineka Cipta.



Tagg, J.R., Dajani A.S. dan Wannamaker L.W. 1976. Bacteriocins of Gram Positive Bacteria. Bacteriology Review 40: 722-756. Tjitrosomo. 1982. Dunia Mikroba. Jakarta; Bharata Karya. Tortora, G. J., B. R. Funke, and C. L. Case. 2002. Microbiology; An Introduction. New York: Addison Wesley Longman. Volk, Wesley A dan Margareth F. Wheeler. 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga. Anonim.2010.Pseudomonasaeruginosa.http://digilib.unimus.ac.id/files/disk1/106/jtptunimus dl-nisaakmala-5280-2-bab2.pdf. Diakses pada tanggal 16 Maret 2013.