Laporan WANTAI Hbsag [PDF]

Citation preview

Judul



: Pemeriksaan WANTAI HBsAg ELISA



Hari/Tanggal : Sabtu, 18 Januari 2019 Tujuan



:



Untuk mendeteksi antigen virus Hepatitis B (HBsAg) di dalam serum/plasma secara kualititatif Prinsip



:



Untuk dekteksi HBsAg, WANTAI HBsAg ELISA menggunakan metode antibodi “sandwich” ELISA dimana, strip polystyranne microwell (sumuran) sudah dilapisi terlebih dahulu (precoated) dengan antobodi monoclonal yang spesifik terhadapp HBsAg. Serum/plasma pasien ditambahkan ke dalam microwell bersamaan dengan antibodi sekunder berkonjugasi dengan enzim horse radish peroksidase (HRP – conjugate) yang akan menempel pada berbagai epitop pada HBsAg. Selama inkubasi, kompleks imun yang terbentuk karena adanya HBsAg yang spesifik di dalam serum/plasma pasien, akan ditangkap/menempel pada bagian dasar (solidphase) microwell (sumuran). Setelah dicuci untuk membuang non-spesifik serum protein dan HRP – conjugate yang tidak berikatan, larutan komogen yang mengandung tetramethylbenzidine (TMB) dan urea peroksida ditambahkan ke dalam sumuran. Adanya kompleks imun “sandwich” antibodi – antigen – antibodi (HRP), kromogen yang semula tidak berwarna akan dihidrolisis oleh HRP-conjugate dan berubah menjadi produk berwarna biru. Warna biru akan berubah menjadi kuning ketika ditambahkan stop solution (asam sulfat) untuk menghentikan reaksi hidrolisis enzim. Intensitas warna kuning yang dihasilkan dapat diukur dan kadar antigen (HBsAg) yang terdapat dalam sumuran dapat dihitung, sesuai dengan proporsi intensitas warna yang dihasilkan pada akhir reaksi. Kadar antigen yang didapat mewakili kadar antigen di dalam sampel serum/plasma pasien. Sumuran yang tidak mengandung HBsAg (negative) akan tetap tidak berwarna. Alat dan Bahan : 1. Mircowell plate (sumur mikrotiter) : Sumuran sudah dilapisi oleh antibodi monoclonal yang spesifik terhadap HBsAg. 2. Negative control : Larutan berwarna kuning di dalam vial dengan tutup berwarna hijau. Mengandung buffer dengan protein yang sudah distabilkan, teruji negatif untuk HBsAg 3. Positive control : Larutan berwarna merah di dalam vial dengan tutup berwarna merah. HBsAg dilarutkan dalam buffer protein yang sudah distabilkan. 4. HRP – Conjugate : Larutan berwarna merah di dalam vial berwarna putih dengan tutup berwarna merah. Mengandung enzim Horse Radish Peroksidase yang dikonjugasi dengan anti- HBs. 5. Wash – Buffer : larutan tak berwarna di dalam botol transparan dengan tutup berwarna putih. Larutan buffer mengandung surfactant. Pengenceran harus



dilakukan dengan rasio 1 : 20 dengan diionized water (air distilasi) sebelum digunakan. Setelah diencerkan, stabilitas larutan sampai dengan 1 minggu pada suhu ruang, dan 2 minggu pada suhu 2 – 8 oC. 6. Chromogen Solution A : Larutan tidak berwarna di dalam vial berwarna putih dengan tutup berwana hijau. Larutan urea peroksidase. 7. Chromogen solution B : Larutan tidak berwarna di dalam vial berwarna hitam dengan tutup berwarna hitam. Larutan TMB (Tetramethyl benzydine). 8. Stop Solution : Larutan tidak berwarna di dalam vial berwarna putih dengan tutup berwana putih. Larutan asam sulfat yang sudah diencerkan (0,5 M H2SO4). Semua reagen siap dipakai dengan penyimpanan pada suhu 2 – 8 oC dan stabilitas 4 minggu setelah reagen dibuka, terkecuali untuk Wash-Buffer saja. Di dalam kit WANTAI HBsAG ELISA juga disediakan : - Plastic Sealable Bag (kantung plastik) : untuk menyimpan microwell strips - Cardboard Plate Cover (Penutup) : untuk menutup microwell saat reaksi berlangsung   



Distilled water (air distilasi) Timer (penghitung waktu) Mikropipet



Jenis Sampel dan Penyimpanannya : Kriteria sampel yang dapat digunakan untuk deteksi HBsAg dengan metode WANTAI adalah : -



Serum Plasma (EDTA/ heparin/ Natrium Citrate) Tidak lisis, lipemik, atau ikterik Sampel tidak berasal dari cairan tubuh (urin, cairan spinal, pleura, sputum) Penyimpanan sampel pada suhu 2-8oC, untuk sampel yang akan diperiksa dalam kurun waktu 1 minggu setelah diterima, disimpan pada suhu -200C - Hindari penggunaan sampel yang sudah dicairkan dan dibekukan ulang Penyimpanan dan Stabilitas Reagen : Komponen di dalam kit akan stabil sampai pada tanggal kadaluarsa (expiration date) yang tertera pada kit dengan penyimpanan pada suhu 2 – 80C, jangan pada suhu freezer/beku. Untuk memastikan kualitas dan akurasi pemeriksaan Wantai HBsAg, selama penyimpanan harus meminimalkan adanya kontaminasi dari mikroorganisme atau cairan kimia lainnya.



Hal-hal yang harus diperhatikan : Pemeriksaan dengan metode ELISA sangat sensitif terhadap suhu dan waktu/masa inkubasi. Untuk menghindari hasil yang tidak valid, seluruh tahapan dalam cara kerja harus dilakukan dengan baik dan benar, tidak boleh diubah. 1. Jangan mengganti reagen dengan reagen dari lot yang berbeda atau dari komersial kit lainnya (berbeda merk). Komponen yang ada di dalam kit sudah distandarisasi untuk memberikan hasil yang optimal untuk pemeriksaan HBsAg 2. Pastikan semua reagen belum melewati tanggal kadaluarsa (expiration date) dan memiliki lot yang sama. Jangan gunakan reagen yang sudah kadaluarsa. 3. PERHATIAN KHUSUS. Adaptasikan seluruh reagen pada suhu ruang (18-300C) terlebih dahulu sebelum memulai pemeriksaan. Lakukan homogenisasi untuk setiap reagen dan kembalikan ke dalam kulkas (2-80C) segera setelah selesai digunakan. 4. Volume sampel yang digunakan harus sesuai dengan yang tertera pada cara kerja. Jika volume sampel kurang/lebih dapat mengurangi tingkat sensitivitas dari pemeriksaan ini. 5. Bagian bawah dari sumuran tidak boleh dipegang , hindarkan dari sidik jari atau goresan karena dapat mengganggu pembacaan. Ketika proses pembacaan sedang berlangsung, pastikan bagian bawah dari sumuran tidak basah dan tidak ada gelembung udara di dalam sumuran 6. Setelah tahap pencucian pastikan sumuran tidak dibiarkan kering, segera lanjutkan ke tahap selanjutnya. Hindari terbentuknya gelembung udara saat memasukan reagen ke dalam sumuran. 7. Pastikan prosedur kerja pada semua sumuran dilakukan secara bersamaan 8. Kalibrasi mikropipet secara berkala untuk memastikan akurasi volume sampel dan reagen yang dimasukan ke dalam sumuran. Gunakan mikrotip yang berbeda untuk setiap sampel dan reagen yang berbeda untuk menghindari terjadinya kontaminasi silang. 9. Pastikan suhu saat tahap inkubasi adalah 370C di dalam inkubator 10. Ketika menambahkan sampel/reagen ke dalam sumuran, pastikan mikrotip tidak menyentuh bagian dasar sumuran 11. Ketika mengukur absorbansi dengan plate reader, tentukan panjang gelombangnya 450nm atau 450/630 nm 12. Aktivitas enzim HRP-conjugate dapat dipengaruhi oleh adanya debu atau bahan kimia reaktif lainnya seperti natrium hipoklorit, asam, basa, dll. Jangan lakukan pemeriksaan pada lingkungan yang mengandung bahan kimia tersebut. 13. Jika menggunakan alat otomatis, selama tahap inkubasi, jangan tutup sumuran dengan penutup (plate cover). Setelah tahap pencucian, sisa-sisa cairan dari dalam sumuran dapat dibersihkan dari penutup (plate cover) 14. Semua sampel yang berasal dari manusia harus dikategorikan sebagai sampel infeksius. Perhatikan prosedur personal safety / laboratory safety pada Good Laboratory Practice.



15. PERINGATAN : Bahan yang berasal dari manusia kemungkinan besar digunakan dalam persiapan negative control yang ada pada kit. Bahan-bahan ini telah diuji dan memberikan hasil negative terhadap antibody HCV, HIV1/2, TP, dan HBsAg. Namun, tidak ada metode pemeriksaan yang dapat memastikan bahwa antigen infeksius tersebut benar-benar tidak ditemukan dalam reagen pada kit. Maka dari itu, perlakukan seluruh reagen dan sampel sebagai bahan infeksius. Bovine serum telah digunakan untuk menstabilkan negatif dan positif kontrol. Bovine Serum albumin (BSA) dan Fetal calf sera (FCS) berasal dari hewan dari area geografis yang bebas BSE/TSE 16. Jangan makan, minum, merokok, atau menggunakan kosmetik di dalam laboratorium. Jangan menggunakan pipet dengan mulut. 17. Bahan-bahan kimia harus ditangani dan dibuang dengan teknik yang baik dan benar sesuai dengan GLP 18. Mikrotips, vial, strip, dan wadah specimen harus dikumpulkan dan di autoklaf selama 2 jam pada suhu 1210C atau direndam dengan natrium hipoklorit 10% selama 30 menit untuk dekontaminasi sebelum dilakukan proses pembuangan. Cairan yang mengandung natrium hipoklorit tidak boleh di autoklaf. MSDS (Material Safety Data Sheets) tersedia jika dibutuhkan 19. Beberapa reagen dapat menyebabkan keracunan, iritasi, luka bakar, atau bersifat karsinogenik. Hindari kontak dengan kulit atau selaput mukosa. 20. Stop solution mengandung 0.5M H2SO4 yang merupakan asam kuat. Gunakan dengan sangat hati-hati. Bersihkan segera jika ada tumpahan atau jika terkena kulit/selaput mukosa, segera bersihkan dengan air 21. ProClin 300 1% digunakan sebagai pengawet/ preservatives yang dapat mengakibatkan iritasi kulit. Bersihkan dengan air segera jika terkena kulit/mata.



Cara Kerja



:



Persiapan Reagen 1. Adaptasikan seluruh reagen di dalam kit pada suhu ruang (18-300C) 2. Periksa reagen Wash-Buffer dari pembentukkan kristal garam, jika terbentuk kristal hangatkan wash-buffer pada suhu 37oC sampai kristal terlarut kembali. 3. Pengenceran wash buffer dengan rasio 1 : 20 menggunakan deionized water (air distilasi. Berikut tabel penjelasan cara kerja pemeriksaan WANTAI HBsAg ELISA :



Step 1



Persiapan -



Step 2



Penambahan Sampel -



Step 3



Penambahan HRP – conjugate Inkubasi -



Step 4 Step 5



Pencucian (Washing)



-



-



-



Step 6



Pewarnaan



-



Step 7



Penghentian Reaksi



-



Step 8



Pengukuran Absorbansi



-



Beri label pada 3 sumuran sebagai Negative control (B1, C1, D1) , 2 Positive control ( E1, F1) dan 1 Blank (A1 , tidak ditambahkan sampel dan larutan HRP-conjugate) Jika pembacaan menggunakan dual wavelength plate reader, Blanko tidak perlu digunakan. Tambahkan masing- masing 50 uL Positive control, Negative control, dan sampel pada sumuran , lalu resuspensi. Ganti mikrotip untuk setiap specimen untuk menghindari hasil positif/negatif palsu Tambahkan 50 uL HRP-conjugate ke dalam setiap sumuran (kecuali Blanko), resuspensi, dan plate sumuran ditepuk perlahan. Tutup sumuran dengan penutup yang sudah disediakan dan inkubasi selama 60 menit pada suhu 37oC Pada akhir inkubasi, buang penutup sumuran, dan cuci setiap sumuran sebanyak 5x dengan menggunakan wash-buffer yang sudah dilarutkan Buang campuran yang ada pada sumuran, dan tambahkan wash-buffer ke dalam setiap sumuran. Pada tiap kali pencucian, biarkan wash-buffer di dalam sumuran selama 30 60 detik Pada akhir pencucian, sumuran di letakkan secara terbalik di atas kertas tissue, dan ditepuk perlahan untuk memastikan tidak ada larutan yang tertinggal di dalam sumuran. Tambahkan 50uL Chromogen A dan 50 uL Chromogen B ke dalam setiap sumuran (termasuk Blanko) Inkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit. Hindari cahaya langsung (keadaan gelap) Reaksi antara chromogen dan HRP-conjugate akan menghasilkan warna biru pada Positive control dan serum yang positif HBsAg Tambahkan 50 uL Stop Solution ke dalam setiap sumuran dan homogenkan Warna kuning akan dihasilkan ada Positive control dan serum yang positif HBsAg Kalibrasi plate reader dengan Blanko dan baca absorbansinya pada panjang gelombang 450 nm. Jika menggunakan dual wavelength filter, gunakan panjang gelombang 630 nm. Hitung nilai cut-off yang didapatkan dan evaluasi hasil



-



Pembacaan absorbansi harus dilakukan dalam waktu 10 menit setelah menambahkan stop solution



Petunjuk untuk tahap pencucian 1. Teknik pencucian yang baik sangat penting untuk mendapatkan hasil yang benar dan presisi. 2. Direkomendasikan untuk menggunakan ELISA microplate washer yang berkualitas baik. Pada umumnya, tidak kurang dari 5 siklus pencucian otomatis (350-400 uL/well) cukup untuk menghindari reaksi positif palsu 3. Untuk menghindari kontaminasi silang pada sampel atau HRP conjugat,setelah inkubasi, jangan buang cairan di dalam sumuran tetapi biarkan plate washer mengaspirasi secara otomatis. 4. Pastikan bahwa selang yang mengeluarkan microplate washer liquid (cairan pencuci sumuran) tidak terkontaminasi dan terhambat, dan volume washer liquid yang dikeluarkan cukup ke dalam setiap sumuran. 5. Jika melakukan tahap pencucian secara manual, lakukan 5 siklus pencucian, dengan 350400uL/sumuran dan aspirasi cairan tersebut sebanyak 5 kali. Jika didapatkan hasil yang kurang baik, tambahkan siklus pencucian dan waktu perendaman per sumuran 6. Cairan yang diaspirasi dalam mikrotip harus dilarutkan dengan larutan natrium hipoklorit 2.5% selama 24 jam sebelum dibuang 7. Cairan wash buffer harus diencerkan dengan rasio 1 : 20 sebelum digunakan. Jika tidak menggunakan seluruh sumuran dalam 1 plate, hitung volume larutan wash buffer yang dibutuhkan saja.



Hasil



:



Pembahasan Quality Control



:



Quality control harus dilakukan sebagai langkah validasi, memastikan bahwa pemeriksaan telah dilakukan dengan teknik yang baik dan benar. Pada teknik WANTAI HBsAg ELISA, digunakan 2 jenis control yaitu positive control dan negative control, quality control dinyatakan valid jika : -



Nilai absorbansi Blanko (kromogen dan stop solution), < 0.080 pada panjang gelombang 450 nm Nilai absorbansi Negative control ≤ 0.100 pada panjang gelombang 450-630 nm atau 450 nm dengan blanko Nilai absorbansi Positive control ≥0.800 pada panjang gelombang 450-630 nm atau 450 nm dengan blanko



Nilai cut off (value of C.O/NC) pada teknik ini adalah 2.1. NC adalah rata-rata nilai absorbansi dari ketiga negative control. Jika nilai NC kurang dari 0.05 maka dianggap nilainya sama dengan 0.05. Jika lebih dari satu nilai absorbansi pada negative control tidak sesuai pada kriteria di atas, maka harus dilakukan pengulangan dan hasil pemeriksaan tidak dapat diinterpretasikan karena belum valid.



a. Interpretasi Hasil Setelah ditentukan nilai cut off (C.O) dan dibaca absorbansi pada setiap sampel, hasilnya dapat diinterpretasikan sebagai berikut : Hasil Negative



Nilai A/C.O < 1



Positive



A/C.O ≥ 1



Interpretasi Sampel memiliki nilai absorbansi kurang dari nilai cut off, yang berarti tidak terdeteksi adanya HBsAg di dalam sampel - Pasien tidak terinfeksi HBV - Kantong darah dapat ditransfusikan ke pasien Sampel memiliki nilai absorbansi lebih dari nilai cut off, yang berarti sampel terdeteksi HBsAg - Sampel yang terdeteksi HBsAg harus dilakukan pengulangan sebagai tindakan konfirmasi sebelum interpretasi hasil - Sampel yang positif HBsAg pada kedua test (awal dan konfrimasi) dapat diinterpretasikan bahwa pasien tersebut positif HBsAg (terinfeksi HBV) - Kantong darah yang positif HBsAg tidak boleh ditransfusikan ke pasien.



Borderline



A/C.O 0.9 – 1.1



Sampel memiliki nilai absorbansi diantara nilai cut off (0.9 – 1.1) disebut borderline dan sampel harus dilakukan pengulangan sebagai tindakan konfirmasi sebelum interpretasi hasil.



Skema Interpretasi Hasil (Kualitatif) Pengulangan (DUPLO)



Pos(+) , Pos (+)



Pos(+) , Neg (-)



Pos(+)



Neg (-) , Neg (-)



A/C.O ≥0.9



A/C.O < 0.9



Interpretasi Follow up



Borderline -Tidak dapat diintepretasikan



Neg (-)



Penjelasan Skema Interpretasi Hasil (Kualitatif) -



-



-



Setelah dilakukan pengulangan (duplo), keduanya didapatkan hasil negative A/C.o < 0.9 maka sampel dapat dinyatakan tidak ada positif palsu dan dapat diinterpretasikan sebagai NEGATIF Setelah dilakukan pengulangan (duplo), salah satu atau keduanya didapatkan hasil positif maka dapat diinterpretasikan bahwa sampel POSITIF terhadap HBsAg dan pasien dapat didiagnosa terinfeksi HBV Setelah dilakukan pengulangan (duplo), didapatkan nilai absorbansi yang mendekati nilai cut off,maka hasil pemeriksaan tidak dapat diinterpretasikan dan dinyatakan masuk dalam kategori borderline. Pasien dengan sampel dengan borderline harus dilakukan pengulangan pemeriksaan pada kurun waktu tertentu.



WANTAI HBsAg ELISA mendeteksi HBsAg secara kualitatif, hasil yang dapat diinterpretasikan hanya sebatas Positif atau Negatif saja, teknik ini tidak mampu memberikan informasi titer/kadar antigen yang diperiksa di dalam sampel. (kuantitatif)



b. Karakteristik teknik WANTAI HBsAg ELISA Kelebihan teknik WANTAI HBsAg ELISA - Nilai clinical specificity 99.88 % pada pasien dan 99.64% pada donor, cukup spesifik untuk mendeteksi HBsAg



- Nilai clinical sensitivity didapatkan dari pemeriksaan sampel pasien positif HBsAg dari beberapa fase penyakit hepatitis (akut, kronik, dan pemulihan). Fase akut memiliki nilai sensitivitas 100 %, fase kronik 99,75% dan fase pemulihan 100% - Tidak ditemukan reaksi silang pada sampel dari pasien yang terinfeksi dengan HAV, HCV, HIV, CMV, dan TP - Tidak ada pengaruhi dari nilai rheumatoid factor hingga 2000 I/mL - Sampel yang dibekukan telah diuji untuk menilai pengaruh dari penyimpanan dan pengambilan sampel. Keterbatasan teknik WANTAI HBsAg ELISA - Hasil positif harus dikonfirmasi dengan menggunakan teknik lain dan interpretasi harus berdasarkan informasi kondisi klinis pasien - Antigen HBsAg terkadang tidak dapat dideteksi pada awal infeksi HBV, karena titer antigen yang sangat kecil. Teknik WANTAI hanya dapat mendeteksi secara kualitatif, tidak mampu mengukur kadar antigen di dalam sampel. - Kesalahan dalam melakukan prosedur yang paling sering adalah :  Menggunakan reagen kit yang sudah kadaluarsa  Reagen terkontaminasi (penyimpanan tidak benar)  Teknik pencucian yang tidak benar mengakibatkan hasil positif palsu  Tidak menambahkan reagen sesuai dengan prosedur yang ada  Menggunakan sampel yang lisis, lipemik , ikterik dan masih mengandung fibrin (clotted serum) Kesalahan teknik tersebut dapat mengakibatkan hasil positif atau negatif palsu yang akan menyebabkan kesalahan diagnosa jika interpretasi hasil tersebut dilaporkan kepada klinisi/dokter.



Kesimpulan : Pada praktikum ini praktikan dapat melakukan pemeriksaan untuk mendeteksi HBsAg di dalam serum pasien dengan metode WANTAI HBsAg ELISA. Metode sandwich ELISA digunakan sebagai prinsip dasar teknik pemeriksaan WANTAI HBsAg ELISA, meskipun teknik ini memiliki sensivitas dan spesifitas yang cukup tinggi untuk deteksi HBsAg namun teknik ini hanya memberikan hasil secara kualitatif, titer antigen tidak dapat diukur dengan teknik ini. Berbagai macam faktor dapat mempengaruhi hasil pemeriksaan seperti faktor teknik pemeriksaan, penyimpanan reagen, dan jenis sampel yang dipakai. Oleh karena itu, dalam melakukan pemeriksaan ini harus selalu disertai dengan quality control baik positif



maupun negatif kontrol agar hasil yang dinterpretasikan valid dan dapat digunakan untuk diagnosis dan prognosis pasien.