Laporan Praktikum Iv [PDF]

Citation preview

PRAKTIKUM IV UJI POTENSI SENYAWA ANTIMIKROBA SECARA DIFUSI SUMURAN DAN DIFUSI PAPER DISK I.



TUJUAN Mengetahui ada tidaknya potensi antibakteri dari suatu senyawa antimikroba, misalnya antibiotik, secara difusi sumuran dan difusi paper disk.



II.



DASAR TEORI Antibiotika adalah senyawa kimia khas yang dihasilkan atau diturunkan oleh organisme hidup, termasuk struktur analognya yang dibuat secara sintetik, yang dalam kadar rendah mampu menghambat proses penting dalam kehidupan satu spesies atau lebih mikroorganisme. Pada awalnya antibiotika diisolasi dari mikroorganisme, tetapi sekarang beberapa antibiotika telah didapatkan dari tanaman tinggi atau binatang (Soekardjo, 1995). Suatu zat antibiotik kemoterapeutik yang idealnya hendaknya memiliki sifatsifat sebagai berikut: harus mempunyai kemampuan untuk merusak atau menghambat mikroorganisme patogen spesifik. Makin besar jumlah dan macam mikroorganisme



yang



dipengaruhi



makin



baik.



Tidak



mengakibatkan



berkembangnya bentuk-bentuk resiten parasit. Tidak menimbulkan efek sampingan yang tidak dikehendaki pada inang, seperti reaksi alergis, kerusakan pada saraf, iritasi pada ginjal atau saluran gastrointestin. Tidak melenyapkan flora mikroba normal pada inang. Gangguan terhadap flora normal dapat mengaucaukan „keseimbangan alamiah sehingga memungkinkan microbe yang‟ biasanya nonpatogenik atau bentuk-bentuk patogenik yang semula dikendalikan oleh flora normal, untuk menimbulkan infeksi baru (Pelczar, 1988).  Antibiotika pertama kali ditemukan oleh Alexander Fleming pada tahun 1929, yang secara kebetulan menemukan suatu zat antibakteri yang sangat efektif yaitu penisilin. Penisilin ini pertama kali dipakai dalam ilmu kedokteran tahun 1939 oleh Chain dan Florey. Sebagian besar dari antibiotika rumus kimianya telah diketahui dan beberapa di antaranya dapat dibuat secara sintesis. Definisi dari antbiotik ialah suatu bahan kiia yang dikeluarkan oleh jasad renik/hasil sintetis, semi-sintetis yang



mempunyai struktur yang sama dan zat ini dapat merintangi/memusnahkan jasad renik lainnya (Widjajanti, 1996) Antibiotik yang efektif bagi banyak spesies bakteri, baik kokus, basil maupun spiril, dikatakan mempunyai spektrum luas. Sebaliknya, suatu antibotik yang hanya efektif untuk spesies tertentu, disebut antubiotik yang spektrumnya sempit. Penisilin hanya efektif untuk memberantas terutama jenis kokus, oleh karena itu penisilin dikatakan mempunyai spectrum yang sempit. Tetrasiclin efektif bagi kokus, basil dan jenis spiril tertentu. Oleh karena itu tetrasiclin dikatakan mempunyai spectrum luas (Dwidjoseputro, 2003) Senyawa antimikroba adalah senyawa yang mampu menghambat pertumbuhan mikroba tau membunuh mikroba. Interaksi antara mikroba dan zat antimikroba selalu menghasilkan tiga hal yaitu penghambatan pertumbuhan mikroba, mikroba terbunuh atau mikroba resisten. Berbagai interaksi ini muncul tergantung dari potensi senyawa antimikroba, kemampuan evolusi mikroba atau cara pengunaan antimikroba tersebut. Potensi antimikroba merupakan salah satu factor yang penting. Potensi antimikroba ini dapat diteliti dengan berbagai metode. Cara pengujian potensi (daya atau kekuatan) senyawa antimikroba ada bermacam- macam, tergantung pada sifat dan bentuk sediaan senyawa antimikroba. Namun secara umum uji potensi antimikroba dapat dilakukan dengan 2 macam metode, yaitu metode difusi dan metode dilusi. Pada umumnya digunakan cara pengenceran, paper disk diffusion method dan agar dillution plate method. (Jutono, 1980) Penentuan kepekaan bakteri patogen terhadap antimikroba dapat dilakukan dengan salah satu dari dua metode pokok yakni dilusi atau difusi. Penting sekali untuk menggunakan metode standar untuk mengendalikan semua faktor yang mempengaruhi aktivitas antimikroba (Jawetz. 1995). Pada umumnya metode yang dipergunakan dalam uji sensitivitas bakteri adalah metode Difusi Agar yaitu dengan cara mengamati daya hambat pertumbuhan mikroorganisme oleh ekstrak yang diketahui dari daerah di sekitar kertas cakram (paper disk) yang tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme. Zona hambatan pertumbuhan inilah yang menunjukkan sensitivitas bakteri terhadap bahan anti bakteri (Jawelz, 1995). Prinsip kerja metode difusi adalah terdifusinya senyawa antimikroba (misalnya antibiotik) ke dalam media padat dimana mikroba uji (misalnya bakteri patogen)



telah diinokulasikan. Metode difusi dapat dilakukan secara paper disk dan secara sumuran. media (Lay, 1994). Pada metode difusi secara paper disk, kertas disk yang mengandung antibiotik diletakkan di atas permukaan media agar yang telah ditanam mikroba uji, setelah itu hasilnya dibaca. Penghambatan pertumbuhan mikroba oleh antibiotik terlihat sebagai zona jernih di sekitar pertumbuhan mikroba. Metode difusi secara sumuran dilakukan dengan membuat sumuran dengan diameter tertentu pada media agar yang telah ditanami mikroba uji. Sumuran dibuat tegak lurus terhadap permukaan media. Antibiotik diinokulasikan ke dalam sumuran ini dan diinkubasikan, setelah itu hasilnya dibaca seperti pada difusi secara paper disk. Luasnya zona jernih merupakan petunjuk kepekaan mikroba terhadap antibiotic. Selain itu, luasnya zona jernih juga berkaitan dengan kecepatan berdifusi antibiotik dalam media (Lay, 1994). Zona Hambat merupakan tempat dimana bakteri terhamabat pertumbuhannya akibat antibakteri atau antimikroba. Zona hambat adalah daerah untuk menghambat pertumbuhan mikroorrganisme pada media agar oleh antibiotik. Contohnya: tetracycline, erytromycin, dan streptomycin. Tetracycline merupakan antibiotik yang memiliki spektrum yang luas sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri secara luas (Pelczar, 1986). Uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan metode difusi dan metode pengenceran. Disc diffusion test atau uji difusi disk dilakukan dengan mengukur diameter zona bening (clear zone) yang merupakan petunjuk adanya respon penghambatan pertumbuhan bakteri oleh suatu senyawa antibakteri dalam ekstrak. Syarat jumlah bakteri untuk uji kepekaan/sensitivitas yaitu 105-108 CFU/mL (Pelczar, 1986). III.



ALAT DAN BAHAN 1. Alat gelas : petridish steril, tabung reaksi, erlenmeyer, pipet ukur, pipet tetes, gelas ukur 2. Mikropipet,



pelobang



gabus



no.



4,



jangka sorong/penggaris,



jarum ose, spidol, kertas label, vortex mixer, spreader 3. Senyawa uji berupa antibiotik (misalnya Amoxycilllin sirup kering) dengan variasi konsentrasi : 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml 4. Kultur murni bakteri uji dalam media NB umur 24 jam



5. Media nutrien agar (NA) 6. Deret larutan standar Mac Farland 7. Nutrient Broth (NB) untuk pembuatan suspensi bakteri uji 8. Aquadest steril sebagai pelarut senyawa uji 9. Alkohol 70 % 10. Disk antibiotik (paper disk yang mengandung antibiotik penisilin/ampisilin) sebagai kontrol positif. 11. Disk blank 12. Buffered Pepton Water (BPW) untuk pembuatan suspensi bakteri uji



IV. I. a.



PROSEDUR KERJA Uji Potensi Senyawa Antibiotik Secara Difusi Sumuran Preparasi Senyawa Uji Preparasi senyawa uji dilakukan sesuai petunjuk dalam kemasan ↓ buatlalh variasi variasi komposisi uji ↓ Pada praktikum ini dibuat 4 variasi konsentrasi senyawa uji (konsentrasi 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml (Perhatikan cara pembuatan konsentrasi senyawa uji!)



b.



Persiapan Mikroba Uji



Siapkan kultur murni bakteri uji. ↓ Siapkan deret larutan standard Mac Farland. Buat sebanyak 2 tabung @10 ml suspensi bakteri uji menggunakan media BPW ↓ Setarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mac Farland II (konsentrasi mikroba 6. 108 CFU/ml). c.



Pengujian potensi antibiotik secara difusi sumuran Siapkan beberapa petri berisi 20 ml media nutrient agar (NA), 15 ml NA steril dan 5 ml NA steril ↓



Pembuatan kontrol kontaminasi media Buka petri berisi 20 ml media NA, secara aseptis buatlah sumuran pada petri dengan pelubang gabus no. 4.



↓ Ambil bulatan NA pada sumur yang dibuat dengan jarum ose secara hati-hati sehingga NA di sekelilingnya tidak tergores/rusak ↓ Masukkan bulatan NA tersebut dalam beker glass berisi alkohol. ↓ Beri label pada dasar petri: kel. prakt/tgl/perlakuan ↓ Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji secara double layer Tuang 5 ml NA steril ke dalam cawan petri steril, biarkan memadat sebagai base layer agar. ↓ Ambil 1 ml suspensi bakteri uji, inokulasikan ke dalam 15 ml media NA secara pour plate, kemudian tuangkan secara merata sebagai seed layer agar di atas base layer agar, biarkan memadat. ↓ Buat 1 sumuran dengan menggunakan pelubang gabus No. 4. Pembuatan sumuran dilakukan sampai dasar seed layer agar dan tidak menembus base layer agar yang berfungsi sebagai dasar sumuran. ↓ Beri label pada dasar petri kel. prakt/tgl/perlakuan/nama bakteri uji. ↓ Uji dengan metode difusi sumuran Tuang 5 ml NA steril ke dalam cawan petri steril, biarkan memadat sebagai base layer agar. ↓ Ambil 1 ml suspensi bakteri uji, inokulasikan ke dalam 15 ml media NA secara pour plate, kemudian tuangkan secara merata sebagai seed layer agar di atas base layer agar, biarkan memadat. ↓ Buat 1 sumuran dengan menggunakan pelubang gabus No. 4. Pembuatan sumuran dilakukan sampai dasar seed layer agar dan tidak menembus base layer agar yang berfungsi sebagai dasar sumuran. Lalu tuangkan dengan mikropipet larutan antibiotic dengan konsentrasi yang berbeda ke dalam sumuran. ↓ Beri label pada dasar petri: kel. prakt/tgl/perlakuan/nama bakteri uji. II.



Uji Potensi Senyawa Antibiotik Secara Difusi paper disk a. Preparasi Mikroba Uji Siapkan kultur murni bakteri uji. ↓



Siapkan deret larutan standard Mac Farland ↓ Buat 10 ml suspensi bakteri uji menggunakan media BPW dan setarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mac Farland II (konsentrasi mikroba 6. 108 CFU/ml). b. 1.



Pengujian potensi antibiotik secara difusi paper disk Pembuatan kontrol kontaminasi media



Siapkan 20 ml media NA dan tuang secara aseptis ke dalam petri steril, biarkan memadat ↓ Beri label pada dasar petri: kel. prakt/tgl/perlakuan. 2.



Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji Ambil 0,2 ml suspensi bakteri uji, inokulasikan ke dalam petri berisi media NA secara spread plate (harus merata di seluruh permukaan media) dan biarkan permukaan agar mengering. ↓ Beri label pada dasar petri: kel. prakt/tgl/perlakuan/bakteri uji



3. Pengujian potensi antibiotik secara difusi paper disk Siapkan petri berisi 20 ml media nutrien agar (NA) ↓ Ambil 0,2 ml suspensi bakteri uji, inokulasikan ke media NA secara merata dengan cara spread plate dan biarkan permukaan agar mengering. ↓ Secara aseptik,letakkan 1 disk antibiotik (disk yang mengandung penisilin/ampisilin) dan 1 disk blank (yang mengandung berbagai konsentrasi senyawa uji antibiotik sebanyak 20 µL), serta 1 disk blank kontrol negatif (disk yang mengandung pelarut) pada permukaan media NA. ↓ Setiap paper disk diinokulasikan dengan jarak tertentu secara teratur, agar supaya tidak terjadi overlapping zona hambat yang terbentuk. ↓ Beri label pada dasar petri secara benar ↓ Inkubasikan selama 24 jam. Amati zona keruh dan jernih di setiap petri ↓ Amati, gambar pertumbuhannya dan ukur diameter zona jernih yang terbentuk di sekitar paper disk dengan jangka sorong



V.



LEMBAR PENGAMATAN



PERCOBAAN



HASIL PENGAMATAN



KETERANGAN



HASIL PENGAMATAN



KETERANGAN



DIFUSI SUMURAN 1. Kontrol kontaminasi media



2. Kontrol Pertumbuhan Bakteri



3. Uji Difusi Sumuran



PERCOBAAN



DIFUSI PAPER DISK 1. Kontrol kontaminasi media



2. Kontrol Pertumbuhan Bakteri



3. Uji



Difusi



Paper Disk



DAFTAR PUSTAKA



Dwidjoseputro. 2003. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan. Jawetz. 1995. Mikrobiologi untuk Profesi Kesehatan. Jakarta: EGC Jutono, dkk. 1980. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum. Yogyakarta: Departemen Mikrobiologi, Fakultas Pertanian UGM. Lay, B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT Raja Grafindo Persada. Pelczar. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi 2. Jakarta: Universitas Indonesia Press. Soekardjo, B. 1995. Kimia Medisinal. Jakarta: Airlangga University Press. Widjajanti. 1996. Obat-obatan. Yogyakarta: Kanisus.



LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DAN VIROLOGI UJI POTENSI SENYAWA ANTIMIKROBA SECARA DIFUSI SUMURAN DAN DIFUSI PAPER DISK



Hari, Tanggal Praktikum : Kelas A2B / Golongan I / Kelompok II



Nama Dosen



I Nyoman Adi Parawita



(171200169)



I Wayan Darma Yoga



(171200170)



Ida Bagus Aditya Wijaya



(171200171)



Kadek Elyana Adiyasa



(171200172)



Kadek Ita Oktapianti



(171200173)



Komang Yoga Utama



(171200174)



Made Ayu Megantini



(171200175)



Made Dio Lokantara



(171200176)



Ni Kadek Evy Suhartaty



(171200177)



:



Nama Asisten Dosen :



PROGRAM STUDI FARMASI KLINIS INSTITUT ILMU KESEHATAN MEDIKA PERSADA BALI 2019