Contoh Laporan Praktikum [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI



POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)



OLEH:



NAMA



: ALFIANI NUR OCTAVIA



NIM



: K1A017025



KELOMPOK



: 02



HARI / TANGGAL



: RABU / 13 MEI 2020



ASISTEN



: ELFIRA WAHDALIA



SHIFT



:A



KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN KIMIA LABORATORIUM KIMIA ANORGANIK PURWOKERTO 2020



POLYMERASE CHAIN REACTION



I.



TUJUAN 1. Melakukan reaksi PCR dari DNA hasil isolasi 2. Melakukan elektroforesis dan visualisasi DNA hasil PCR 3. Mengukur jarak migrasi pita DNA hasil elektroforesis



II.



TINJAUAN PUSTAKA PCR merupakan metode molekular untuk menggandakan potongan DNA



hingga berjuta kali lipat dalam waktu yang relatif singkat. Penggandaan tersebut tidak terlepas dari penggunaan enzim dan sepasang primer bersifat spesifik terhadap DNA target yang akan dilipatgandakan. Sehingga nantinya dapat digunakan untuk keperluan lain yang berkaitan dengan DNA. Komponenkomponen yang harus ada dalam proses PCR antara lain DNA cetakan yaitu potongan DNA yang akan dilipatgandakan, primer yaitu suatu potongan atau sequence dari oligonukleotida pendek yang digunakan untuk mengawali sintesis DNA, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan enzim DNA polimerase yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA, dan senyawa bufer (Erlich, 1989). Proses pemecahan untai DNA ganda menjadi untai tunggal disebut denaturasi DNA template, biasanya terjadi pada suhu 95oC selama 1–2 menit sehingga DNA yang berupa untai ganda (double stranded) akan terpisah menjadi untai tunggal. Kemudian dilanjutkan dengan proses penempelan (annealing) primer pada DNA cetakan pada suhu 56oC selama 1 menit. Primer akan membentuk ikatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer. Tahap selanjutnya yakni sintesis DNA dimana akan terbentuk DNA baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan dengan bantuan enzim DNA polimerase. Tahap sintesis ini biasanya terjadi pada suhu 72oC selama 1– 2 menit. Tahapantahapan tersebut diulangi 25–35 siklus. Di akhir proses PCR maka hasilnya disimpan pada suhu 4o C (Yuwono, 2006).



Salah satu faktor penting yang mempengaruhi kualitas deteksi molekular berbasis PCR yakni pemilihan primer yang tepat (Rychlik et al., 1990). Primer PCR merupakan oligonukleotida yang berperan untuk mengawali proses amplifikasi molekul DNA. Keberadaan primer PCR tersebut menyebabkan gen target akan teramplifikasi sepanjang reaksi PCR berlangsung (Marchesi et al., 1998). Pemanfaatan gen 16S rRNA telah digunakan sebagai parameter sistematik molekular yang universal, representatif, dan praktis untuk mengkonstruksi kekerabatan filogenetik pada tingkat jenis atau spesies. Hal ini disebabkan karena keberadaan gen tersebut tidak tergantung pada kondisi pertumbuhan dan media yang digunakan (Case et al., 2007). Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012). Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Jean and Francois G., 2010). Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks & Andersen, 1999). Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama (Campbell dkk, 2002).



III.



METODOLOGI PERCOBAAN



3.1.Alat Alat utama yang digunakan pada percobaan ini adalah Cold Centrifuge, mikropipet, tip mikropipet (10 mL, 200 mL, 1000 mL), Eppendorf 2 mL, water bath, Elektroforesis, UV transiluminator, timbangan analitik, dan Erlenmeyer. 3.2.Bahan Bahan utama yang digunakan pada percobaan ini adalah DNA hasil isolasi dari isolat murni mikroba (aktinomisetes) koleksi laboratorium Biokimia yang ditumbuhkan dalam media SCN cair, PCR grade water, PCR kit KAPA Taq Extra HotStart ReadyMix with dye, Primer 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG), Primer 1492 R (TACGGYTACCTTG TTTACGACTT), aqua bidest, agarosa, buffer TAE 1x, loading dye, EtBr, dan DNA marker. 3.3.Prosedur Kerja a) Amplifikasi DNA Menggunakan PCR kit KAPA Taq Extra HotStart ReadyMix with dye 1. Sebanyak 2 μL DNA template hasil isolasi dengan konsentrasi 0.5 μM ditambahkan dengan 19 μL PCR grade water, 25μL 2X KAPA Taq Extra HotStart



ReadyMix



with



dye,



2μL



primer



27F



(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) konsentrasi 0.5 μM, dan 2 μL primer 1492R (TACGGYTACCTTGTTTACGACTT) konsetrasi 0.5 μM. 2. Proses amplifikasi DNA dilakukan dengan kondisi: Pemanasan pertama 95oC selama 3 menit, kemudian dilanjutkan dengan denaturasi 15 detik pada suhu 94oC, annealing 15 detik pada suhu 50oC, ekstensi 1 menit pada suhu 68oC, pendinginan (cooling) pada suhu 4oC dan menggunakan 30 siklus b) Elektroforesis dan Visualisasi DNA DNA hasil amplifikasi PCR dianalisis dengan elektroforesis pada agarosa 1%.



1. 0,4 g agarosa ditambah 40 mL buffer TAE 1x 2. Campuran diaduk sambil dipanaskan hingga homogen. 3. Setelah larutan agarosa mulai hangat (57oC) ditambahan EtBr (konsentrasi akhir 0,5 g/mL). 4. Larutan lalu dituang dalam pencetak gel dengan sisir yang sudah terpasang kurang lebih 1 cm dari ujung pencetak gel. Jika ada gelembung udara, maka gelembung tersebut dihilangkan atau disingkirkan menggunakan ujung tip pipet mikro. 5. Gel didiamkan selama 15 menit sampai membeku. Setelah gel padat, sisis dilepaskan secara hati-hati. 6. Gel dimasukkan ke dalam instrumen elektroforesis yang telah diisi buffer TAE 1x. Sebanyak 10 µl sampel DNA hasil PCR dimasukkan ke dalam sumuran gel agarosa. 7. Elektroforesis dilakukan dalam buffer TAE 1x selama 1 jam pada 100 V, 500 mA. 8. Hasil elektroforesis divisualisasi pada Gel Doc Printgraph (Boinstrument, ATTO) menggunakan UV transiluminator untuk mengetahui hasil dan ukuran pita DNA. 9. Jarak migrasi dari masing-masing pita DNA diukur. Berdasarkan jarak migrasi standar DNA maka dapat dibuat kurva hubungan antara Log pasangan basa standar DNA dengan jarak migrasinya sehingga diperoleh persamaan regresi. 10. Berdasarkan persamaan regresi tersebut, ditentukan BM DNA sampel. DNA amplikon yang menunjukkan kemurnian dan ketepatan ukuran pita DNA selanjutnya dilakukan sekuensing DNA.



3.4.Skema Kerja a) Amplifikasi DNA Menggunakan PCR kit KAPA Taq Extra HotStart ReadyMix with dye



b) Elektroforesis dan Visualisasi DNA



IV.



HASIL DAN PEMBAHASAN



4.1.Data Pengamatan Tabel 4.1. Data Pengukuran Migrasi Marka dan Sampel DNA No.



Ukuran Marka (bp)



Log Pasangan Basa



Jarak Migrasi (mm)



1



10000



4



23



2



8000



3,9031



25



3



6000



3,7782



28



4



5000



3,6989



29



5



4000



3,6021



31



6



3000



3,4771



34



7



2500



3,3979



37



8



2000



3,301



39



9



1500



3,1761



44



10



1000



3,0000



50



11



750



2,8751



54



12



500



2,6989



59



13



250



2,3979



65



14



Sampel 1



3,145



45



15



Sampel 2



3,181



44



16



Sampel 3



3,181



44



4.2.Data Perhitungan a= 132,5 b=-27,82 r= 0,9910



y= bx + a



Sampel 1



Sampel 2



y= -27,82 x + 132,5



y= -27,82 x + 132,5



45= -27,82 x + 132,5



44= -27,82 x + 132,5



27,82x = 87,5



27,82x = 88,5



x



x



= 3,145



y= -27,82 x + 132,5



= 3,181



BM = antilog 3,145



BM = antilog 3,181



BM = 1396



BM = 151



Sampel 3 y= -27,82 x + 132,5 44= -27,82 x + 132,5



x= 3,181 BM = antilog 3,181 BM = 1517



27,82x = 88,5



4.3. Pembahasan Reaksi polimerase berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106 107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya (Sambrook & Russel, 2001). Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik amplifikasi sekuens DNA target spesifik secara in vitro. PCR berdasarkan pada aktivitas DNA polimerase. Amplifikasi PCR dapat mengubah sedikit molekul asam nukleat target spesifik menjadi mikrogram DNA (Degen et al., 2006). Prinsip kerja PCR adalah reaksi berulang yang dilakukan oleh polimerase yaitu enzim yang mampu merangkai DNA building block menjadi untai molekular yang panjang.Selain itu dibutuhkan pula nukleotida yang mengandung empat basa nitrogen dan primer (Sumner, 2003). a) Amplifikasi DNA Menggunakan PCR kit KAPA Taq Extra HotStart ReadyMix with dye Sampel DNA yang digunakan untuk amplifikasi adalah DNA template hasil isolasi. Pada percobaan ini, Amplifikasi DNA Menggunakan PCR kit KAPA Taq Extra HotStart ReadyMix with dye. Untuk satu prosedur, sebanyak 2 μL sampel DNA dengan konsentrasi 0.5 μM ditambahkan dengan 19 μL PCR grade water, 25μL 2X KAPA Taq Extra HotStart ReadyMix with dye, 2μL primer 27F konsentrasi 0.5 μM, dan 2 μL primer 1492R konsetrasi 0.5 μM. Sampel DNA diamplifikasi dengan kondisi: Pemanasan pertama 95oC selama 3 menit, kemudian dilanjutkan dengan denaturasi 15 detik pada suhu 94oC, annealing 15 detik pada



suhu 50oC, ekstensi 1 menit pada suhu 68oC, pendinginan (cooling) pada suhu 4oC dan menggunakan 30 siklus. Menurut Degen et al., (2006), sintesis PCR melibatkan tiga tahap, antara lain denaturasi, annealing, dan ekstensi. PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Denaturasi Setelah pemanasan pertama pada 95oC selama 3 menit, untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal (94oC) selama 15 detik. Proses ini menyebabkan DNA yang tadinya memiliki untai ganda menjadi untai tunggal Penempelan DNA yang sudah terdenaturasi kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk memberikan waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA. Pada percobaan ini, annealing dilakukan pada 50oC selama 15 detik. Ekstensi Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya keadaan ini dilakukan antara 20-40 siklus. Target DNA yang diinginkan (short “target” product) akan meningkat secara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non-target (long product) akan meningkat secara linier (Newton and Graham, 1994). Ekstensi pada percobaan ini dilakukan selama 1 menit pada suhu 68oC, pendinginan (cooling) pada suhu 4oC. menggunakan 30 siklus.



b) Elektroforesis dan Visualisasi DNA Elektroforesis merupakan suatu metode pemisahan molekul yang menggunakan medan listrik (elektro) sebagai penggerak molekul dari matriks penyangga berpori (foresis). Metode ini sangat umum digunakan untuk



memisahkan molekul yang bermuatan atau dibuat bermuatan (Fatchiyah, 2011). Teknik ini dapat digunakan untuk memanfaatkan muatan listrik yang ada pada molekul misalnya DNA yang bersifat negatif. Molekul yang dapat dipisahkan antara lain DNA, RNA, atau protein. Jika suatu molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarosa, kemudian dialiri aurs listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (Yuwono, 2005).



Gambar 4.1. Gel elektroforesis hasil PCR sampel 1, 2, dan 3 dengan marka (standard DNA) 1 kb Hasil visualisasi PCR lalu diamati menggunakan pendekatan metode elektroforesis gel agarosa. Hasil visualisasi PCR memperlihatkan pita fragmen DNA untuk sampel 1, 2, dan 3 dengan jarak migrasi standar DNA tertentu. Jarak migrasi untuk sampel 1 adalah 45mm, sedangkan untuk sampel 2 dan 3 adalah 44mm. Berdasarkan data tersebut, dapat dibuat kurva hubungan antara log pasangan basa standar DNA dengan jarak migrasi.



jarak migrasi



Hubungan antara Log Pasangan Basa Standar DNA dengan Jarak Migrasi 70 60 50 40 30 20 10 0



65



59 54 50



44 39 37 34 31 29 28 25 23



log pasangan basa



Gambar 4.2. Kurva Hubungan antara Log Pasangan Basa Standar DNA dengan Jarak Migrasi Berdasarkan kurva di atas, kemudian dihitung persamaan regresi, yang nantinya akan digunakan untuk menentukan BM dari masing-masing sampel. Persamaan regresi yang didapatkan yaitu y = -27,82 x + 132,5, dengan nilai r = 0,9910. Langkah berikutnya yaitu menentukan BM dari masing-masing sampel. Berat molekul untuk sampel 1 adalah sebesar 1396g/mol, serta untuk sampel 2 dan 3 adalah 1517g/mol. Penggunaan PCR memiliki kelebihan yaitu dalam ketepatan setiap proses dalam tahapan amplifikasi, amplifikasi dapat dilakukan secara manual tanpa mesin termocycle tetapi akan memudahkan dalam penelitian menggunakan mesin PCR lebih cepat dan hasil akan sesuai dengan yang di inginkan, akan tetapi membutuhkan pengaturan waktu optimasi yang sesuai dengan sampel yang digunakan agar tidak merusak sampel yang kita masukkan. Tahap yang menentukan keberhasilan teknik PCR adalah tahap denaturasi yang merupakan awal dari amplifikasi, jika tidak terjadi denaturasi makan proses selanjutkan akan mengalami kesalahan, baik kesalahan penempelan primer sampai kesalahan amplifikasi target yang diinginkan (Newton and Graham, 1994).



V.



KESIMPULAN 1. DNA hasil isolasi diamplifikasi untuk memperoleh DNA yang lebih banyak. 2. Elektroforesis dan visualisasi hasil PCR dari DNA yang telah diamplifikasi menghasilkan jarak migrasi yang berbeda untuk ketiga sampel. 3. Jarak migrasi untuk sampel 1 adalah 45mm, sampel 2 adalah 44mm, dan sampel 3 adalah 44mm.



DAFTAR PUSTAKA Asnani, A., Ryandini, D., & Suwandri. (2016). Screening of Marine Actinomycetes from Segara Anakan for Natural Pigment and Hydrolytic Activities. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. Vol. 107. Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. (2002). BIOLOGI. Ed ke-5. Erlangga: Jakarta. Case, R.J., Y. Boucher, I. Dahllöf, C. Holmström, W.F. Doolittle, & S. Kjelleberg. (2007). Use of 16S rRNA and rpoB Genes as Molecular Markers for Microbial Ecology Studies. Applied and Environmental Microbiology. 73: 278–288. Degen, H., A. Deufel, D. Eisel, S. Grunewald-Janho, & J. Keesey. (2006). PCR Application Manual. Third Edition. Roche Diagnotics GmbH, Mannheim: Germany Erlich, H.A. (1989). PCR technology: Principles and Applications for DNA Amplifications Using a Pseudo-Testcross: Mapping Strategy and RAPD Markers. Genetics. 137: 1121-1137. Stockton Press, NY. Fatchiyah, Arumingtyas, E. L., Widyarti, S., Rahayu, S. 2011. Biologi Molekular, Prinsip Dasar Analisis. Penerbit Erlangga: Jakarta. Fairbanks, D.J., W.R. Andersen. (1999). Genetics: The continuity of life. Brooks/Cole Publishing Company: New York. Jean, Francois Giot. (2010). Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical Chemistry. Journal of Medical Biochemistry. 29 (1). Magdeldin, S. (2012). Gel Electrophoresis – Principles and Basic. InTech Europe: Croatia. Marchesi, J.R., T. Sato, A.J. Weightman, T.A. Martin, J.C. Fry, S.J. Hiom, & W.G. Wade. (1998). Design and Evaluation of Useful Bacterium Specific



PCR Primer that Amplify Genes Coding for Bacterial 16S-rRNA. Applied and Environmental Microbiology. 64: 795–799. Newton, C.R. and A. Graham. (1994). PCR. Bios Scientific Publisher: UK. Rychlik, W., W.J. Spencer, & R.E. Rhoads. (1990). Optimization of the Annealing Temperature for DNA Amplification In vitro. Nucleic Acids Research. 18: 6409–6412. Sambrook, J., E.F. Fritsch, & T. Maniatis. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York. Sumner,



T.



(2003). Chromosome



Organization



and



Function. Blackwell



Publishing. Yuwono, T. (2006). Bioteknologi Pertanian. Seri Pertanian. Gadjah Mada University Press: Yogyakarta.