Laporan Praktikum Pestisida [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM STUDI BALAI BESAR B2P2VRP SALATIGA DAN BALAI LITBANG P2B2 BANJARNEGARA Dosen Pembimbing :



1. Dr. Ir. Martini, M.Kes 2. Dra. Retno Hestiningsih, M.Kes



Disusun oleh : 1. Ade Margus V 2. Dominggus Ongky



25000118183006 11. Arfian Azwar 25000118183020 12. Reyzi Hanandita



25000118183022 25010116130207



3. Nicholas Avorandi



25010116140183 13. Rery Afianto



25010116120048



4. 5. 6. 7. 8.



25010116120120 25010116130244 25000118183032 25000118183003 25000118183004



25010116120116 25000118183017 25010116120105 25010116130190 25000118183009



Condro Sukma P Inggita Raiesa Awaludin Yusran Rushadi Airin Nur Hidayah



9. Kautsari Meitia 10. Nurul Isro Ulviana



14. Diana Wulandari 15. Trivano Yonathan 16. Erika Widya P 17. Adji Bayu M 18. Ramadani S



25000118183010 19. Suhartati 25010116120269 ENTOMOLOGI KESEHATAN FAKULTAS KESEHATAN MASYARAKAT UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG 2019



25000118183014



KATA PENGANTAR Puji syukur Tuhan YME yang telah melimpahkan anugerah-Nya sehingga penyusunan Laporan Kunjungan dan PraktiKum di Balai Litbang P2B2 Banjarnegara dan Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Vektor dan Reservoir Penyakit (B2P2VRP) Salatiga dapat tersusun dengan baik. Pembuatan laporan ini kami lakukan untuk memenuhi tugas kompetensi dasar peminatan entomologi. Walaupun waktunya cukup singkat, tapi kegiatan ini menghasilkan sesuatu yang berharga dalam mengaplikasikan ilmu yang didapatkan dari perkuliahan yang sedang kami jalani melalui praktik yang dilakukan secara langsung. Dengan selesainya laporan praktikum ini, maka tidak lupa kami ucapkan terima kasih kepada semua orang yang sudah membantu kami. dan terima kasih juga untuk pihak yang sudah terlibat langsung. khususnya kami ucapkan kepada : 1.



Dr. Ir. Martini, M.Kes dan Dra. Retno Hestiningsih, M.Kes selaku dosen pembimbing selama kegiatan kunjungan dan praktikum



2.



Kepala Balai Litbang Pengendalian Penyakit Berbasis Binatang (P2B2) Banjarnegara yang sudah memberikan ijin kepada kami untuk melakukan kunjungan dan praktikum



3.



Joko Waluyo, ST, MScPH selaku kepala Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Vektor dan Reservoir Penyakit (B2P2VRP) Salatiga yang sudah memberikan ijin kepada kami untuk melakukan kunjungan dan praktikum



4.



Seluruh staf dari kedua tempat terkait yang telah membantu dan membimbing kami selama kegiatan kunjungan dan praktikum Kami mohonkan saran dan kritiknya apabila terdapat banyak kekurangan



pada hasil laporan praktikum ini. Semoga laporan ini memberi banyak kegunaan pada semua pihak termasuk kami. Terima kasih. Semarang,



Penulis



ii



Oktober 2019



DAFTAR ISI LAPORAN PRAKTIKUM.................................................................................................i KATA PENGANTAR........................................................................................................ii DAFTAR ISI.....................................................................................................................iii BAB I UJI BIOASSAY KELAMBU.................................................................................1 1.



PENDAHULUAN..................................................................................................1



2.



HASIL....................................................................................................................3



2.



PEMBAHASAN..................................................................................................10



4.



PENUTUP............................................................................................................14



5.



Daftar Pustaka......................................................................................................15



BAB II POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR).....................................................16 1.



PENDAHULUAN................................................................................................16



2.



HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................................17



3.



PENUTUP............................................................................................................27



4.



Daftar Pustaka......................................................................................................28



BAB III. DETEKSI LEPTOSPIROSIS............................................................................29 1.



PENDAHULUAN................................................................................................29



2.



HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................................31



3.



PENUTUP............................................................................................................39



4.



Daftar Pustaka......................................................................................................40



BAB IV. IMUNOHISTOKIMIA.....................................................................................41 1.



PENDAHULUAN................................................................................................41



2.



HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................................44



3.



PENUTUP............................................................................................................49



4.



DAFTAR PUSTAKA...........................................................................................50



BAB V. UJI BIOKEMIS ELISA.....................................................................................51 1.



PENDAHULUAN................................................................................................51



2.



PEMBAHASAN..................................................................................................53



3.



PENUTUP............................................................................................................65



4.



DAFTAR PUSTAKA...........................................................................................66



5.



DOKUMENTASI.................................................................................................68



BAB VI. SUSCEPTIBILITY...........................................................................................70 1.



PENDAHULUAN................................................................................................70



iii



2.



TINJAUAN PUSTAKA.......................................................................................72



3.



METODE.............................................................................................................74



4.



HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................................77



5.



PENUTUP............................................................................................................79



6.



DAFTAR PUSTAKA...........................................................................................80



BAB VII. FOGGING, ULV, IRS.............................................................................................81 1.



PENDAHULUAN....................................................................................................81



2.



HASIL DAN PEMBAHASAN....................................................................................83



3.



PENUTUP............................................................................................................102



4.



DAFTAR PUSTAKA.........................................................................................103



5.



DOKUMENTASI PRAKTIKUM......................................................................104



iv



BAB I UJI BIOASSAY KELAMBU 1. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Pengendalian vektor nyamuk terdiri dari beberapa langkah. langkah awal dengan menurunkan populasi nyamuk, dengan memberantas tempat perindukan nyamuk dan juga aktivitas untuk membunuh nyamuk dewasa ataupun larva nyamuk dengan insektisida. Penyemprotan rumah dan pemakaian kelambu berinsektisida pada prinsipnya memperpendek umur nyamuk sehingga penyebaran dan penularan penyakit dapat terputus. (Intan Ahmad, 1996) Kelambu merupakan sebuah tirai tipis, tembus pandang dengan jaringjaring yang dapat melindungi penggunanya dari vektor penyakit seperti serangga nyamuk, lalat dan lainnya, kelambu juga disebut bedcanopy. Sedangkan kelambu yang ditambahkan insektisida mulai dikembangkan tahun 1980 untuk mencegah penyakit malaria dengan menambahkan residu insektisida piretroid atau permethrin yang mampu membunuh dan mengusir nyamuk. Biossay test adalah sebuah metode yang dirancang untuk mengalisis suatu senyawa oleh dosis yang sesuai terhadap system biologi seperti binatang, jaringan, mikroba dan lain-lain dengan membandingkan sampel yang diuji dengan standar internasional dengan perlakuan sama. Uji IBiossay test dapat digunakan untuk uji resistensi penggunaan kelambu berinsektisida. (Sugiarto et al., 2017) Penggunaan kelambu berinsektisida harus memenuhi standar WHO yaitu memiliki daya bunuh tingi, penggunaan aman bagi manusia, serta memiliki efek residu yang Panjang. Salah satuya bahan insektisida yang direkomendasi oleh WHO yaitu golongan piretroid sintetik, (permethrin, cypermethrin, delta metrin dan lamda sihalotrin). Selain itu WHO juga menetapkan kriteria nyamuk yang digunakan untuk uji bioassay, yaitu sugar-fed (dalam kondisi kenyang) dengan usia kurang dari 7 hari setelah menetas dari pupa. (Nurmaliani et al., 2016) Untuk itu dalam meningkatkan pengetahuan dan keterampilan mahasiswa dalam teknik aplikasi pestisida dilakukan praktikum pengukuran efektifitas kelambu berinsektisida dengan uji bioassay di Balai



1



Besar penelitian dan Pengembangan Kesehatan Vektor dan Reservoir Penyakit, (B2P2VRP) Salatiga B. Tujuan Praktikum 1.



untuk meningkatkan pengetahuan dan keterampilan dalam teknik aplikasi pestisida



2.



Untuk menilai dan mengetahui daya tahan dan efektivitas racun serangga melalui uji Bioassay



3.



Untuk menilai mutu dan operasi/ tindakan pemberantasan vektor



2



2.



HASIL



A. Manfaat 1. Efektifitas Penggunaan Kelambu Berinsektisida Menurut WHO (2007) penggunaan kelambu berinsektisida di beberapa negara di Afrika telah berhasil menurunkan angka kesakitan malaria rata-rata 50%. Penggunaan kelambu berinsektisida efektif mencegah penularan malaria bila didukung kondisi sebagai berikut (Kementerian Kesehatan RI, 2011) : a. Cakupan penggunaan kelambu diatas 80% penduduk di lokasi sasaran. b. Penduduk menggunakan kelambu secara benar. c. Kebiasaan penduduk tidak berada di luar rumah pada malam hari. d. Perilaku vektor setempat menggigit (mencari darah) di dalam rumah dan aktivitas menggigitnya sudah mulai tinggi tidak pada awal malam. e. Menggunakan



kelambu



berinsektisida



yang



berkualitas



yaitu



efektifitasnya lama (minimal 3 tahun) dan kelambu terbuat dari bahan yang tidak cepat rusak. f. Bila menggunakan kelambu berinsektisida celup ulang maka siklus pencelupan ulang harus tepat waktu (setiap 6 bulan atau lebih, tergantung lamanya efektifitas insektisida yang digunakan). g. Penduduk mau merawat kelambu dengan baik, seperti menjahit bila robek, mencuci dan mengeringkan dengan cara yang benar. 2. Keuntungan Penggunaan Kelambu Berinsektisida a. Penggunaan kelambu lebih murah dibandingkan penyemprotan rumah dengan menggunakan insektisida yang sama, misalnya golongan piretroid sintetik. b. Pelaksanaan di lapangan lebih mudah karena tidak menggunakan peralatan



khusus,



sehingga



dapat



diintegrasikan



dengan



program/sektor lain. c. Dapat memberdayakan masyarakat dalam pendistribusian, pencelupan ulang, dan penyediaan kelambu secara mandiri.



3



d. Penggunaan kelambu juga dapat mencegah penularan penyakit lain yang ditularkan oleh nyamuk. e. Mengurangi gigitan nyamuk, mematikan kepinding, kecoa dan serangga



pengganggu



lain



yang



kontak



dengan



kelambu



berinsektisida. f. Sebagai alternatif kegiatan penyemprotan rumah, bila > 20% masyarakat di suatu lokasi menolak rumahnya disemprot insektisida Indoor Residual Spraying (IRS) atau bila perilaku vektornya tidak istirahat di dinding rumah penduduk. B. Jenis dan Standarisasi 1. Jenis Kelambu Saat ini ada dua jenis kelambu berinsektisida sebagai upaya pengendalian dari vector penyakit, yaitu (Kementerian Kesehatan RI, 2011): a.



Kelambu Berinsektisida Tahan Lama (KBTL) atau Long Lasting Insecticidal Nets (LLINs) adalah kelambu berinsektisida yang proses pemberian insektisida pada bahan kelambu dilakukan di pabrik, melalui: 1) pencampuran pada serat benang (fiber) atau 2) pelapisan pada serat benang, atau 3) pada kelambu yang sudah jadi dicelup dengan bahan pencelupan insektisida tahan lama. 4) Ketiga macam proses pembuatan kelambu berinsektisida tersebut telah melalui uji standar WHO secara laboratorium dan masih efektif setelah dicuci minimal 20 kali, dan uji lapangan efektifitasnya minimal 3 (tiga) tahun tanpa pencelupan ulang dengan insektisida. 5) Bahan pencelupan insektisida tahan lama (long lasting insecticidal treatment kits) adalah satu paket bahan yang terdiri dari insektisida dan bahan pengikat (perekat) yang dapat digunakan untuk



4



mencelup kelambu biasa (tidak berinsektisida) menjadi kelambu berinsektisida tahan lama (KBTL) atau LLINs. b. Kelambu Berinsektisida Celup Ulang (KBCU) atau Impregnated Bed Nets (IBN) atau Insecticide Treated Nets (ITN) adalah kelambu biasa (tidak berinsektisida) yang dicelup dengan insektisida sehingga efektif selama 6-12 bulan dengan pencucian kelambu setiap 6 bulan. Agar tetap efektif terhadap vektor, kelambu tersebut setelah dicuci harus dicelup ulang dengan insektisida setiap 6-12 bulan (tergantung jenis insektisidanya). 2. Standarisasi Kelambu Berinsektisida a. Kelambu Berinsektisida Tahan Lama (KBTL) Agar kelambu berinsektisida yang digunakan berkualitas dan aman bagi penduduk yang memakai, maka perlu ditetapkan persyaratan teknis sebagai berikut : 1) Kelambu Berinsektisida Tahan Lama (KBTL) produksi dalam negeri telah terdaftar di Komisi Pestisida (KOMPES) Departemen Pertanian RI. 2) KBTL produksi luar negeri harus terdaftar di Komisi Pestisida (KOMPES) Departemen Pertanian RI dan mendapat rekomendasi dari WHO. 3) KBTL baik produksi dalam negeri maupun luar negeri sudah diuji dengan standar WHO skala laboratorium dan lapangan oleh WHO atau institusi yang berwenang di Indonesia. Dengan hasil uji laboratorium masih efektif setelah dicuci minimal 20 kali dan uji lapangan efektifitasnya minimal 3 (tiga) tahun, tanpa pencelupan ulang. 4) Jenis bahan kelambu yang ada adalah katun, nilon, polyester dan polyethylene. Untuk KBTL, WHO menganjurkan menggunakan bahan kelambu yang tahan lama dan lebih kuat (tahan dipakai minimal 3 tahun)



5



b. Kelambu Berinsektisida Celup Ulang (KBCU) Agar kelambu berinsektisida celup ulang yang digunakan berkualitas dan anam bagi penduduk yang memakai, maka disarankan memenuhi persyaratan teknis sebagai berikut : 1) Jenis bahan kelambu yang adalah adalah katun, nilon, polyester dan polyethylene 2) Untuk mencelup kelambu biasa yang dilakukan secara mandiri (individu) menggunakan insektisida yang sudah direkomenasi oleh WHO dari golongan Sintetik Piretroid da terdaftar di KOMPES, antara lain : Insektisida



Dosis (per m2)



Alpha-cypermethrine 10 SC Cyfluthrin 5 % EW



20 – 40 mg 50 mg



Deltamethrin 1 % SC/WT 25 % Etofenprox 10 % EW



15 – 25 mg 200 mg



Lamdacyhalothrin 2,5 % CS



10 – 20 mg



Permethrin 10 % EC 200-500 mg Keterangan : Kebutuhan Insektisida dihitung berdasarkan luas kelambu (m2) Atau menggunakan insektisida dalam kemasan siap pakai yang direkomendasi WHO dan terdaftar di KOMPES, Sebagai Berikut : Insektisida



Dosis per kelambu



Alpha-cypermethrine 10 % SC



6 ml



Cyfluthrin 5 % EW



15 ml



Deltamethrin 1 % SC



40 ml



Deltamethrin WT



1 tablet



Etofenprox 10 % EW



30 ml



Lamda-cyhalothrin 2,5 % CS



10 ml



Permethrin 10 % EC



75 ml



6



C. Cara Perawatan 1. Perawatan kelambu berinsektisida dilakukan oleh masyarakat sendiri (pemakai kelambu). 2. Secara teratur kelambu diperiksa untuk mengetahui ada tidaknya lubang atau bagian yang robek untuk segera dijahit (kelambu yang berinsektisida meskipun robek, setelah dijahit masih bisa digunakan). 3. Kelambu yang sudah kelihatan kotor karena debu, dapat dicuci sendiri oleh masyarakat secara berkala : a. KBTL dapat dicuci setiap 2 - 3 bulan sekali. b. KBCU dicuci sebelum pencelupan ulang, setiap 6 bulan atau kurang, sesuai dengan jenis insektisida yang di pakai. 4. Cara mencuci kelambu berinsektisida sebagai berikut : a. Mencuci dengan menggunakan deterjen. Jangan dikucek, jangan disikat atau digosok-gosok dan jangan menggunakan sabun batangan karena mengandung kadar soda yang tinggi. b. Untuk mencuci kelambu ukuran keluarga, dengan luas 19 m2, diperlukan air sekitar satu liter, dan deterjen 2 gram/liter. c. Kelambu dimasukkan ke dalam ember yang berisi larutan deterjen tersebut, tetapi tidak boleh direndam dalam larutan deterjen tersebut. Kelambu langsung dicelup-celupkan berulang-ulang ke dalam larutan tersebut sampai kotorannya hilang D. Uji Efektifitas Residu Pestisida pada Kelambu Kelambu masing-masing dicelup dengan insektisida permethrin, deltamethrin dan lamda sihalothrin dengan konsentrasi 0,5 gram insektisida per m2. Sebelum dipakai mencelup kelambu, masing-masing insektisida dicampur bahan perekat dengan perbandingan 20% insektisida dan 80% bahan perekat. Bahan perekat yang digunakan adalah campuran 86% acrylic yang berfungsi merekatkan insektisida pada serat benang kain kelambu agar tahan terhadap pengaruh pencucian dan 14% arthathrin yang berfungsi melarutkan sebagian partikel acrylic sehingga partikel insektisida bisa kontak dengan nyamuk. Sebagai



embanding digunakan kelambu yang dicelup



7



dengan insektisida permethrin dalam konsentrasi 0,5 gram insektisida per m 2 tanpa dicampur bahan perekat sebagaimana yang selama ini digunakan dalam pemberantasan vector malaria (kontrol positif). Selain itu juga digunakan kelambu yang hanya dicelup dengan air sebagai kontrol negatif untuk mengetahui tingkat kesalahan perlakuan pada kelambu yang dicelup insektisida baik yang dicampur bahan perekat atau tidak(Boewono, Widiarti and Mujiono, 2009). Efikasi kelambu celup terhadap nyamuk sangat berhubungan dengan dosis insektisida pada kelambu yang merupakan kuantitas bahan aktif insektisida per luas permukaan bahan kelambu yang dapat memberi efek repelen, iritan atau efek bunuh terhadap serangga. Acrylic adalah senyawa polymer, apabila menempel dan mongering pada benda padat, akan membentuk lapisan-lapisan yang bisa berfungsi sebagai penutup (cover) atau pengikat (binder) benda padat. Acrylic yang dicampur dengan insektisida dan dipakai mencelup kelambu, mengikat partikel insektisida pada setiap lapisannya dan menutup benang kelambu.(Nurmaliani et al., 2016). Metode bioassay memiliki beberapa kelebihan dan kekurangan, diantaranya kelebihan bioassay versi CDC (botol bioassay) dibandingkan dengan uji kerentanan WHO menurut, (Aïzoun et al., 2013), adalah sebagai berikut : 1.



Dapat untuk mengetahui efektivitas insektisida yang digunakan khususnya pada program-program pengendalian vektor oleh pemerintah sehingga dapat menjadi bahan evaluasi dalam menentukan jenis insektisida.



2.



Alat yang digunakan dalam uji bioassay cukup mudah digunakan dan tidak memerlukan pelatihan intensif untuk dapat menggunakannya dengan baik dan benar.



3.



Menggunakan nyamuk yang lebih sedikit dari uji kerentanan WHO



4.



Tidak perlu transfer nyamuk dari satu botol ke botol yang lain



5.



Memungkinkan deteksi mekanisme resistensi sederhana atau pun ganda pada nyamuk uji terhadap insektisida



6.



Bioassay jenis botol assay lebih sederhana dan cepat.



8



7.



Setiap konsentrasi insektisida (murni atau dirumuskan) dapat dievaluasi.



Kekurangan uji bioassay menurut CDC adalah : 1.



Pelaksanaannya membutuhkan waktu yang lama yaitu 24 jam untuk memantau dan mencatat jumlah kematian nyamuk akibat insektisida.



2.



Pelaksanaan uji bioassay harus mengikuti jadwal yang ditetapkan oleh pejabat daerah sehingga tidak dapat dilakukan sesuai dengan kehendak peneliti.



3.



Setiap tempat yang diuji harus dilapisi insektisida terlebih dahulu



4.



Catatan kematian dalam alat uji masih harus memerlukan perlakuan dan tidak mudah.



9



2. PEMBAHASAN A. Metode Metode uji efektifitas kelambu berinsektisida yang digunakan untuk mengetahui kekuatan/ daya bunuh insektisida yang digunakan serta efek residual insektisida yang digunakan dengan metode bioassay. Dengan kata lain bioassay dilakukan untuk mengetahui efektif atau tidaknya insektisida yang digunakan terhadap vektor dalam program pemberantasan vector penyakit. 1.



Alat dan Bahan a. Kerucut Plastik / Cone b. Gelas Palstik c. Kapas d. Kasa e. Karet Gelang f. Handuk g. Sling hygrometer h. Thermometer i. Aspirator j. Perekat k. Nyamuk Uji l. Larutan Gula m. Kelambu Berisektisida



2.



Cara Kerja a. Nyamuk uji disiapkan, diharapkan nyamuk vector dan berasal darihasil penangkapan/ pemeliharaan sekitar lokasi b. Kerucut ditempelkan pada kelambu, terdapat minimal 3 kelambu yang diuji, pada tia kelambu terdapat sisi yang ditempel kerucut. Kerucut ditempelkan bolak balik dengan posisi kelambu ditengahnya, dapat mengguanakan hechmachine c. 15 ekor nyamuk uji dimasukkan kedalam masing-masing kerucut



10



d. Diamati Knockdownnya selama 1 jam setelah nyamuk dimasukkan dan dicatat pada menit ke 3, 5, 10, 15, 30, 40, 50, dan 60. e. Untuk control ditempelkan kerucut pada potongan kelambu yang tidak berinsektisida f. Setelah 1 jam nyamuk diambil dan dipindahkan ke gelas plastik untuk disimpan di kotak nyamuk, diberi air gula dan diholding selama 24 jam g. Selama penyimpanan dijaga kelembapannya dengan diberi handuk basah, dicatat suhu dan kelembapannya h. Setelah 24 jam dicatat jumlah kematian dan isikan pada form bioassay kelambu, insktisida pada kelambu dikatakan efektif apabila jumlah kematian setelah holding 24 jam > 80% i. Apabila jumlah kematian pada control antara 5%-20% kematian koreksi dengan formula Abbot’s : % Tes Mortality−% Kontrol Mortality x 100 100−Kontrol Mortality B. Hasil Praktikum bioassay dimulai dengan diberikannya materi, pengarahan tentang alat dan bahan, serta cara kerja dari uji bioassay yang disampaikan oleh petugas Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Vector dan Reservoir Penyakit (B2P2VRP) Salatiga. Alat dan bahan yang dijelaskan diantaranya adalah nyamuk uji yang terdiri dari nyamuk dari genus Aedes, Anopheles dan Culex, kerangka kubus, kelambu berinsekisida, gelas plastik yang berisi nyamuk, kerucut plastik (cone), tempat holding nyamuk dan aspirator. Setelah itu di demonstrasikan cara mengambil dan memindahkan nyamuk dengan menggunakan aspirator. Nyamuk yang dipakai untuk pengujian adalah nyamuk An. vagus dewasa yang merupakan hasil pembiakan laboratorium. Sejumlah nyamuk hasil pembiakan dalam kondisi yang sehat dan kenyang darah dimasukkan ke dalam satu bio-assay cone Untuk satu bioassay cone hanya dimasukkan lima ekor nyamuk dengan periode paparan dengan kelambu selama tiga menit, untuk mengurangi gangguan antar nyamuk pada saat paparan yang singkat di atas kelambu 11



Gambar 1. Holding nyamuk (a) dan gelas plastik (b)



Gambar 2 Aspirator dan Cone Praktikum bioassay kelambu, praktikan hanya mengamati cone yang di tempelkan pada bagian luar dan dalam kelambu berinsektisida. Namun praktikum ini tidak menilai apakah insektisida yang digunakan efektif atau tidak dikarenakan membutuhkan waktu yang lama untuk menguji sebuah insektisida yang digunakan.



Gambar 3. cone yang dipasang pada kelambu berinsektisida



12



Hasil dari pengamatan ditulis dalam form sebagai berikut :



13



4. PENUTUP A. Kesimpulan Pengendalian



dan



pencegahan



penyakit



bersumber



binatang



khususnya nyamuk salah satunya menggunakan kelambu berinsektisida, namun untuk mengetahui efektifitas dan daya bunuh kelambu perlu dilakukan uji, Bioassay merupakan metode untuk mendeteksi dan mengetahui karakter resistensi insektisida pada populasi vektor tertentu. Uji bioassay ini memiliki prinsip yang sama dengan kertas uji kerentanan WHO yaitu dengan memaparkan insektisida dengan konsentrasi tertentu dalam beberapa waktu. Selain itu,uji ini juga dapat dilakukan untuk mengukur efikasi formula insektisida Pengujian ini juga diperlukan untuk mengetahui efektivitas dari kelambu berpestisida setelah melewati beberapa kali pencucian. Dengan mengetahui daya tahan pestisida pada kelambu, sebelum kelambu di distribusikan, pembuat dapat mengetahui berapa kali kelambu ini dapat dicuci dan lama waktu kelambu dapat digunakan.



14



5. Daftar Pustaka 1. Aïzoun, N. et al. (2013) ‘Comparison of the standard WHO susceptibility



tests and the CDC bottle bioassay for the determination of insecticide susceptibility in malaria vectors and their correlation with biochemical and molecular biology assays in Benin, West Africa’, Parasites and Vectors, 6(1), pp. 1–10. doi: 10.1186/1756-3305-6-147. 2. Boewono, D. T., Widiarti and Mujiono (2009) ‘THE IMPACT OF REPEATED



WASHING



ON



RESIDUAL



EFFICACY



OF



PYRETHROID LONG LASTING INSECTICIDAL NETS (LLINs) AGAINST DENGUE AND MALARIA MOSQUITO VECTORS’, Vektora, 1(1), pp. 1–12. 3. Intan Ahmad, P. . (1996) ‘Entomologi dan Teknologi Pengendalian Serangga Hama yang Berwawasan Lingkungan’, in. Bandung: ITB Bandung, pp. 1–28. doi: PIS 025. 4. Kementerian Kesehatan RI (2011) Pedoman Penggunaan Kelambu Berinsektisida Menuju Eliminasi Malaria. Kementerian Kesehatan. 5. Nurmaliani, R. et al. (2016) ‘Daya Bunuh Kelambu Berinsektisida Long Lasting Insecticidal Nets (LLINS) terhadap Nyamuk Anopheles maculatus Lethal Potency of Long Lasting Insecticidal Nets (LLINS) Against Anopheles maculatus Mosquito’, Aspirator, 8(1), pp. 1–8. 6. Sugiarto, S. et al. (2017) ‘Evaluasi Kelambu Berinsektisida Terhadap Nyamuk An. sundaicus (Diptera : Culicidae ) di Pulau Sebatik , Kalimantan Utara’, Jurnal Vektor Penyakit, 11(2), pp. 61–70. doi: https://doi.org/10.22435/vektorp.v11i2.7584.61-70.



15



BAB II POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 1.



PENDAHULUAN



A. Latar Belakang Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode revolusioner yang dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1980-an. PCR didasarkan pada penggunaan kemampuan DNA polimerase untuk mensintesis untai DNA komplementer baru ke untai templat yang diinginkan. Karena DNA polimerase hanya dapat menambahkan nukleotida ke dalam kelompok 3'-OH yang sudah ada sebelumnya, ia membutuhkan primer yang dapat menambahkan nukleotida pertama. Persyaratan ini memungkinkan untuk menggambarkan bagian urutan template tertentu yang ingin diperkuat oleh peneliti. Pada akhir reaksi PCR, urutan spesifik akan terakumulasi dalam miliaran salinan.1 Polymerase chain reaction (PCR) adalah teknik laboratorium yang umum digunakan untuk membuat banyak salinan (jutaan atau milyaran) dari bagian DNA tertentu. Bagian DNA ini dapat berupa apa saja yang diminati oleh peneliti. Misalnya, gen yang fungsinya ingin dipahami oleh peneliti, atau penanda genetik yang digunakan oleh para ilmuwan forensik untuk mencocokkan DNA TKP dengan tersangka.2 Biasanya, tujuan PCR adalah untuk membuat cukup bagian DNA target sehingga dapat dianalisis atau digunakan dengan cara lain. Misalnya, DNA yang diamplifikasi oleh PCR dapat dikirim untuk disekuensing, divisualisasikan oleh elektroforesis gel, atau dikloning ke dalam plasmid untuk percobaan lebih lanjut.2 Pada laporan ini, penulis bertujuan untuk menjelaskan prosedure dan penggunaan PCR pada bidang kesehatan. B. Tujuan 1.



Menjelaskan prosedur kerja PCR



2.



Menjelaskan pengaplikasian PCR pada bidang kesehatan



16



2. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Komponen PCR 1.



DNA template Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju. Penyiapan DNA templat untuk proses PCR dapat dilakukan dengan menggunakan metode lisis sel ataupun dengan cara melakukan isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid dengan menggunakan metode standar yang ada. Pemilihan metode yang digunakan di dalam penyiapan DNA templat tergantung dari tujuan eksperimen.3 Pembuatan DNA templat dengan menggunakan metode lisis dapat digunakan secara umum, dan metode ini merupakan cara yang cepat dan sederhana untuk pendedahan DNA kromosom ataupun DNA plasmid. Prinsip metode lisis adalah perusakan dinding sel tanpa harus merusak DNA yang diinginkan. Oleh karena itu perusakan dinding sel umumnya dilakukan dengan cara memecahkan dinding sel menggunakan buffer lisis. Komposisi buffer lisis yang digunakan tergantung dari jenis sampel. Beberapa contoh buffer lisis yang biasa digunakan mempunyai komposisi sebagai berikut: 5 mM Tris-Cl pH8,5; 0,1 mM EDTA pH 8,5; 0,5 % Tween-20 dan 100 ug/mL Proteinase-K (ditambahkan dalam keadaan segar). Buffer lisis ini umumnya digunakan untuk jenis sampel yang berasal dari biakan, sel-sel epitel dan sel akar rambut. Contoh lain dari buffer lisis adalah buffer lisis K yang mempunyai komposisi sebagai berikut: buffer PCR (50mM KCl, 10-20mM Tris-Cl dan 2,5mM MgCl2 ); 0,5 % Tween-20 dan 100 ug/mL Proteinase-K (ditambahkan dalam keadaan segar).4 Buffer lisis K ini biasanya digunakan untuk melisis sampel yang berasal dari sel darah dan virus. Selain dengan cara lisis, penyiapan DNA templat dapat dilakukan dengan cara mengisolasi DNA kromosom



17



ataupun DNA plasmid menurut metode standar yang tergantung dari jenis sampel asal DNA tersebut diisolasi. Metode isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid memerlukan tahapan yang lebih kompleks dibandingkan dengan penyiapan DNA dengan menggunakan metode lisis. Prinsip isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid adalah pemecahan dinding sel, yang diikuti dengan pemisahan DNA kromosom / DNA plasmid.4 2.



DNA polymerase Suatu jenis enzim yang mensintesis untaian DNA baru yang saling melengkapi dengan urutan target. Enzim-enzim ini yang pertama dan paling umum digunakan adalah TaqDNA polimerase (dariThermis aquaticus), sedangkan PDiDNA polimerase (dariPyrococcus furiosus) digunakan secara luas karena ikatannya yang lebih tinggi ketika menyalin DNA. Meskipun enzim-enzim ini agak berbeda, mereka berdua memiliki dua kemampuan yang membuatnya cocok untuk PCR mereka dapat menghasilkan untaian DNA baru Bersifat thermostable Taq polymerase yang tidak secara cepat mendenaturasi pada suhu tinggi (98oC) dan dapat bekerja dengan baik pada suhu optimum sekitar suhu 70oC. Aktivitas polimerisasi DNAnya dari ujung-5’ ke ujung-3’ dan aktivitas enzimatik ini mempunyai waktu paruh sekitar 40 menit. Biasanya untuk setiap 100μl volume reaksi ditambahkan 2.0-2.5 unit.3



3.



Primer oligonukeotida Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan synthesizer. komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer berkisar antara 20-30 basa. Untuk merancang urutan primer, perlu diketahui urutan nukleotida pada awal dan akhir DNA target. Primer oligonukleotida di sintesis menggunakan suatu alat yang disebut DNA.3



4.



Deoxynucleotide triphosphates dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP



18



(deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA templat. Konsentrasi optimal dNTPs untuk proses PCR harus ditentukan.4 5.



Buffer system Buffer PCR yang digunakan berkaitan dengan pH dan kapasitas buffer nya. Dalam perdagangan ada dua jenis buffer PCR yaitu “Low-salt buffer” (pH 8,75 dan kapasitas buffer rendah) dan “High-salt buffer” (pH 9,2 dan kapasitas buffer tinggi). Termasuk di dalamnya Magnesium dan Potassium untuk menyediakan kondisi optimum untuk denaturasi dan renaturasi DNA. Buffer juga



berperan untuk aktifitas polymerase,



stabilitas dan ketepatan. Penggunaan jenis buffer ini tergantung pada DNA target yang akan diamplifikasi. Untuk panjang DNA target antara 0 – 5 kilobasa biasanya diperlukan “low-salt buffer” sedangkan untuk panjang DNA target lebih besar dari lima kilobasa digunakan “high-salt buffer”.4 B.



Prosedur PCR 1. Denaturasi Di dalam proses PCR, denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase. Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5 menit masing-masing pada suhu 92,5; 95 dan 97,5oC.3



19



2. Penempelan (Annealing) Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik adalah bahwa primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung 50 – 60 % G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens DNA dalam masing-masing primer itu sendiri juga sebaiknya



tidak



saling



berkomplemen,



karena



hal



ini



akan



mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi PCR.3 Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45 detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya. Kisaran temperatur penempelan yang digunakan adalah antara 36 oC sampai dengan 72oC, namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara 50 – 60oC.3 3. Elongasi/amplifikasi/ekstensi Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72oC diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan demikian untuk produk PCR dengan panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda.3



20



Reaksi-reaksi tersebut diulang 25 – 30 kali (siklus) sehingga pada akhir siklus akan diperoleh molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru yang merupakan hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target dalam campuran reaksi.3 C. Gel Elektroforesis Hasil



reaksi



PCR



biasanya



divisualisasikan



menggunakan



elektroforesis gel. Gel elektroforesis adalah teknik di mana fragmen DNA ditarik melalui matriks gel oleh arus listrik, dan memisahkan fragmen DNA sesuai dengan ukuran. Standar, atau tangga DNA, biasanya disertakan sehingga ukuran fragmen dalam sampel PCR dapat ditentukan.



21



Fragmen DNA dengan panjang yang sama membentuk "pita" pada gel, yang dapat dilihat oleh mata jika gel tersebut diwarnai dengan pewarna pengikat DNA. Misalnya, reaksi PCR yang menghasilkan fragmen pasangan basa 400400400 (bp) akan terlihat seperti ini



Pita DNA berisi banyak salinan bagian DNA target, bukan hanya satu atau beberapa salinan. Karena DNA bersifat mikroskopis, banyak salinannya harus ada sebelum melihatnya dengan mata. Ini adalah bagian besar mengapa PCR adalah alat yang penting.2 D. Aplikasi Metode PCR dalam Bidang Kesehatan 1. PCR digunakan dalam menganalisis spesimen klinis untuk keberadaan agen infeksius, termasuk HIV, hepatitis, malaria, antraks, dll. 2. PCR dapat memberikan informasi tentang prognosis pasien, dan memprediksi respons atau resistensi terhadap terapi. Banyak kanker ditandai dengan mutasi kecil pada gen tertentu, dan inilah yang digunakan PCR untuk mengidentifikasi. 3. PCR digunakan dalam analisis mutasi yang terjadi pada banyak penyakit genetik (mis. Fibrosis kistik, anemia sel sabit, fenilketonuria, distrofi otot). 4. PCR juga digunakan di laboratorium forensik dan sangat berguna karena hanya sejumlah kecil DNA asli diperlukan, misalnya, DNA yang cukup dapat diperoleh dari tetesan darah atau rambut tunggal.



22



5. Deteksi suatu subtipe organisme dengan virulensi baru yang berperan terhadap terjadinya pandemik 6. Epidemiologi molekuler suatu infeksi virus dalam hubungannya dengan beban penyakit yang ditimbulkan. 7. Surveilans molekuler suatu agen penyakit sebagai EWAR’s terjadinya pandemi. 8. Monitoring resistensi insektisida E. Tahapan Identifikasi Virus Dengue Pada Nyamuk Aedes dengan Metode PCR 1.



Isolasi RNA a.



Caput-thorak dari nyamuk Ae. aegypti dan Ae. albopictus yang sudah dimasukkan ke dalam eppendorf ditambahkan dengan air DEPC sebanyak 200 μI, kemuclian digerus dengan menggunakan grinder;



b.



Preparasi working solution, untuk setiap 100 μl larutan sampel : campur 200 μI Binding buffer + 4 μl poly A + 50 μI proteinase K;



c.



Ke dalam eppendorf 1.5 ml steril ditambahkan : I00 μI + 250 μl Working solution (yang baru disiapkan sesaat sebelumnya), campur segera kemudian diinkubasi 1 0 menit pada suhu 72° C;



d.



Ditambahkan Binding buffer sebanyak 100 μl, kemudian dicampur;



e.



Sampel clipindahkan ke dalam high filter tube;



f.



High filter tube disentrifuse selama 1 menit pada 8000x g;



g.



Filter tube kemudian dilepaskan dari collection tube, filtrat dan collection tube kemudian dibuang, pasangfilter tube tadi ke dalam collection tube yang baru;



h.



Ditambahkan 500 μI Inhibitor Removal Buffer, sentrifuse selama 1 menit pada 8000x g, buang filtrat dan collection tube, kemudian pasang collection tube baru;



i.



Ditambahkan 450 μl Wash Buffer, sentrifuse selama I menit pada 8000x g, buang filtrat dan collection tube, kemudian pasang collection tube baru;



23



j.



Ditambahkan 450 μI Wash Buffer, sentrifuse selama 1 menit pad.a 8000x g, filtrat dibuang, sentrifuse kembali selama 10 detik pada kecepatan maksimum (13000x g);



k.



Collection tube dibuang dan filter tube dipasang ke dalam eppendorf 1.5 ml steril dan bebas dari nuclease;



l.



Ditambahkan 50 μl Elution buffer, sentrifuse selama 1 menit pada 8000x g; Filter tube dibuang, RNA virus siap digunakan untuk PCR.



2.



Langkah Kerja RT-PCR Reverse transcriptase PCR untuk mengubah RNA menjadi cDNA dan amplifikasi virus Dengue general dengan primer DI dan D2. Mix dibuat dalam PCR tube 0,2 ml yang bebas nuclease, dan dikerjakan di dalam es dengan komposisi sebagai berikut : Komponen



Volume



2x Reaction Mix Superscript™ III RT/ Platinum® Taq Mix MgS04



12,5 μl 1 μl 2 μl



Primer DI (Forward)



1 μl



Primer D2 (Reverse)



1 μl



RNA Komponen-komponen



5 μl secara



tersebut



dicampur



perlahan-lahan,



dipastikan semua komponen berada di dasar tabung, jika perlu dapat disentrifus sebentar. PCR mix dimasukkan ke dalarn thermal cycler, dengan program sebagai berikut : sintesis cDNA 1 siklus : 42°C selama 1 jam;



predenaturasi 1 siklus : 94°C selama 3 menit; amplifikasi 35



siklus : 94°C selama 1 menit (denaturasi), 65°C selama 1 menit (annealing), 72°C selama 1,5 menit (ekstensi); ekstensi akhir 1 siklus : 72°C selama 5 menit. Amplifikasi serotipe-spesifik cDNA virus Den1, Den2, Den3, dan Den4 Campuran master mix sebagai berikut: Komponen



Volume



2x Reaction Mix



12,5 μl



Superscript™ III RT/ Platinum® Taq 24



1 μl



Mix MgS04



2 μl



Primer DI (Forward) Primer TSI, TS2, TS3, dan TS4



1 μl



@1 μl (Reverse) cDNA 5 μl Larutan master mix yang berisi komponen-komponen diatas dimasukkan dalam tube PCR 0,2 μI, disentrifus sebentar kemudian dimasukkan ke dalam thermal cycler, dengan program sebagai berikut : (i) denaturasi 20 siklus : 94°C selama 30 detik, annealing 55°C selama I menit, dan ekstensi 72°C selama 2 menit. 3.



Elektroforesis Produk RT-PCR dielektrofresis pada gel agarose 1.5%, SBYR dan 100 bp ladder digunakan sebagai marker untuk menganalisis besar produk PCR dan ukuran pita yang didapatkan untuk virus DEN-1 adalah 324 bp, virus DEN-2 adalah 119 bp, virus DEN-3 adalah 538 bp dan virus DEN4 adalah 726 bp. Langkah kerja pemeriksaan elektroforesis adalah sebagai berikut: a. Agarose gel dibuat dengan menimbang 0.75 gram agarose dimasukkan dalam erlemeyer, ditambah 5 μl SBYR dan ditambah TBE buffer 0.5x sampai 50 ml kemudian dihomogenisasi di dalam microwave sampai berwarna jernih. b. Gel tersebut didiamkan pada suhu ruangan ± 5 menit, lalu dituang kedalam cetakan dan dibiarkan sampai mengeras. c. Gel agarose bersarna cetakannya dimasukkan ke dalam perangkat elektroforesis dan diberi TBE buffer 0.5x sampai tergenang. d. Produk RT-PCR 0.5 μl + 0.3 μI loading buffer, lalu dimasukkan kedalam well/slot yang ada pada gel agarose. e. Gel lalu dirunning 60 volt, 400 mA selama 35-45 menit, setelah itu gel diangkat dari perangkat elektroforesis dan dimasukkan kedalam gel doc untuk mengetahui band virus Dengue.



25



3.



PENUTUP



KESIMPULAN Metode PCR membutuhkan komponen DNA template sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama, DNA polymerase yaitu enzim yang mensintesis untaian DNA baru yang saling melengkapi dengan urutan target, Primer oligonukeotida untuk merancang urutan primer, Deoxynucleotide triphosphates sebagai building block DNA yang diperlukan



26



dalam proses ekstensi DNA dan Buffer system untuk aktifitas polymerase, stabilitas dan ketepatan. Prosedur kerja PCR ada 3 yaitu, Denaturasi yaitu proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal, Annealing yaitu pengikatan primer pada urutan komplementer dalam DNA template, dan Amplifikasi yaitu memperpanjang urutan DNA primer dari ujung 3'. Hasil reaksi PCR dapat divisualisasikan menggunakan metode gel elektroforesis yaitu fragmen DNA ditarik melalui matriks gel oleh arus listrik, dan memisahkan fragmen DNA sesuai dengan ukuran. Metode PCR dapat diaplikasikan pada bidang kesehatan untuk menganalisis spesimen klinis ,analisis mutasi penyakit genetik, deteksi subtipe organisme dengan virulensi baru, pidemiologi molekuler suatu infeksi virus, monitoring resistensi insektisida.



27



4. Daftar Pustaka 1. NCBI. Polymerase Chain Reaction (PCR) [Online]. Diakses pada 26 April 2019 pada https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/ 2. Khan Academy. Polymerase chain reaction (PCR) [Online]. Diakses pada 26 April 2019 pada



https://www.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-



sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr 3. Yusuf ZK. Polimerase Chain Reaction (PCR). Saintek. 2010;5(6) 4. Handoyo D, Rudiretna A. Prinsip umum dn pelaksanaan polymerase chain reaction (PCR). pusat studi bioteknologi universitas surabaya. 2001;9(1)



28



BAB III. DETEKSI LEPTOSPIROSIS 1. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Leptospirosis merupakan penyakit zoonosis yang mempunyai dampak signifikan terhadap kesehatan di banyak belahan dunia, khususnya di negara beriklim sub tropis dan tropis (WHO, 2006). Namun insiden leptospirosis lebih banyak terjadi di negara beriklim tropis karena suhu lingkungan mendukung bakteri Leptospira lebih survive di daerah ini. Bakteri Leptospira merupakan penyebab leptospirosis yang dapat menyerang hewan dan manusia. Infeksi pada manusia merupakan kejadian yang bersifat insidental, karena reservoir atau penyebar utama Leptospira adalah tikus (Rusmini, 2011). Air kencing tikus yang terinfeksi Leptospira terbawa banjir dan dapat masuk ke tubuh manusia melalui kulit yang terluka dan selaput mukosa. Penularan leptospirosis paling sering terjadi pada kondisi banjir yang menyebabkan perubahan lingkungan seperti genangan air, becek, banyak timbunan sampah sehingga bakteri Leptospira lebih mudah berkembang biak. Leptospirosis menjadi suatu masalah di dunia karena angka kejadian yang tinggi namun dilaporkan rendah di sebagian besar negara. Hal tersebut diakibatkan karena sulitnya dalam menentukan diagnosis klinis dan tidak adanya alat untuk diagnosis sehingga sebagian besar negara melaporkannya sebagai angka kejadian yang rendah. Di sisi lain, di suatu negara angka kejadian Leptospirosis meningkat setiap tahunnya. Di negara tropis diperkirakan terdapat kasus leptospirosis antara 10-100 kejadian tiap 100.000 penduduk per tahun (WHO, 2003). Jumlah kasus leptospirosis di Indonesia sendiri pada tahun 2014 menurun dibandingkan tahun 2013 yaitu dari 641 kasus menjadi 519 kasus, namun angka kematian atau mortalitas akibat leptospirosis meningkat dari 9,38% pada tahun 2013 menjadi 11,75% pada tahun 2014 (Kemenkes RI, 2015). International Leptospirosis Society menguatkan Indonesia sebagai negara dengan angka mortalitas leptospirosis 16,7% dan menduduki peringkat ketiga di dunia setelah Uruguay (100%) dan India (21%) (WHO, 2006). Oleh sebab itu leptospirosis merupakan penyakit dengan angka mortalitas cukup tinggi di Indonesia. Kemenkes RI (2015) melaporkan adanya kasus leptospirosis pada tahun sebelumnya yaitu tahun 2014 di berbagai provinsi antara lain provinsi DKI Jakarta, Jawa Tengah, DI 29



Yogyakarta, Jawa Timur. Dinkes Jateng (2014) menyatakan Jawa Tengah merupakan provinsi dengan jumlah kasus terbanyak di Indonesia pada tahun 2014, yaitu 207 kasus leptospirosis dengan 34 kasus diantaranya meninggal dunia. Jumlah tersebut meningkat dibandingkan tahun 2013 dengan 156 orang terinfeksi leptospirosis dan 17 orang diantaranya meninggal dunia. B. Tujuan Penulisan Agar mahasiswa mengetahui cara deteksi Leptospirosis pada tikus. C. Manfaat Penulisan Mahasiswa mengetahui cara deteksi Leptospirosis pada tikus.



30



2. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Alat dan Bahan 1. Alat a. Tabung microcentrifuge b. Microcentrifuge c. Micropipet d. Micropestle e. Alat grinding f. Inkubator g. Alat elektroforesis h. GS Column i. Tabung koleksi j. Alat PCR 2. Bahan a. Jaringan tubuh tikus b. 200µl GT Buffer c. 20µl Proteinase K d. 200µl GBT Buffer e. 4µl larutan Rnase A f. 200µl ethanol g. 400µl W1 Buffer h. 600µl Wash Buffer i. 100µl Elution Buffer j. TBE 1x k. Aquades l. 1µl loading buffer m. 4µl distilled water n. ETBR



31



B. Langkah-langkah 1. Penguraian Jaringan



Potong 30 mg dari jaringan hewan atau 0.5 cm dari ekor tikus, lalu pindahkan ke tabung microcentrifuge



Gunakan micropestle untuk melunakkan jaringan hingga menjadi bubur.



Tambahkan 200µl larutan GT Buffer ke dalam tabung dan homogenkan sample jaringan dengan di grinding



Tambahkan 20µl Proteinase K ke dalam sampel kemudian kocok setelah itu di inkubasi pada suhu 60°C selama 30 menit. Catatan : selama inkubasi, balikan tabung setiap 5 menit.



32



2. Lysis Tambahkan 200µl larutan GBT Buffer lalu kocok selama 5 detik



Inkubasikan pada suhu 60°C selama 20 menit untuk memastikan lysate telah selesai



Selama di inkubasi, tambahkan 4µl larutan Rnase A (10mg/ml) pada sampel lysate kemudian kocok.



Inkubasikan pada suhu ruang selama 5 menit



33



3. Pengikatan DNA



200µl larutan ethanol absolut pada lysate kemudian kocok selama 10 detik (jika terdapat endapan yang muncul , singkirkan d



Letakkan GS Column ke dalam tabung koleksi 2ml



dahkan sampel (termasuk endapannya) ke dalam GS Column kemudian di setrifuge pada putaran 14-16.000 x g selama 30 de



Lepaskan tabung koleksi 2ml, pindahkan GS Column ke tabung koleksi 2ml yang baru



34



4. Pencucian



Tambahkan 400µl larutan W1 Buffer`ke GS Column kemudian di sentrifuge pada putaran 14-16.000 x g selama 30 detik



Buang hasil sisa cuci lalu letakkan GS Column kembali ke dalam tabung koleksi 2ml



Tambah 600µl dari Wash Buffer ( pastikan sudah ditambahkan ethanol) ke dalam GS Column



Sentrifuge lagi pada keadaan 14-16.000 x g selama 30 detik



Buang hasil sisa cuci kemudian letakkan GS Column kembali ke dalam tabung koleksi 2ml



Sentifuge lagi selama 3 menit pada keadaan 14-16.000 x g untuk mengeringkan kolom matrix



35



5. Elusi DNA Pindahkan GS Column kering ke tabung microcentrifuge yang baru



Tambahkan 100µl larutan Elution Buffer yang telah di hangatkan tepat di tengah kolom matrix



Berdirikan dan tunggu selama 5 menit untuk memastikan larutan Elution Buffer benar-benar terserap



Sentrifuge lagi pada putaran 14-16.000 x g selama 30 detik untuk mendapatkan DNA murni.



36



6. PCR



akukan pembuatan master mix yang terdiri dari Gotae Green, Primer Reverse, Forward Primer, dan Nucleus Free Water Rea



Setelah jadi, Master Mix diinkubasi pada suhu 93°C selama 1 menit untuk denaturasi awal



Selanjutnya dengan siklus 35x master mix diteruskan diinkubasi pada suhu 93°C selama 1 menit untuk denaturasi



Kemudian campuran diinkubasi pada suhu 48°C selama 1 menit untuk annealing



Kemudian diinkubasi pada suhu 72°C selama 1 menit untuk polimerasi



i pada suhu 72°C selama 10 menit untuk polimerasi akhir, kemudian diamplifikasi menggunakan primer dari gen 16S rRNA



37



7. Elektroforesis



Pembuatan buffer elektroforesis TBE 1x sebanyak 1 liter dengan mencampurkan 100ml TBE 1x dengan 900ml aquades.



ngan 100ml larutan buffer TBE 1x dan dipanaskan menggunakan microwave/hot plate sirrer sampai bubuk agarose larut sem



Tambahkan ETBR 10µl dan ditiriskan



an larutan yang sudah ditiriskan ke dalam cetakan yang sudah dilengkapi sisir pembentuk sumur dan dibiarkan sampai gel me



Kemudian sisir diangkat, gel yang sudah terbentuk diangkat dan dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis



erendam, kemudian pada sumuran isi dengan 1-2µl sampel, 1µl loading buffer, dan 4µl distilled water sebagai kontrol negati



a sumur paling kiri, kemudian aliri listrik 100 volt selama ±30 menit. Visualisasi pita DNA dilakukan dengan bantuan illumin 38



3. PENUTUP A. Kesimpulan Penularan leptospirosis paling sering terjadi pada kondisi banjir yang menyebabkan perubahan lingkungan seperti genangan air, becek, banyak timbunan sampah sehingga bakteri Leptospira lebih mudah berkembang biak. International Leptospirosis Society menguatkan Indonesia sebagai negara dengan angka mortalitas leptospirosis 16,7% dan menduduki peringkat ketiga di dunia setelah Uruguay (100%) dan India (21%) (WHO, 2006). Oleh sebab itu leptospirosis merupakan penyakit dengan angka mortalitas cukup tinggi di Indonesia. Komponen-komponen yang dalam pemeriksaan bakteri Leptospira pada sampel darah menggunakan metode PCR adalah DNA template, enzim polymerase, Primer PU 1 dan Primer SU 1 (forward), Primer Lep R1 (reverse), air, dll. Pemeriksaan bakteri Leptospira pada sampel darah meliputi beberapa teknik, yaitu penguraian jaringan, Lysis, Pengikatan DNA, Pencucian DNA, Elusi DNA, PCR, dan Elektroforesis.



39



4.



Daftar Pustaka



1. Widiastuti, Dyah, and Anggun Paramita Djati. 2015. “DETEKSI LEPTOSPIRA PATOGEN PADA TERSANGKA DETECTION OF PATHOGENIC LEPTOSPIRA ON HUMAN LEPTOSPIROSIS SUSPECT IN PONOROGO REGENCY” 7 (1): 7– 13. 2. Susan, Kusmiyati, and M Noor. 1986. “Leptospirosis Pada Hewan Dan Manusia Di Indonesia.”



40



BAB IV. IMUNOHISTOKIMIA 1. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Penyakit Demam Berdarah Dengue (DBD) banyak ditemukan di daerah tropis dan sub-tropis. Data dari seluruh dunia menunjukkan bahwa Asia menempati urutan pertama dalam jumlah penderita DBD setiap tahunnya. World Health Organization (WHO) mencatat Indonesia sebagai negara dengan kasus DBD tertinggi di Asia Tenggara terhitung sejak tahun 1968 - 2009 (WHO, 2009) Penyakit DBD masih merupakan salah satu masalah kesehatan masyarakat di Indonesia yang belum dapat ditanggulangi sampai saat ini. Penyakit ini sering kali menimbulkan Kejadian Luar Biasa (KLB) di beberapa kabupaten/kota di Indonesia. Pada tahun 2012, kasus DBD di Indonesia dilaporkan sebanyak 90.245 orang dengan kematian 816 orang. Pada tahun 2013, Incident Rate (IR) DBD adalah 45,85/100.000 penduduk (Kemenkes RI, 2013). Pada pengendalian suatu penyakit harus dipahami epidemiologinya, yaitu adanya faktor penyebab (agent), inang (host), dan lingkungan (environment). Penyakit Dengue disebabkan oleh virus Dengue dan ditularkan oleh nyamuk Aedes Aegypti dan nyamuk Aedes albopictus. Nyamuk tersebut mempunyai sifat anthropophilic dan multiple feeding dan kedua sifat tersebut dapat meningkatkan risiko penularan DBD di wilayah permukiman penduduk (Sukowati, 2010). Virus Dengue diketahui ada 4 serotipe yaitu: DEN-1, DEN-2, DEN-3, dan DEN4. Nyamuk yang mengandung virus Dengue dengan kepadatan populasi yang tinggi akan menyebabkan nyamuk kontak dengan manusia semakin banyak dan kemungkinan manusia terserang virus semakin tinggi juga. Virus Dengue dapat ditularkan secara horizontal dari manusia pembawa virus ke nyamuk vektornya maupun secara vertikal dari induk ke keturunannya (transovarial) (Anggraini, 1998). Penularan ini berpotensi meningkatkan wabah demam berdarah atau setidaknya memberikan kontribusi sering timbulnya kasus DBD di daerah endemis (Thavara et al., 2006). Penelitian tentang deteksi keberadaan virus Dengue dan serotipenya sering dilakukan pada serum penderita DBD sedangkan penelitian pada nyamuk Ae. aegypti sebagai vektornya belum banyak dilakukan. Serotipe virus berkaitan dengan penyakit 41



DBD yang akan ditimbulkan di wilayah tersebut. Virus DEN-3 merupakan serotipe yang paling dominan di Indonesia yang tersebar di berbagai daerah dan berhubungan dengan tingkat keparahan suatu penyakit yang menyebabkan kasus berat (Suroso, 1999). Informasi hasil studi molekuler dari perkembangan infeksi virus Dengue yang dapat menimbulkan penyakit akan sangat berguna dalam pengendalian dan penanganan virus Dengue melalui deteksi adanya transmisi tansovarial dan serotipe virus. Sebagai kontrol dan pencegahan demam Dengue, penting untuk mendeteksi secara cepat virus Dengue dan serotipe nya melalui sampel klinis dan nyamuk. Cara diagnosis teknik molekuler yang saat ini sedang berkembang adalah dengan menggunakan teknik Imunohistikomia (IHC) dan Reverse Transcriptase –Polymerase Chain reaction (RT-PCR). Hasil pemeriksaan virus Dengue dengan metode IHC bersifat kualitatif, dikenal sangat senditif, spesifik, dan sahih untuk keperluan diagnostik virus Dengue (Mardihusodo, 2005). Sampai saat ini obat yang efektif dan vaksin yang spesifik belum ada, maka pemberantasan penyakit DBD dititikberatkan pada pengendalian vektor yaitu nyamuk Ae. aegypti. Pengendalian yang sering dilakukan yaitu secara kimiawi dengan menggunakan insektisida. Insektisida organofosfat (malation dan temefos) telah digunakan dalam program nasional pengendalian vektor DBD di Indonesia sejak tahun 1970-an. Penggunaan insektisida dalam skala luas, secara terus-menerus dalam jangka waktu yang cukup lama dan frekuensi tinggi dapat menimbulkan penurunan kerentanan pada nyamuk sasaran menjadi toleran sampai resisten. Resistensi merupakan rintangan tunggal (single barrier) paling besar dalam program pengendalian nyamuk secara kimiawi. Keberhasilan dalam pengendalian tergantung status kerentanan nyamuk terhadap insektisida yang digunakan (WHO, 1995; Georghiu & Mellon, 1983). Resistensi bersifat menurun pada generasi berikutnya maka perlu ditanggulangi supaya penyebaran Dengue oleh nyamuk tidak meningkat. Suatu wilayah yang didominasi oleh nyamuk resisten terhadap insektisida yang digunakan dalam pengendalian vektor menyebabkan kepadatan populasi tinggi sehingga peluang nyamuk untuk menularkan juga akan tinggi.



42



B. Tujuan 1.



Mengetahui langkah – langkah dalam teknik Imunohistikomia (IHC)



2.



Mengetahui adanya transmisi transovarial virus Dengue pada nyamuk Ae. aegypti



C. Manfaat Penelitian Dapat menambah pengetahuan mahasiswa dan ketrampilan dalam melakukan teknik Imunohistikomia (IHC).



43



2.



HASIL DAN PEMBAHASAN



A. Imunositokimia Imunositokimia adalah visualisasi dan lokalisasi antigen pada irisan jaringan atau sel yang berinteraksi dengan antibodi spesifik yang telah berikatan dengan antibodi yang dilabel penanda FITC (fluorescent isothiocyanat) pada sedian imunofluoresensi, enzim peroksidase atau alkalin fosfatase pada sediaan mikroskopis cahaya. Sampel dapat berupa irisan jaringan beku, irisan jaringan farafin beku, kultur/suspense sel. Metode imunositokimia berhasil untuk mendeteksi antigen Dengue di sel-sel kuffer dam sel-sel endotel sinusoidal hati, makrofag, sel-sel multinuclear, sel limfoid reaktif limpa, endothelium vascular paru, tubuli ginjal dari specimen jaringan yang diperoleh dari autopsy dan biopsy pasca mati, monosit dan limfosit sampel bekuan darah menggunakan antibody monoclonal terhadap virus Dengue. Imunositokimia merupakan metode potensial untuk identifikasi protein atau antigen dalam sel dan jaringan, tetapi metode ini tergantung pada spesifitas antibodi yang mengikat epitope protein yang digunakan sebagai imunogen. Spesifitasnya bergantung pada spesifitas antibody dan metode yang digunakan. Spesifitas antibodi yang paling baik ditentukan dengan imunoblot atau imunopresipitasi. B. Imunositokimia SBPC Metode ini menggunakan antibodi sekunder yang dilabel biotin yang dapat mengenal antibodi primer (antibodi monoclonal atau poliklonal) dan menggunakan konjugat streptavidin yang dilabel enzim horseradish peroxidase dan campuran substrat kromogen untuk mendeteksi antigen pada sel atau jaringan dengan sensitifitas yang tinggi, sehingga antigen dengan kadar rendah pun dapat terdeteksi. Dasar utama reaksi SBPC adalah ikatan yang sangat kuat antara strevtavidin dan biotin. Streptavidin merupakan protein yang diisolasi Streptomyces avidinii yang serupa dengan putih telur avidin yang mampu mengikat biotin. Streptavidin mempunyai berat molekul 60.000 DA dan terdiri dari 4 sub unit identik dan masing-masing subunit mempunyai reseptor biotin. Biotin adalah vitamin yang larut air dengan berat molekul 244 Da yang dapat dipasangkan dengan berbagai protein dan asam nukleat (seperti reseptor-reseptor hormon, imonoglobulin dan cDNA). Metode imunositokimia SBPC lebih sensitive daripada metode avidin biotin complex, karena streptavidin mempunyai titik isoelektrik sekitar 6,5 sedangkan avidin 10, sehingga streptavidin mempunyai muatan positif dibawah kondisi fisiologis dan memperlihatkan ikatan non spesifik yang 44



lebih rendah dari avidin. Ikatan non spesifik yang lebih rendah ini disebabkan kanduangan karbohidrat yang sangat rendah dari streptavidin. Sebab adanya kandungan yang agak tinggi pada avidin ini memberikan peluang terjadinya ikatan non spesifik antara karbohidrat dengan protein yang menyerupai lesitin yang berada dalam jaringan. Metode yang digunakan adalah imunositokimia SBPC pada sediaan histologist nyamuk pada sediaan pencet kepala nyamuk. Preparasi sediaan pencet kepala nyamuk dengan prosedur sebagai berikut : a. Dibuat sediaan head squash atau pencet kepala nyamuk Ae. aegypti berumur 7 hari yang telah dimatikan dan dipisahkan dari badannya disebuah gelas yang dipisahkan khusus. b. Preparat difiksasi dengan methanol dingin 20ᵒC dengan selama 3-5 menit. c. Preparat dicuci dibawah keran sebentar kemudian dengan PBS. Untuk menghilangkan aktifitas peroksidase endogen preparat direndam dalam peroksidase blocking solution pada temperature kamar selama 10 menit atau dibawah air kran selama 5 menit. d. Preparat diinkubasikan dalam prediluted blocking solution selama 10 menit pada suhu kamar 25ᵒC. e. Antibody primer antibody monoclonal komersial yang telah dipersiapkan ditambahkan sebanyak 100 µl per preparat (disesuaikan sampai semua bagian tergenang) kemudian diinkubasikan dalam kulkas selama 24 jam. f. Preparat selanjutnya dicuci dengan PBS selama 5 menit. g. Biotinylated universal secondary antibody sebanyak 100 µl per preparat ditambahkan, kemudian preparat diinkubasikan pada suhu kamar 250C selama 10 menit. h. Preparat dicuci dengan PBS selama 5 menit. i. Preparat diinkubasikan dengan ready-to-use streptavidin/peroxidase complex reagen selama 10 menit. j. Preparat dicuci dengan PBS selama 5 menit. k. Preparat diinkubasikan dengan peroxidase substrate solution (DAB) 100 µl per preparat selama 2-10 menit (semakin tebal preparat waktu inkubasinya semakin lama). l. Preparat dicuci dengan air kran. m. Mayer hematoxylin (counterstain) sebanyak 100 µl ditambahkan, diinkubasikan selama 1-3 menit kemudian dicuci dibawah air kran. 45



n. Preparat selanjutnya dicelupkan kedalam alkohol, dibersihkan, dicelupkan kedalam xylol. o. Preparat selanjutnya ditetesi dengan mounting media kemudian ditutup dengan kaca penutup preparat. Setelah kering preprat siap diperiksa dibawah mikroskop dibawah perbesaran 400 kali dan 1000 kali. p. Preparat yang memperlihatkan warna coklat berarti positif antigen Dengue, sedangkan preparat yang menunjukan warna biru atau pucat sebagaimana kontrol negative berarti tidak mengandung antigen Dengue. q. Setiap kali pewarnaan harus disediakan control negative dan control positif. r. Kontrol positif yakni preparat nyamuk infeksius Dengue yang direaksikan dengan antibody primer. Control negative yakni preparat non infeksius yang direaksikan dengan pengencer antibody primer atau preparat nyamuk non infeksius yang direaksikan dengan antibody primer. C. Deteksi Virus Dengue Beberapa metode baru untuk mendiagnosis virDen telah dikembangkan dan terbukti bermanfaat, antara lain Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) dan imunositokimia Streptavidin Biotin Peroxidase Complex (SBPC). Dalam beberapa tahun terakhir ini, RT-PCR telah dikembangkan untuk sejumlah virus RNA dan berpotensi untuk mengubah secara drastis diagnosis laboratorik untuk Dengue. RT-PCR menyediakan suatu metode diagnostik serotipe virDen (virus Dengue) yang cepat. Metode ini cepat dan sensitif serta dapat digunakan untuk mendeteksi RNA virus pada sampel penderita suspek Dengue, jaringan autopsi, maupun nyamuk. Imunositokimia dalam diagnostik patologik seperti streptavidin biotin, avidin biotin kompleks, alkalin fosfatase antialkalin fosfatase atau peroksidase antiperoksidase telah tersedia secara komersial saat ini. Metode ISBPC menggunakan antibodi sekunder yang dilabel biotin sehingga dapat mengenal antibodi primer (antibodi monoklonal atau antibodi poliklonal) dan menggunakan konjugat streptavidin yang dilabel enzim horseradish peroxidase (HRP) serta campuran substrat kromogen untuk mendeteksi antigen pada sel atau jaringan dengan sensitifitas yang sangat tinggi. Antigen dengan kadar rendahpun bisa terdeteksi dengan adanya reaksi dua konjugat prediluted biotinilated secondary antibody dan prediluted streptavidin peroxidase. Dasar utama reaksi imunositokimia SBPC yaitu ikatan yang sangat kuat antara streptavidin dengan biotin. Oleh karena kadar antibodi sekunder yang dilabel biotin yang terikat lebih 46



banyak, maka kesempatan untuk dapat mengikat konjugat strepatvidin yang dilabel enzim horseradish peroksidase juga lebih banyak. Akibatnya enzim peroksidase akan mengkatalisis subtrat hidrogen peroksidase dan mengubah kromogen diaminobenzidine (DAB) menjadi deposit warna coklat yang menandakan lokasi tersebut mengandung antigen. Sebaliknya, bila tidak ada antigen maka tidak ada ikatan antara antibodi primer dan antigen sehingga pada saat pencucian dengan phosphate buffered saline (PBS) antibodi primer hanyut atau terbuang. Antibodi sekunder yang dilabel biotin pada saat pencucian juga ikut terbuang. Akibatnya, ketika diinkubasikan dengan konjugat streptavidin yang dilabel enzim HRP, tidak terdapat ikatan dengan antibodi sekunder. Oleh karena tidak terjadi reaksi enzimatik antara enzim HRP dan subtrat, maka tidak tampak perubahan warna menjadi coklat. Pada saat diinkubasikan selama tiga menit akan terjadi penyerapan oleh jaringan/sel sehingga menjadi warna biru atau ungu yang menunjukkan tidak adanya antigen atau negatif. Pemeriksaan immunositokimia SBPC dilakukan dengan mikroskop cahaya yang banyak tersedia di laboratorium, sedangkan Indirect Fluorescence Antibody Test (IFAT) harus diperiksa di bawah mikroskop fluoresen yang mahal dan jarang tersedia di laboratorium; selain itu, sediaan imunofluoresen mudah rusak bila tidak disimpan di cryofreezer. Hasil pemeriksaan virDen bersifat kualitatif tetapi sangat sensitif, spesifik, dan sahih untuk keperluan diagnostik virDen. Sediaan pencet kepala nyamuk (head squash) dapat dilihat secara mikroskopik dengan pembesaran 400x dan 1000x. Sampel telur yang diambil dari tempat tinggal yang terkena kasus DBD. Setelah dibiakkan di laboratorium diperoleh 48 ekor nyamuk Aedes aegypti. Pemeriksaan virus Dengue pada nyamuk Aedes Aegypti menggunakan teknik imunositokimia menunjukkan bahwa 24 ekor nyamuk positif virus Dengue dari 48 ekor nyamuk yang diperiksa. Pemeriksaan virus Dengue dengan metode imunositokimia menggunakan sediaan pencet kepala (head squash). Pada kepala nyamuk terdapat bagian yang amat penting untuk berkembang dan beramplifikasi virus Dengue, yaitu sel-sel glandula salivarius dan ovarium. Hal ini didukung oleh teori yang menunjukkan adanya perubahan bentuk secara morfologi dan histologi dibandingkan dengan nyamuk yang sehat atau tidak ditulari virus. Kedua organ nyamuk tersebut terlihat jauh lebih besar (membengkak). Antigen virus Dengue yang terlokalisir di sel-sel glandula salivarius yang sudah bercampur dengan sel-sel jaringan otak pada sediaan head squash akan berikatan dengan antibodi monoklonal anti virus Dengue DSSE10 dan akan dikenali oleh antibodi sekunder (Biotin). Selanjutnya konjugat streptavidin dan larutan substrat kromogen yang 47



ditambahkan pada sediaan dapat mendeteksi munculnya granula berwarna kecoklatan di sekitar sel yang terinfeksi. Hasil preparat berwarna cokelat pada sitoplasma atau granulgranul berwarna coklat di sekitar sel, positif antigen Dengue. Sedangkan Preparat berwarna biru, tidak mengandung antigen Dengue. Deteksi transmisi transovarial virus Dengue pada nyamuk vektor dapat menjadi salah satu bagian penting dalam kegiatan survei epidemiologi penyakit DBD, serta dapat digunakan dalam pengembangan untuk melengkapi sistem kewaspadaan dini dalam mengantisipasi tersebarnya penularan virus Dengue pada manusia dan munculnya kasus DBD baru yang sebelumnya tidak terdapat kasus DBD.



Gambar 2.1 Usus Tengah (kontrol negatif)



Gambar 2.2 Usus Tengah (hasil positif)



48



3. PENUTUP A. Kesimpulan 1. Dari hasil kunjungan di Balai Litbangkes P2B2 Banjarnegara tentang pemeriksaan imunohistokimia, dapat disimpulkan bahwa metode pemeriksaan imunohistokimia dilakukan untuk mengetahui persebaran virus Dengue yang terdapat pada tubuh nyamuk Aedes Aegypti. 2. Dari hasil pemeriksaan Imunohistokimia pada Head Squash nyamuk Aedes Aegypti, sebagian besar sudah terjangkit Virus Dengue, hal ini dapat disimpulkan bahwa sudah terjadi transovarial yang terjadi pada sampel nyamuk yang dilakukan pemeriksaan. B. Saran Perlu adanya tindak lanjut terkait hasil pemeriksaan Imunohistokimia yang mendapatkan hasil bahwa nyamuk Aedes Aegypti sudah mengalami transovarial dalam proses penularan virus Dengue pada Manusia. Hal ini perlu dilakukan kerjasama lintas sector dengan melibatkan masyarakat,tokoh masyarakat, kader serta pemerindah daerah setempat terhadap penanganan penyakit demam berdarah agar tidak terjadi peningkatan kasus dan angka kematian akibat demam berdarah dengan cara pencegahan dan pengendalian penyakit demam berdarah.



49



4. DAFTAR PUSTAKA



1. Sorisi, Angle M. H., Transmisi Transovarial Virus Dengue Pada Nyamuk Aedes spp.. Jurnal Biomedik (JBM), Volume 5, Nomor 1, Hal : 26-31. 2013. 2. Mosesa, Lidiasani P., dkk. Deteksi Transmisi Transovarial Virus Dengue Pada Aedes Aegypti Dengan Teknik Imunositokimia Di Kota Manado. Jurnal E-Biomedik (Ebm), Volume 4, Nomor 1, 2016. 3. Sari TF, Umniyati SR. Sensitivitas dan Spesifitas Antibodi Monoklonal DSSE10 pada Head Squash Toxorhynchites Splendens dengan Teknik Imunohistokimia. Jurnal Vektora. Vol IV, No 2, Hal : 124. 2011. 4. Pramestuti N, Widiastuti D, Raharjo J. Transmisi Trans-ovari Virus Dengue pada Nyamuk Aedes Aegypti dan Aedes albopictus di Kabupaten Banjarnegara. Jurnal Ekologi Kesehatan. Vol 12. No.3, Hal :187- 94. 2013. 5. Pramestuti N, Djati, Anggun Paramita. Distribusi Vektor Demam Berdarah Dengue (Dbd) Daerah Perkotaan Dan Perdesaan Di Kabupaten Banjarnegara. Bul. Penelit. Kesehat, Vol. 41, No. 3, Hal : 163 – 170. 2013.



50



BAB V. UJI BIOKEMIS ELISA 1. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Resistensi insektisida sejati atau resistensi fisiologis adalah kemampuan individu serangga untuk bertahan hidup terhadap suatu dosis insektisida yang dalam keadaan normal dapat membunuh spesies serangga tersebut (WHO, 1992). Resistensi silang adalah perkembangan resistensi terhadap insektisida pada populasi nyamuk karena penekanan selektif insektisida lain dengan persamaan mekanisme, seringkali tidak dalam katagori insektisida yang sama. Sedangkan resistensi ganda adalah resistensi secara simultan terhadap beberapa insektisida dengan perbedaan katagori insektisida. Resistensi merupakan rintangan tunggal paling besar dalam keberhasilan pengendalian serangga (termasuk nyamuk) secara kimia (Widiarti, et. al, 2009). Penilaian kepekaan vektor terhadap insektisida merupakan langkah dasar dalam perencanaan dan evaluasi epidemiologis dari suatu program pengendalian sehubungan dengan penggunaan insektisida. Pengujian seyogyanya dilakukan untuk menentukan atau membuat dasar kepekaan dari vektor yang berbeda dari daerah satu dengan lainnya, memonitor kemungkinan adanya perubahan status kerentanan karena periode aplikasi insektisida, mengidentifikasi mekanisme resistensi dan spektrum resistensi silang serta mengetahui kepekaan vektor untuk menentukan insektisida alternatif apabila terjadi perubahan kepekaan (Najera and Zaim, 2001). Untuk mengukur resistensi ada dua cara yaitu secara konvensional menggunakan uji susceptibility standart WHO dan uji biokimia atau uji enzimatis. Uji biokimia adalah teknik mendeteksi resistensi nyamuk terhadap insektisida yang sangat essensial berdasarkan quantifikasi enzim yang bertanggung jawab pada proses resistensi. Keunggulan uji biokimia selain mengetahui resistensi vektor terhadap insektisida, juga dapat menggambarkan adanya resistensi silang melalui mekanisme yang berlangsung pada serangga secara individu. Terjadinya resistensi serangga secara biokimia berlangsung melalui 3 mekanisme dasar yaitu : (1) berkurangnya penetrasi insektisida, (2) insektisida dimetabolisasi oleh enzim esterase, mixed function oxidases atau glutathione transferase dan (3) adanya modifikasi target (sasaran) insektisida. (Widiarti, et. al, 2009).



51



Berdasarkan uraian diatas, perlu dilakukan pengujian resistensi terhadap insektisida secara biokimia menggunakan ELISA reader pada serangga yang bertujuan untuk mengidentifikasi mekanisme resistensi serangga terhadap insektisida golongan organophosphat. B. Tujuan 1. Mengetahui tujuan uji resistensi insektisida secara biokimia. 2. Mengetahu prosedur kerja uji resistensi insektisida secara biokimia. 3. Mengetahui intepretasi data pada uji resistensi insektisida secara biokimia. C. Manfaat Menambah wawasan, keterampilan dan pengetahuan mahasiswa dalam mengetahui tujuan, prosedur kerja dan intepretasi data pada uji resistensi insektisida secara biokimia.



52



2.



PEMBAHASAN



A. WAKTU PELAKSANAAN Hari/Tanggal Materi



Waktu



Keterangan Senin / 15 April 2019 Uji Resistensi Insektisida Secara Biokimia



Lokasi



(Esterase Assay) Balai Litbangkes P2B2 Banjarnegara



B. INSEKTISIDA Insektisida merupakan suatu bahan yang mempunyai efek menolak atau mematikan serangga dengan maksud membasmi serangga pengganggu atau vektor penyakit yang merugikan bagi kehidupan tanaman dan manusia. Ada bermacam-macam golongan insektisida baik yang berasal dari bahan alami maupun yang berasal dari bahan sintetik. Ada beberapa cara insektisida membunuh jasad sasaran atau serangga hama yaitu secara fisis, dengan merusak enzim, merusak syaraf dan dengan menghambat metabolisme (Dewi, 2006). Insektisida dapat dikelompokkan menurut cara masuknya dalam tubuh serangga dan menurut sifat kimianya (Untung, 2001). Pengelompokan insektisida menurut cara masuknya ke dalam tubuh serangga dapat dibagi menjadi 3 kelompok, yaitu : 1. Racun Perut Insektisida memasuki tubuh serangga melalui saluran pencernaan makanan (perut). Insektisida lama umumnya merupakan racun perut. Namun ada juga insektisida modern yang beraksi pada serangga melalui perut yaitu kelompok insektisida sistemik, yang dapat diserap oleh tanaman dan ditranslokasikan dalam jaringan tanaman. Serangga yang mencucuk tanaman dan kemudian menghisap cairan tanaman yang sudah mengandung insektisida akan mati. 2. Racun kontak Insektisida memasuki tubuh serangga apabila serangga mengadakan kontak dengan insektisida atau serangga berjalan di atas permukaan tanaman yang telah mengandung insektisida. Di sini insektisida masuk ke dalam tubuh serangga melalui dinding tubuh. 3. Fumigan



53



Fumigan merupakan insektisida yang mudah menguap menjadi gas dan masuk ke dalam tubuh serangga melalui sistem pernapasan serangga atau sistem trachea yang kemudian diedarkan ke seluruh jaringan tubuh. Pengelompokan insektisida menurut sifat kimiawi bahan dapat dibagi menjadi 5 bagian, yaitu: 1. Organoklorin/hidrokarbon terklorinasi (OC) Insektisida organoklorin merupakan insektisida yang paling banyak digunakan dalam praktek kesehatan masyarakat. Penggolongan untuk insektisida organoklorin adalah sebagai berikut : a. DDT dan Analog DDT DDT digunakan di dalam rumah pada permukaan dinding dan pada tempattempat yang ptensial untuk perkembangbiakan nyamuk. Insektisida ini memiliki toksisitas tinggi pada serangga dan mampu membunuh serangga dengan kontak sederhana, namun memiliki toksisitas yang rendah pada manusia. Penggunaan DDT ekarang ini mengalami penurunan dikarenakan terjadinya resistensi dari serangga. b. Heksakloroheksan (HCH) Insektisida ini digunakan secara luas untuk melawan serangga dan kepentingan medis sejak tahun 1942. HCH memiliki aksi yang kuat, membunuh dengan cepat dan sedikit meninggalkan residu. HCH secara khusus digunakan sebagai pengganti DDT pada daerah yang resisten terhadap DDT. c. Siklodien Insektisida yang termasuk ke dalam golongan insektisida ini adalah aldrin, klordane, dieldrin, heptaklor, endrin, endosulphan. Dieldrin paling luas digunakan dalam pengendalian malaria sebagai pengganti DDT. Dieldrin memiliki toksisitas tinggi daripada DDT dan HCH pada serangga, manusia dan binatang. 2. Organofosfat (OP) Insektisida OP telah digunakan secara luas dalam bidang pertanian, namun karena adanya resistensi terhadap organoklorin, OP digunakan dalam praktek kesehatan masyarakat. Kebanyakan OP merupakan ester atau amida dari ikatan asam fosfor/pirofosfor organik. Temefos dan malation termasuk dalam insektisida ini. Mekanisme



kerja



insektisida



ini



asetilkolinesterase (AchE). 54



adalah



dengan



mempengaruhi



reseptor



3. Karbamat Insektisida karbamat adalah ester asam yang memiliki kemiripan dengan insektisida OP. mekanisme kerjanya sama dengan insektisida OP yaitu mempengaruhi reseptor asetilkolinesterase (AchE). 4. Piretroid Insektisida piretroid digunakan karena terjadinya resistensi pada insektisida OC, OP, dan Karbamat. Insektisida ini mudah terdegradasi/tidak meninggalkan residu di tanah, memiliki toksisitas tinggi dan aksinya cepat pada sejumlah besar serangga. Saat ini piretroid digunakan sebagai senjata ampuh dalam pengendalian serangga dalam kepentingan umum maupun kesehatan. 5. Biopestisida Biopestisida adalah insektisida yang menggunakan suatu organisme dalam pemberantasan serangga. Insektisida ini muncul karena adanya resitensi pada OC, OP, Karbamat maupun piretroid. C. DETEKSI RESISTENSI Deteksi resistensi diperlukan untuk memberikan informasi mengenai pengendalian vektor yang efektif pada resistensi insektisida yang belum pernah dikumpulkan dalam sebuah peraturan yang sistematis. Oleh karena itu diperlukan proses pemantauan dan evaluasi status resistensi insektisida beserta mekanisme resistensinya yang digunakan untuk merencanakan pengujian manajemen resistensi yang sederhana dan efektif (Coleman and Hemingway, 2007). Pengujian status resistensi dapat dilakukan dengan 2 metode yaitu : 1. Uji Hayati Uji yang paling lazim digunakan pada praktek di lapangan (Coleman and Hemingway, 2007). Metode ini merupakan standar WHO untuk uji di dalam laboratorium. Metode uji ini adalah pemberian dosis yang telah ditetapkan untuk dapat membunuh 50% dan 90% populasi serangga sehingga bisa diperkirakan dan dapat mendeteksi segala perubahan prosentase kematian pada setiap waktu disesuaikan dengan kenyataan yang terjadi di lapangan. Hasil dari uji diagnosis ini diharapkan mampu menerangkan pola resistensi menurun pada serangga dan menggambarkan mekanisme resistensi yang terjadi. Kelemahan uji ini adalah tidak bisa digunakan untuk memantau resistensi pada 55



tingkat gen dari suatu populasi nyamuk secara akurat, sehinga tidak bisa digunakan untuk memprediksi terjadinya cross-resistance antar insektisida (Coleman and Hemingway, 2007). 2. Uji Biokemis Uji sederhana untuk mendeteksi peningkatan aktivitas enzim pada metabolisme serangga, yaitu esterase, glutathione S-transferase (GST), dan sitokrom P-450. Uji ini mendeteksi peningkatan aktivitas enzim terhadap substrat model pada individual resisten. Metode uji ini cukup akurat untuk menggambarkan terjadinya resistensi pada tingkat gen (Coleman and Hemingway, 2007). Di samping itu juga ada cara pengujian dengan menggunakan metode biokimia Lee (cit. Mardihusodo, 1996). D. PROSES TERJADINYA RESISTENSI DAN MEKANISME RESISTENSI Serangga dikatakan telah resisten terhadap suatu insektisida jika dengan dosis yang biasa



digunakan, serangga tersebut tidak dapat dibunuh (Soedarto, 2008). Resistensi



yang



kadangkala



diindikasikan oleh menurunnya efektivitas suatu teknologi



pengendalian tidak terjadi dalam waktu singkat (Untung, 2004). Lamanya proses resistensi pada serangga terhadap insektisida sangat bervariasi, dari hanya satu sampai



dua



digunakan



tahun, untuk



hingga puluhan tahun. Sebagai contoh, senyawa arsenik yang



mengendalikan kumbang kolorado pada kentang di Long Island



(Amerika Serikat) sejak tahun 1880, baru menampakkan gejala resistensi pada tahun 1940-an, tetapi fenvalerat telah menyebabkan resistensi hanya dalam waktu tiga tahun, bahkan karbofuran tidak lagi efektif



setelah dua tahun digunakan (Djojosumarto,



2006). Resistensi insektisida berkembang setelah adanya proses seleksi yang berlangsung selama banyak generasi. Resistensi diakibatkan oleh



seleksi



terus menerus. Di alam



pada



merupakan suatu



serangga



frekuensi



alel



yang



fenomena



evolusi



yang



diberi perlakuan insektisida secara



individu rentan lebih besar dibandingkan



frekuensi alel individu resisten, dan frekuensi alel homosigot resisten (RR) berkisar antara 10-2 sampai 10-13. Karena adanya seleksi yang terus menerus jumlah individu yang peka dalam suatu populasi semakin sedikit. Individu resisten kawin satu dengan lainnya, sehingga menghasilkan keturunan yang resisten pula. Populasi yang tetap hidup pada aplikasi insektisida permulaan akan menambah proporsi individu yang tahan terhadap senyawa dan meneruskan sifat ini pada keturunan mereka (Untung, 2004). 56



Pengguna insektisida sering menganggap bahwa serangga yang tetap hidup belum menerima dosis letal, sehingga mereka



meningkatkan dosis dan frekuensi aplikasi.



Tindakan ini yang mengakibatkan semakin menghilangnya proporsi serangga yang peka dan meningkatkan proporsi serangga yang tahan dan tetap hidup. Dari generasi ke generasi proporsi individu resisten dalam suatu populasi akan semakin meningkat dan akhirnya populasi tersebut akan didominasi oleh individu yang resisten. Resistensi tidak akan menjadi



masalah



sampai



suatu



populasi didominasi oleh individu - individu



yang resisten, sehingga pengendalian serangga menjadi tidak efektif lagi. Salah satu faktor yang mempengaruhi laju perkembangan resistensi



adalah



tingkat



tekanan



seleksi yang diterima oleh suatu populasi serangga. Pada kondisi yang sama, suatu populasi yang menerima tekanan



yang lebih keras akan berkembang menjadi



populasi yang resisten dalam waktu yang lebih singkat dibandingkan yang



populasi



menerima tekanan seleksi yang lemah.



Menurut Huang (2002), mekanisme resistensi suatu serangga terhadap insektisida dapat dibagi menjadi 3 yaitu: 1. Reduksi penetrasi Resistensi ini terjadi karena adanya penurunan tingkat penetrasi insektisida pada kutikula serangga, namun pada kenyataannya hal tersebut tidaklah menunjukkan hasil yang cukup efektif suatu insektisida dapat membunuh serangga. Mekanisme resistensinya adalah adanya modifikasi pada kutikula serangga atau saluran pencernaan sehingga mencegah/memperlambat absorbsi atau penetrasi insektisida yang mbat absorbsi atau penetrasi insektisida yang dapat ditemukan keturunan serangga resisten. Hal ini akan memberikan waktu yang lama bagi enzim pendetoksifikasi untuk memetabolisme insektisida yang masuk sehingga insektisida tersebut menjadi kurang efektif (McCaffery and Nauen, 2006). 2. Resistensi metabolik Resistensi metabolik merupakan mekanisme resistensi yang paling banyak terjadi pada serangga. Mekanisme ini didasarkan pada sistem enzim yang dimiliki oleh serangga untuk mendetoksifikasi bahan-bahan kimia yang masuk secara alamiah (McCaffery and Nauen, 2006). Resistensi metabolik pada serangga ini diperantarai oleh perubahan-perubahan protein secara kualitatif dan kwantitatif yang agaknya sulit untuk didefinisikan secara tepat dengan uji biokemis. Pada resistensi metabolik terdapat 3 enzim yang terlibat dalam detoksifikasi insektisida, yaitu enzim monooksigenase, enzim esterase dan enzim GST. 57



Keterlibatan ketiga enzim tersebut pada resistensi dapat diidentifikasi secara umum oleh adanya peningkatan metabolit khusus yang diproduksinya. Mekanisme resistensi metabolik telah diidentifikasi dalam populasi vektor pada sebagian besar insektisida termasuk organofosfat, karbamat, piretroid, dan DDT. 3. Resistensi pada tempat aksi Secara umum aksi insektisida terjadi pada tempat spesifik di dalam tubuh serangga, khususnya di dalam sistem saraf (untuk insektisida OP, karbamat, dan piretroid). Serangga yang resisten akan memodifikasi tempat aksi sehingga insektisida tidak dapat terikat secara efektif pada tempat aksi, maka dapat dikatakan bahwa serangga tidak memperoleh efek dari insektisida dan pengaruhnya tidak terlalu besar dibandingkan serangga yang masih rentan. Sebagai contoh, target aksi insektisida OP dan karbamat adalah pada asetilkolinesterase (AChE) dalam sinapsis sel saraf (McCaffery and Nauen, 2006). Selain faktor - faktor tersebut di atas, faktor terjadinya



resistensi



serangga



lain



yang



dapat



mempengaruhi



terhadap insektisida adalah stadium serangga,



generation time serangga dan kompleks genetik (genetic complex) serangga. Insektisida yang bekerja terhadap semua stadium serangga, artinya dapat membunuh stadium telur, larva, pupa, maupun dewasa, akan lebih cepat terjadi resistensi terhadapnya dibandingkan dengan insektisida yang hanya bekerja terhadap satu stadium dari serangga. Serangga - serangga yang mempunyai siklus hidup pendek sehingga dalam setahun terdapat banyak



generasi,



akan



lebih



cepat



menjadi resisten



terhadap



insektisida



dibandingkan dengan serangga - serangga yang hanya mempunyai satu generasi dalam setahun (siklus hidupnya panjang). Dalam hal kompleksitas dari gen, semakin banyak gen yang mengatur kemampuan resistensi serangga



terhadap



insektisida, semakin



lambat terjadi resistensi. Jika jumlah gen pengatur resistensi sedikit, serangga cepat resisten



terhadap insektisida (Soedarto, 2008).



PEMBAGIAN RESISTENSI Menurut Soedarto (2008), resistensi dibagi menjadi resistensi bawaan (natural resistancy) dan resistensi yang didapat (acquired resistancy).



58



1. Resistensi bawaan Serangga yang secara alami sensitif terhadap suatu insektisida akan menghasilkan secara alami keturunan yang juga sensitif terhadap insektisida tersebut. Sedangkan serangga



yang secara



keturunannya



alami



sudah



resisten



terhadap suatu



insektisida,



juga akan resisten terhadap insektisida bersangkutan. Selain itu,



serangga yang sensitif terhadap suatu insektisida jika mengalami terjadi satu kali



setiap



beberapa



ratus



atau



mutasi (yang



ribu tahun) dapat berkembang



menjadi serangga yang resisten terhadap insektisida tersebut. 2. Resistensi didapat Akibat pemberian dosis insektisida yang di bawah dosis lethal dalam waktu yang lama, serangga target yang sebelumnya sensitif dapat menyesuaikan diri berkembang menjadi resisten terhadap insektisida tersebut. Berdasar atas jenis insektisida yang tidak lagi peka terhadap serangga, resistensi dibedakan menjadi resistensi silang (cross resistance) dan resistensi ganda (double resistance) (Hoedojo & Zulhasril, 2000; Soedarto, 2008). 1. Cross resistance Resistensi serangga yang terjadi terhadap dua insektisida yang satu golongan atau



satu



seri,



misalnya resisten terhadap malathion dan diazinon



(satu



golongan) atau kebal terhadap DDT dan metoksiklor (satu seri). 2. Double resistance Resistensi serangga yang terjadi terhadap



dua



insektisida



yang



berbeda



golongannya atau serinya, misalnya resisten terhadap malathion dan DDT (beda golongan) atau DDT dan dieldrin (beda seri). Jika satu jenis serangga telah resisten terhadap suatu insektisida, maka dosis insektisida harus dinaikkan. Jika dosis insektisida



terus -menerus



membahayakan



kesehatan



dinaikkan, manusia



maka pada dosis tertentu akan dapat



dan hewan



serta



berdampak



buruk



pada lingkungan hidup. Karena itu, insektisida harus diganti dengan jenis atau golongan lain atau diciptakan insektisida baru untuk memberantas serangga tersebut (Soedarto, 2008). Saat ini laju penemuan insektisida baru lambat,



hal



ini



dapat disebabkan



penelitian untuk menemukan insektisida



antara baru



lain: yang



1)



sangat



peningkatan biaya



memenuhi



syarat,



2)



peningkatan biaya dan persyaratan registrasi insektisida yang semakin ketat, 3)



59



peningkatan



biaya



produksi,



serta



4) semakin ketatnya kompetisi antar



produsen insektisida (Untung, 2004).



Mekanisme resistensi piretroid pada serangga secara garis besar ada 2 macam, yaitu peningkatan laju detoksifikasi metabolik dari insektisida dan pengubahan sensitivitas dari tempat aksi. Detoksifikasi metabolik juga dapat dihubungkan dengan perubahan aktivitas monooksigenase dan produksi esterase, namun dilaporkan juga terjadi peningkatan pada glutation S-transferase (Brengues et al., 2003). Menurut penelitian Aldridge, resistensi serangga terhadap insektisida dapat meningkat melalui 2 mekanisme : 1. Serangga memproduksi/menghasilkan sejumlah besar enzim, seperti esterase yang merusak tiap molekul insektisida atau mengikatnya dengan kuat sehingga tidak dapat berfungsi (prosesnya disebut sequestrasi). 2. Terjadinya mutasi dari tempat target insektisida, misalnya enzim asetilkolinesterase pada susunan saraf yang menyebabkan mutasi karena mengubah sensitivitas pada tempat target tersebut. Ini secara efektif menghambat aksi dari insektisida (Aldridge, 2006). E. ENZIM ESTERASE NON SPESIFIK Enzim pada hakekatnya merupakan katalis efektif, yang bertanggung jawab bagi terjadinya reaksi kimia terkoordinasi yang terlibat dalam proses biologi dari sistem kehidupan. Sebagai suatu katalis, suatu enzim tidak dirusak dalam suatu reaksi dan karena itu tetap tidak berubah dan dapat digunakan kembali. Suatu ciri yang menonjol dari enzim sebagai katalis adalah spesifitas substrat, yang menentukan fungsi biologinya. Banyak faktor yang mempengaruhi laju reaksi suatu enzim diantaranya yang paling penting adalah konsentrasi-konsentrasi substrat dan enzim. Beberapa faktor utama yang lain adalah suhu, pH, kekuatan ionik, dan adanya inhibitor. Esterase adalah enzim yang memecah ikatan ester dengan cara hidrolisis. Esterase yang terdapat dalam hati dapat memecah ester sederhana, misalnya etil butirat menjadi etanol dan asam butirat, enzim karboksilesterase dapat menghidrolisis ikatan ester suatu bahan seperti piretroid menjadi bentuk asam dan alkohol yang biasanya disebut sebagai produk detoksifikasi (Wheelock et al., 2005a).



60



Isoenzim esterase harus dipelajari secara intensif karena pada beberapa spesies, isoenzim esterase memegang peranan dalam mekanisme resistensi terhadap insektisida (Mulyaningsih, 2002). Aktivitas karboksilesterase sangat penting mendetoksifikasi beberapa ikatan ester suatu bahan, termasuk piretroid (Wheelock et al., 2005). Enzim esterase diketahui terlibat dalam mekanisme resistensi insektisida pada serangga. Apabila esterase dilibatkan dalam penentuan status resistensi pada serangga seharusnya populasi serangga yang resisten akan memiliki aktivitas enzim esterase yang lebih tinggi daripada populasi serangga yang rentan. Seleksi oleh populasi serangga terhadap masuknya insektisida secara berulang-ulang dapat menghasilkan peningkatan kemampuan metabolisme terhadap insektisida, dan laporan mengenai resistensi insektisida yang berkaitan dengan peningkatan aktivitas karboksilesterase semakin banyak, seperti peningkatan aktivitas karboksilesterase terhadap resistensi malation pada Musca Domestica dan nyamuk. Piretroid juga rentan oleh hidrolisis karboksilesterase sehingga banyak laporan tentang resistensi piretroid pada serangga (Wheelock et al., 2005). Hubungan karboksilesterase dengan resistensi serangga terdapat 3 mekanisme, yaitu : 1.



Resistensi dapat meningkat karena adanya multiplikasi gen karboksilesterase yang mengkatalisis metabolisme insektisida pada populasi serangga yang resisten. Kelebihan produksi enzim ini telah ditunjukkan pada Myzuz persicae, nyamuk famili Culicidae dan Nilaparvata lugens.



2.



Kemampuan karboksilesterase berperilaku sebgai “pemusnah insektisida” dan dapat menghambat terjadinya interaksi anatara insektisida dan tempat aksi. Hal ini akan mengakibatkan adanya co-expression pada tempat target sehingga akan menurunkan sensivitas insektisida.



3.



Adanya mutasi struktur gen karboksilesterase sehingga terjadi peningkatan kemampuan enzim tersebut memetabolisme insektisida dengan kemampuan bermutasinya (Wheelock et al., 2005).



F. UJI BIOKIMIA ENZIM ESTERASE



61



Enzim yang berperan yaitu esterase. Salah satu substrat yang dapat dipecah oleh enzim esterase adalah senyawa organofosforus yang merupakan penyusun insektisida golongan organofosfat. Apabila dalam tubuh suatu serangga mengalami peningkatan aktivitas enzim esterase, maka enzim tersebut akan menghidrolisis atau memecah senyawa organoposporus yang masuk ke tubuh serangga. Uji biokimia aktivitas enzim esterase pada serangga bertujuan untuk mengidentifikasi mekanisme resistensi serangga terhadap insektisida golongan organophosphat. Deteksi esterase dengan substrat analog : α/β nafthil asetat menjadi senyawa ester. Perubahan warna oleh karena hidrolisa substrat α atau β naphthyl - acetate



α atau β naphtol +



Asam acetat.



Dengan adanya coupling agent Fast Blue akan terbentuk reaksi positif berwarna hijaubiru. G. BAHAN PEMERIKSAAN Bahan - bahan yang digunakan adalah sebagai berikut : 1. Homogenat nyamuk 2. a-naphthyl asetat (Sigma) 3. aseton 4. larutan Phosphat Buffer Saline (PBS) 0,02 M, Ph 7,0 (Sigma) 5. garam fast blue B (o-dianisidine tetrazotized) (Sigma) 6. sodium dodechy sulfat (SDS) 5% b/v (Sigma) 7. asam asetat 98% (Merck) 8. aquadest H. ALAT PEMERIKSAAN 62



Alat yang digunakan adalah sebagai berikut : 1. Ovitrap sebagai perangkap nyamuk bertelur. 2. Aspirator yang digunakan sebagai alat untuk melakukan penangkapan nyamuk yang akan digunakan. 3. Sangkar nyamuk digunakan untuk memelihara nyamuk mulai dari telur hingga menghasilkan nyamuk pada fase dewasa. 4. Homogenisator (Promega) digunakan sebagai alat untuk menggerus nyamuk sehingga menjadi homogenat.



Naftil asetat + As. Asetat 5. Microplates (Becton Dickinson) sebagai tempat Nafthol untuk mencampur homogenat nyamuk dengan bahan pereaksi lainnya.



Hidrolis oleh esterase



6. Micropipet untuk mengambil larutan substrat dan reagen dalam jumlah mikroliter dan untuk memindahkan homogenat ke dalam sumuran microplates. 7. ELISA Reader (BIO-RAD) adalah alat yang digunakan untuk mengukur intensitas warna secara kuantitatif dengan pembacaan Absorbance Value (AV) hasil reaksi uji biokemis. 8. Pipet tetes, pipet ukur, labu ukur, beker glass digunakan untuk membuat reagen. I. UJI BIOKEMIS TERHADAP NYAMUK Ae. aegypti Langkah kerja uji biokemis terhadap nyamuk ae. Aegypti adalah sebagai berikut : 1. Sebanyak 20 µL homogenat nyamuk dimasukkan ke dalam mikroplate. 2. Tambahkan 200 µL working solution (Alfa Naftil asetate). 3. Inkubasi selama 10-15 menit sambil digoyang menggunakan shaker. 4. Tambahkan 50 µL larutan coupling agent (Fast Blue). 5. Inkubasi selama 15-20 menit dengan menggunakan shaker. 6. Baca absorbansi dengan ELISA Reader pada λ = 450 nm. J. ANALISIS HASIL / INTERPRETASI DATA Intensitas warna akhir produk reaksi biokemis ditetapkan secara kualitatif dan kuantitatif dengan ELISA Reader pada λ = 450 nm. 1. Analisis hasil uji kualitatif Analisis hasil uji kualitatif dilakukan dengan membandingkan intensitas warna diperoleh dari sampel dengan warna yang diperoleh dari kontrol positif dan negatif. 2. Analisis hasil uji kuantitatif 63



Data kuantitatif diperoleh dengan cara menentukan harga cut off positive AV tiaptiap replikat. Enzim esterase nonspesifik secara kuantitatif diukur dengan pembacaan absorbance value (AV) menggunakan ELISA reader pada λ = 450 nm.  AV < 0,700 (Sangat Rentan / SS)  AV = 0,700 - 0,900 (Resisten Sedang / RS)  AV > 0,900 (Resisten Tinggi / RR)



64



3. PENUTUP A. KESIMPULAN Uji biokimia aktivitas enzim esterase pada serangga bertujuan untuk mengidentifikasi mekanisme resistensi serangga terhadap insektisida golongan organophosphat. Deteksi esterase dengan substrat analog : α/β nafthil asetat menjadi senyawa ester. Perubahan warna oleh karena hidrolisa substrat α atau β naphthyl - acetate



α atau β naphtol + Asam acetat.



Intensitas warna akhir produk reaksi biokemis ditetapkan secara kualitatif dan kuantitatif dengan ELISA Reader pada λ = 450 nm. Data kuantitatif diperoleh dengan cara menentukan harga cut off positive AV tiap-tiap replikat. Enzim esterase nonspesifik secara kuantitatif diukur dengan pembacaan absorbance value (AV) menggunakan ELISA reader pada λ = 450 nm. 1) AV < 0,700 (Sangat Rentan / SS) 2) AV = 0,700 - 0,900 (Resisten Sedang / RS) 3) AV > 0,900 (Resisten Tinggi / RR) B. SARAN Perlu adanya ketelitian dan keahlian



pada saat pelaksanaan uji biokimia



aktivitas enzim esterase pada serangga agar hasilnya tidak bias.



65



4. DAFTAR PUSTAKA



1. Aldridge, S. 2006. Insecticide Resistance : from Mechanisms to Management. http:///www.halalguide.info/content/view/818/38/. Diakses pada tanggal 1 Mei 2019. 2. Brengues, C., Hawkes, N.J., Chandre, F., Mc Carroll, L., Duchon, S., Guillet, P., Manguin, S., Morgan, J.C., and Hemingway, J. 2003. Pyrethoid and DDT Crossresistance in Aedes aegypti is Correlated with Novel Mutations in the Voltage-gated Sodium Channel Gene. http://pcwww.liv.ac.uk/hranson/Hawkes%20b.pdf. Diakses pada tanggal 1 Mei 2019. 3. Coleman, M., and Hemingway, J., 2007. Insecticide Resistance Monitoring and Evaluation in Disease Transmitting Mosquitoes. http://www.jstage.jst.go.jp/article/jpestics/32/2/69/pdf diakses pada tanggal 1 Mei 2019. 4. Dewi, A.A.I.A.G., 2006. Penentuan Status Resistensi Nyamuk Aedes aegypty yang Berasal dari Wilayah Denpasar Timur (Bali) Terhadap Insektisida Organofosfat Secara Biokemis. Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. 5. Djojosumarto, P.,2006. Pestisida & Aplikasinya. Agromedia, Jakarta. 6. Firmanta, Yusuf. 2008. Deteksi Resistensi Nyamuk Aedes aegypti yang Berasal Dari Daerah Endemis dan Non Endemis Dengue di Kota Jambi Berdasarkan Aktivitas Enzim Esterase Non Spesifik Terhadap Insektisida Golongan Piretroid. Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 7. Hoedojo, Zulhasril, 2000. Insektisida dan resistensi. Dalam : Parasitologi Kedokteran, Edisi Ketiga. Balai Penerbit FKUI, Jakarta, hlm. 248 - 255. 8. Huang, H. 2002. Development of Diagnostis Tools for Detecting Expression of Resistance-Assosiated Esterase in the Tobacco Budworm, Heliothis virescens (F.). http://etd.lsu.edu/docs/available/etd-0914102-150023/unrestricted/Huangdis.pdf. Diakses pada tanggal 1 Mei 2019. 9. Mardihusodo, SJ., 1996. Application of Non Spesifik Esterase Enzyme Microassays To Detect Potensial Insecticide Resistance of Aedes aegypti Adult in Yogyakarta, Indonesia. Berkala Ilmu Kedokteran. Vol. 28, No.4:167-171. 10. McCaffery, A., and Nauen, R. 2006. Prevention and Management of Insecticide Resistance in Vectors and Pests of Public Health Importance. http://www.iraconline.org/documents/vectormanual.pdf. Diakses pada tanggal 30 April 2019. 11. Mulyaningsih, B. 2002. Esterase Variation in Aedes albopictus Skuse (Diptera:Culicidae) Population from Several DHF Endemic and Non Endemic Areas in Indonesia. I J Biotech, 584-589.



66



12. Najera, JA and M. Zaim. 2001. Malaria Vector Control. Insecticide for Indoor Residual Spraying. WHO/CDS/ WHOPES/2001.3. p 36- 47. 13. Soedarto, 2008. Parasitologi Klinik. Airlangga University Press, Surabaya, hlm 288291. 14. Untung, K. 2001. Pengantar Pengelolaan Hama Terpadu. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. 15. Untung, K. 2005. Pengantar Pengelolaan Hama Terpadu. Cetakan ke 4. Fakultas Pertanian UGM. Universitas Gadjah Mada Press. Yogyakarta. 198-199. 16. Widiarti, et. al. 2009. Uji Biokimia Untuk Identifikasi Mekanisme Resistensi Ganda Vektor Malaria Terhadap Insektisida Di Jawa Timur. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Vektor dan Reservoir Penyakit, Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Salatiga. JURNAL VEKTORA Vol. 1 No. 1 17. Wheelock, C.E., Shan, G., Ottea, J. 2005. Overview of Carboxylesterases and Their Role in the Metabolism of Insecticides. http://www.jstage.jst.go.jp/article/jpestics/30/2/75/pdf. Diakses pada tanggal 30 April 2019. 18. World Health Organisation. 1992. Expert Committee on Vector Bioligy and Control. Vector Resistance to Pesticide. WHO Technical Series. No. 818. WHO Geneva. 62 p.



67



5.



DOKUMENTASI



Gambar 1. Pengambilan Homogenat



Gambar 2. Penuangan dalam mikroplate



Gambar 3. Inkubasi dengan Shaker



68



Gambar 4. Hasil homogenat nyamuk yang telah di inkubasi.



Gambar 5. Intepretasi Data / Pembacaan menggunakan ELISA reader



BAB VI. SUSCEPTIBILITY 1. PENDAHULUAN A. Latar Belakang



69



Vektor adalah arthopoda yang dapat menimbulkan dan menularkan suatu infectious agent dari sumber infeksi kepada host atau induk semang yang rentan. Bagi dunia kesehatan masyarakat, binatang yang termasuk kelompok vektor merupakan binatang yang dapat merugikan kehidupan manusia karena disamping mengganggu secara langsung juga sebagai perantara penularan penyakit.1 Demam Berdarah Dengue (DBD) merupakan salah satu penyakit menular yang masih menjadi fokus utama program pengendalian.2 Data dari seluruh dunia menunjukkan Asia menempati urutan pertama dalam jumlah penderita DBD setiap tahunnya. Sementara itu, terhitung sejak tahun 1968 hingga tahun 2009, World Health Organization (WHO) mencatat negara Indonesia sebagai negara dengan kasus DBD tertinggi di Asia Tenggara.3 Pengendalian vektor dewasa dengan cara fogging masih menjadi pilihan utama dalam penanggulangan DBD. Tujuan kegiatan ini untuk membunuh nyamuk Aedes aegypti dewasa agar terputus mekanisme penularan penyakit DBD. Selain itu, masyarakat rumah tangga juga biasa melakukan upaya pembunuhan nyamuk Aedes aegypti menggunakan insektisida rumah tangga. Upaya tersebut akan efektif jika nyamuk yang menjadi sasaran belum resisten terhadap insektisida yang dipakai. Akan tetapi, penggunaan insektisida dalam jangka waktu panjang dengan frekuensi tinggi untuk pengendalian serangga menyebabkan peningkatan resistensi nyamuk terhadap senyawa aktif yang terkandung di dalamnya.4 Hal ini terjadi karena nyamuk Aedes aegypti dan dengue lainnya mampu mengembangkan sistem kekebalan terhadap insektisida yang sering dipakai. Serangga yang telah resisten akan bereproduksi dan akan terjadi perubahan genetik yang menurunkan keturunan resisten (filialnya), yang pada akhirnya akan meningkatkan proporsi vektor resisten dalam populasi.3 Resistensi vektor terhadap insektisida merupakan fenomena global terutama pengelola program pengendalian penyakit tular vektor di Indonesia. Resistensi bersifat diturunkan dan merupakan rintangan tunggal dalam keberhasilan pengendalian vektor secara kimia. Deteksi dini resistensi vektor terhadap insektisida dapat bermanfaat sebagai informasi program untuk pemilihan insektisida yang tepat dalam pengendalian vektor secara lokal spesifik diera desentralisasi. Deteksi resistensi vektor terhadap insektisida dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu deteksi secara konvensional dengan metode standar WHO Susceptibility



test menggunakan impregnated paper, deteksi secara



biokimia atau enzimatis menggunakan mikroplate dan deteksi secara molekuler.5



70



Uji Susceptibility adalah uji untuk mengetahui kerentanan suatu serangga terhadap insektisida. Untuk mengetahui status resistensi dengan metode uji Susceptibility (WHO standar) dilakukan dengan menggunakan impregnated paper. Secara garis besar metode penilaian uji dilakukan dengan menghitung jumlah nyamuk yang mati setelah terpapar insektisida.6 B. Tujuan 1. Untuk mengetahui metode dan prosedur pelaksanaan uji susceptibility . 2. Untuk mengetahui resistensi nyamuk Aedes aegypti terhadap insektisida dengan menggunakan uji susceptibility . C. Manfaat Dapat menambah pengetahuan dan wawasan mahasiswa dalam melakukan uji resistensi nyamuk Aedes aegypti terhadap insektisida dengan menggunakan uji susceptibility .



2.



TINJAUAN PUSTAKA



A. Nyamuk Aedes aegypti 71



Aedes aegypti merupakan jenis nyamuk yang dapat membawa virus dengue penyebab penyakit demam berdarah. Aedes aegypti tersebar luas di wilayah tropis dan sub-tropis Asia Tenggara, terutama di sebagian besar wilayah perkotaan. Penyebaran Aedes aegypti di pedesaan akhir-akhir ini relatif sering terjadi yang dikaitkan dengan pembangunan sistem persediaan air pedesaan dan perbaikan sistem transportasi.7 Klasifikasi Aedes aegypti adalah sebagai berikut : 8 Kingdom : Animalia Filum : Arthropoda Klas : Insekta Ordo : Diptera Famili : Culicidae Subfamili : Culicinae Genus : Aedes Spesies : Aedes aegypti B. Pengendalian Vektor Pengendalian DBD terutama ditujukan untuk memutus rantai penularan, yaitu dengan pengendalian vektornya. Pengendalian nyamuk dapat dibagi menjadi tiga yaitu pengendalian secara mekanik, pengendalian secara biologis, dan pengendalian secara kimia.9 Salah satu program pemberantasan vektor DBD adalah dengan menggunakan insektisida. Insektisida merupakan golongan pestisida terbesar yang digunakan dalam program pemberantasan hama dan vector penyakit serta berbagai jenis serangga pengganggu yang sering didapatkan di dalam dan sekitar rumah.3 Banyak program sudah dilakukan untuk mengurangi kasus, namun hasilnya angka kesakitan akibat penyakit ini masih tinggi. Salah satu program yang dilakukan dalam pengendalian vektor DBD adalah dengan space spraying, thermal fogging/ pengasapan, dan Ultra Low Volume (ULV). Jenis insektisida yang biasa digunakan dalam fogging adalah malathion, sipermetrin, piretroit, dan sintetik piretroit.2 Secara harfiah, insektisida adalah bahan kimia yang digunakan untuk membunuh atau mengendalikan serangga hama. Insektisida dapat berbentuk padat, larutan atau gas. Insektisida digunakan untuk mengendalikan serangga dengan cara mengganggu atau merusak system di dalam tubuh serangga. Insektisida yang saat ini umum digunakan adalah 4 golongan insektisida kimiawi yaitu organoklorin, organofosfat, karbamat dan 72



piretroid.



Penggunaan insektisida piretroid tahun-tahun belakangan ini menunjukan



kenaikan, akan tetapi jenis organoklorin dan beberapa senyawa organofosfat yang lebih toksik menunjukan penurunan. Sebagai racun kontak, insektisida yang diaplikasikan langsung menembus integument serangga (kutikula), trachea atau kelenjar sensorik dan organ lain yang berhubungan dengan kutikula. Bahan aktif insektisida dapat larut pada lapisan lemak kutikula dan masuk ke dalam tubuh serangga, meskipun insektisida tidak diaplikasikan secara langsung.6 C. Uji Kerentanan (Susceptibility Test ) Terjadinya resistensi akan menimbulkan masalah karena serangga yang telah resisten akan bereproduksi dan akan terjadi perubahan genetik yang menurunkan keturunan resisten (filialnya), yang pada akhirnya akan meningkatkan proporsi vektor resisten dalam populasi. Pengujian kerentanan vektor bertujuan untuk mengetahui status dan peta kerentanan spesies vektor terhadap insektisida yang telah dan akan digunakan untuk pengendalian vektor di daerah penyebaran dengan epidemiologi yang sama. Hal ini digunakan sebagai dasar dalam mengatur penggunaan insektisida dalam pengendalian vektor.10 Cara untuk mengetahui daya bunuh vector terhadap insektisida sesuai dengan standar uji entomologi yang ditetapkan oleh Departemen Kesehatan Republik Indonesia adalah dengan Susceptibility test.3 Uji susceptibility / uji resistensi stándar yang direkomendasikan WHO menggunakan impregnated papers. Nyamuk dewasa yang digunakan untuk pengujian dalam keadaan kenyang larutan gula (glucozed fed) dan telah berumur ± 2-3 hari.2 Kriteria kerentanan ditentukan menurut WHO, kematian sebesar 98-100% berarti suceptible (rentan), 80 – 97 % berarti toleran (diperlukan verifikasi), < 80% berarti resisten. Apabila dalam uji ditemukan kematian kontrol antara 5 – 20 %, maka dapat dikoreksi menggunakan rumus abbott’s : 2 Abbots Formula =



( % Kematian Uji - % Kematian Control ) ( 100 - % Kematian Control ) 3.



METODE



A. Waktu



73



x 100 %



Waktu survei entomologi demam berdarah (survei telur dan larva) adalah sebagai berikut : 1. Hari



: Senin



2. Tanggal



: 08 April 2019



3. Pukul



: 15.00 – 16.00 WIB



B. Tempat Tempat pelaksanaan praktikum uji resistensi nyamuk terhadap insektisida dengan metode uji susceptibility dilakukan di laboratorium uji insektisida P2B2VRP Salatiga. C. Alat dan Bahan 1. Alat yang digunakan dalam uji susceptibility No 1



Nama Keterangan 4 buah tabung percobaan Sebagai tabung uji yang dipaparkan dengan



2



dengan tanda merah insektisida 1 buah tabung kontrol Sebagai tabung



3 4 5 6 7



dengan tanda hijau Aspirator Sling hygrometer Stopwatch Paper Cup Kotak nyamuk



kontrol



yang



tidak



dipaparkan insektisida Untuk memindahkan nyamuk Untuk mengukur kelembaban ruangan Untuk pengukur waktu Sebagai tempat holding nyamuk Sebagai tempat penyimpanan nyamuk



2. Bahan yang digunakan dalam uji susceptibility No 1 2



Nama Kertas minyak Kertas berinsektisida



Keterangan Digunakan sebagai kontrol Mengandung insektisida dengan berbagai



3



Handuk basah kecil



konsentrasi Untuk menjaga kelembabaan nyamuk saat



4 5



holding Larutan air gula dan kapas Untuk makanan nyamuk saat holding Nyamuk yang akan diuji Nyamuk yang akan diuji 74



(125 ekor) umur 3-5 hari D. Langkah Kerja 1. Siapkan alat dan bahan untuk pengujian. 2. Sebelum melakukan pengujian ukur suhu dan kelembaban. 3. Masukan kertas yang sudah terpapar insektisida ( permethrin 0,75 % ) di tabung perlakuan dengan tanda merah dan kertas tanpa insektisida di tabung pembanding/ kontrol dengan tanda hijau. 4. Pindahkan nyamuk sebanyak masing-masing 25 ekor dari kandang menggunakan aspirator ke dalam tabung perlakuan ( kode warna merah 4 tabung) 5. Pindahkan nyamuk sebanyak 25 ekor dari kandang menggunakan aspirator ke dalam tabung kontrol ( kode warna hijau 1 tabung) 6. Kemudian pindahkan nyamuk kedalam tabung masing-masing dengan membuka sekat dan biarkan kontak langsung dengan insektisida selama 60 menit pada posisi tabung tegak. 7. Lakukan pencatatan pada form jumlah nyamuk yang pingsan / mati setiap 5 menit pada masing-masing tabung perlakuan dan kontrol. 8. Pindahkan nyamuk ke dalam paper cup dan biarkan selama 24 jam. 9. Selama penyimpanan catat temperatur min/max dan kelembaban nisbi udara. 10. Beri handuk basah agar nyamuk tidak mati atau kekeringan. 11. Beri makan dengaan larutan gula selama pengamatan. 12. Amati kondisi nyamuk setelah holding 24 jam.



Gambar 3.1 Tabung percobaan dan tabung kontrol



75



Gambar 3.2 Langkah kerja Uji Susceptibility



4.



HASIL DAN PEMBAHASAN



A. Hasil Praktikum dilaksanakan di laboratorium vektor P2B2VRP Salatiga., pada hari Senin tanggal 08 April 2019. Kegiatan praktikum yang dilakukan yaitu uji resistensi nyamuk terhadap insektisida dengan metode uji susceptibility . Adapun hasil yang diperoleh adalah sebagai berikut : 1. Jenis nyamuk uji



: Aedes Aegypti



2. Jumlah nyamuk yang di uji



: 125 ekor ( 25 ekor/tabung)



3. Jumlah tabung yang digunakan



: 5 Tabung ( 4 Perlakuan, 1 kontrol ) 76



4. Insektisida yang digunakan



: Permetrin 0,75 %



5. Pengukuran suhu



: 25,7 0C



6. Pengukuran Kelembaban



: 94,1 %



7. Pembacaan hasil uji nyamuk mati setelah kontak dengan insektisida Test Replicate



Waktu kontak



1



2



3



4



Total test



5 menit 10 menit 15 menit 20 menit 25 menit 30 menit 40 menit 50 menit 60 menit



0 6 20 24 25 25 25 25 25



0 1 18 22 25 25 25 25 25



1 0 21 25 25 25 25 25 25



0 3 17 23 25 25 25 25 25



1 10 76 94 100 100 100 100 100



% test Mortali ty 1 10 76 94 100 100 100 100 100



Total contro l 0 0 0 0 1 2 2 2 2



% Mortality control 0 0 0 0 4 8 8 8 8



B. Pembahasan Dari hasil pada tabel setelah nyamuk dilakukan kotak terhadap insektisida golongan permetrin 0,75 % dapat terlihat banyak nyamuk yang mati secara segnifikan pada menit ke-15 yaitu sebesar 76 %, dan menit ke-20 sebesar 94 %. Selanjutnya pada menit ke-25 sampai menit ke-60 persentase mortality menunjukan angka 100%. Hal ini menunjukan bahawa nyamuk tersebut suceptible (rentan) terhadap insektisida golongan permetrin 0,75 %. Hasil tersebut diatas sesuai dengan kriteria kerentanan ditentukan menurut WHO, kematian sebesar 98-100% berarti



suceptible (rentan), 80 – 97% berarti toleran



(diperlukan verifikasi), dan kematian < 80% berarti resisten. Apabila dalam uji ditemukan kematian kontrol antara 5 – 20 %, maka dapat dikoreksi menggunakan rumus abbott’s : 2 Abbots Formula =



=



=



( % Kematian Uji - % Kematian Control ) ( 100 - % Kematian Control ) ( 100 - 8 ) ( 100 - 8 ) 92 92



x 100 %



x 100 %



77



x 100 %



= 100 %



5.



PENUTUP



A. Kesimpulan 1. Setelah nyamuk dilakukan kotak terhadap insektisida golongan permetrin 0,75% dapat terlihat banyak nyamuk yang mati secara segnifikan pada menit ke-15 yaitu sebesar 76%, dan menit ke-25 sebesar 94%. Selanjutnya pada menit ke-25 sampai menit ke-60 persentase mortality menunjukan angka 100%. Hal ini menunjukan bahawa nyamuk tersebut suceptible (rentan) terhadap insektisida golongan permetrin 0,75 %. 2. Berdasarkan hasil uji Susceptibility



test yang dilakukan, insektisida golongan



Permetrin dengan konsentrasi/ dosis 0,75% masih cukup efektif digunakan untuk pengendalian nyamuk Aedes aegypti. B. Saran 1. Untuk pelaksanaan praktikum selanjutnya sebaiknya sampel nyamuk yang digunakan dalam uji kerentanan (susceptibility ) berasal dari nyamuk lapangan yang sudah sering terpapar dan kontak lansung dengan semua jenis insektisida. 2. Waktu pelaksanaan praktikum tidak terlalu cepat sehingga dapat mengamati dengan lebih detail dan dapat mengamati kembali nyamuk yang sudah di holding, agar mengetahui hasil uji dengan lebih baik. 78



6. DAFTAR PUSTAKA



1.



Yuniarsih, Eka. (2010). Uji Efektivitas Lotion Repelan Minyak Mimba (Azadirachta indica A. Juss) Terhadap Nyamuk Aedes aegypti. Jakarta,



Universitas Islam Negeri



Syarif Hidayatullah. 2.



Nita Rahayu, et.al. (2018). Status kerentanan Aedes aegypti terhadap beberapa golongan insektisida



di Provinsi Kalimantan Selatan. Balai Litbang P2B2 Tanah



Bumbu, Kalimantan Selatan. Journal : JHECDs Vol. 3, No. 1, Desember 2017. 1.



Sukmawati, et. al. (2018). Uji Kerentanan Untuk Insektisida Malathion Dan Cypermethrine (Cyf 50 Ec) Terhadap



Populasi Nyamuk Aedes Aegypti Di Kota



Makassar Dan Kabupaten Barru. Universitas Hasanuddin, Makassar. Journal : Volume 4, No. 1, Januari - April 2018 2.



Rahmayanti Amini, et. al. (2017). Statusresistensi Vektor Demam Berdarah Dengue (Aedes Aegypti) Terhadap Insektisida Jenis Fenitrothion 1% Di Kabupaten Kudus Provinsi Jawa Tengah. Journal : Keslingmas Vol. 37 No. 4 Hal. 405-534 | 469



3.



Widiarti, et. al. (2011). Peta Resistensi Vektor Demam Berdarah Dengue Aedes aegipty Terhadap Insektisida Kelompok Organofosfat, Karbamat, dan Pyrethroid Di Provinsi Jawa Tengah dan Daerah Istimewa Yogyakarta. B2P2VRP Salatiga.



79



4.



Firda Yanuar Pradani, et. al. (2011). Penentuan Status Resistensi Aedes Aegypti Dengan Metode Susceptibility Di Kota Cimahi Terhadap Cypermethrin. Loka Litbang P2b2 Ciamis, Jawa Barat. Jurnal : Vektora Vol Iii No 1



5.



Departemen kesehatan RI, (2010). Demam Berdarah Dengue di Indonesia tahun 19682009. Jakarta.



6.



Higa, Y. (2011). Dengue Vectors and their spatial distribution. Tropical Medicine and Health 39(4), 17-27.



7.



Aditama, T. Y., (2009). Standar Operasional Prosedur Pengendalian Resiko Lingkungan. Dirjen Pengendalian Penyakit dan Penyehatan Lingkungan Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta



8.



Bina Ikawati, et.al. (2015). Peta status kerentanan Aedes aegypti (Linn.) terhadap insektisida cypermethrin dan malathion di Jawa Tengah. Balai Litbang Pengendalian Penyakit Bersumber Binatang (P2B2) Banjarnegara. Journal : 7(1), 2015, Pp. 23-28



BAB VII. FOGGING, ULV, IRS 1. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Indonesia merupakan salah satu negara tropis di dunia. Iklim tropis menjadi penyebab berbagai penyakit tropis yang disebabkan oleh nyamuk, seperti malaria, filaria, demam berdarah, dan kaki gajah, bahkan menimbulkan epidemi yang berlangsung dalam spektrum yang luas dalam masyarakat (Kadarohman, 2010). Vektor penyakit adalah serangga penyebar penyakit atau arthopoda yang dapatmemindahkan ataupun menularkan agen infeksi kepada host yang rentan. Pengendalian vektor adalah suatu kegiatan untuk menurunkan kepadatan populasi vektor pada tingkat yang tidak lagi membahayakan bagi kesehatan manusia. (Slamet S 2009). Pada saat ini, penyebaran vektor yang dapat menyebabkan penyakit kepada manusia semakin meningkat. Dimana dengan berkembangnya zaman, vektor itu sendiri semakin kebal terhadap insektisida maupun racun. Penyakit tular vektor merupakan penyakit yang menular melalui hewan perantara (vektor) penyakit. Contohnya antara lain malaria, Demam Berdarah Dengue, Chikungunya, Japanese B Encephalitis (radang otak). Penyakit tersebut hingga kini 80



merupakan masalah kesehatan masyarakat di Indonesia dengan angka kesakitan dan kematian yang cukup tinggi dan berpotensi menimbulkan kejadian luar biasa (KLB). Penanggulangan penyakit tular vektor adalah selain dengan pengobatan terhadap penderita, juga dilakukan upaya-upaya pengendalian vektor termasuk upaya mencegah kontak dengan vektor guna mencegah penularan penyakit. Satu di antaranya adalah cara pengendalian vektor adalah dengan menggunakan insektisida. Karena pada dasarnya semua insektisida adalah racun, maka penggunaannya harus penuh dengan kehati-hatian dengan mempertimbangkan aspek keamanaan bagi kesehatan masyarakat, petugas, serta lingkungannya. B. Tujuan 1. Tujuan Umum Mengetahui teknik pengunaan alat untuk pengendalian vektor yang menggunakan insektisida 2. Tujuan Khusus a. Mengetahui pengendalian vektor dengan fogging b. Mengetahui pengendalian vektor dengan ULV (Ultra Low Volume) c. Mengetahui pengendalian vektor dengan IRS (Indoor Residual Spraying)



81



82



2.



HASIL DAN PEMBAHASAN



A. FOGGING Operasional fogging dengan mesin fogging yang diisi insektisida malathion 96% EC - Dosis; Malathion 438 gram, a.i./ha atau larutan max 500 ml malathion 96%EC/Ha. - Konsentrasi; Malathion 4,8% dalam solar (1 liter Malathion 96% dilarutkan dalam 19 liter solar - Out put fog; 10 liter larutan Malathion 4,8% perjam, untuk ini supaya dipergunakan nozlee ukuran garus tengah 0,8mm - Sasaran fogging; rumah/bangunan dan halaman/ pekarangan sekitarnya - Waktu operasional; pagi hari atau sore (Ae. aegypti) dan malam hari (Anopheles atau culex) - Kecepatan gerak fogging; seperti orang berjalan biasa (2-3 km/jam) - Temperatur udara ideal; 18o C, maksimal 28o C. - Fogging di dalam rumah; dimulai dari ruangan yang paling belakang, jendela dan pintu ditutup kecuali pintu depan untuk keluar masuk petugas - Fogging di luar rumah; tabung pengasap harus searah dengan arah angin, dan petugas berjalan mundur. - Penghuni rumah; selama rumah di fog dengan sistem thermal, semua penghuni supaya berada diluar, Setelah fog dalam ruangan menghilang baru para penghuni boleh masuk kembali. (15-30 menit setelah fogging). - Binatang peliharaan, makanan dan minuman; untuk menghindari hal-hal yang tidak diinginkan, maka dianjurkan semua makanan, bahan makanan dan tempat penampungan air minum agar ditutup. - Berdasarkan pengalaman, lama fogging; dari berbagai studi dan pengalaman selama ini untuk rumah dan halaman didaerah urban di Indonesia memakan waktu fogging antara 2-3 menit/rumah. Output petugas: 1 hari kerja +/- 20-25 rumah / petugas atau disesuaikan dengan keadaan setempat. Kebutuhan bahan bakar (bahan bakar untuk mesin fog; setiap 10 liter larutan malathion 4,8% diperlukan 1,2 liter bahan bakar. 1) Alat dan Bahan 1. Alat



:



a. Mesin Thermal Fogging b. Mesin Jet Sprayer c. Gelas takar 83



d. Corong e. Alat Pelindung Diri (APD) : helm atau topi pelindung, kacamata goggle, masker full face, handscun, seragam keamanan, dan sepatuu boot. 2. Bahan



:



a. Larutan insektisida (chemical) b. Bahan bakar 2) Cara Kerja 1. Thermal Fogging a. Siapkan



semua



peralatan



yang



digunakan,



termasuk



teknisi



sudah



menggunakan APD lengkap b. Masukan larutan insektisida, bahan bakar dan baterai sesuai dengan tempatnya pada mesin fogging. c. Tutup kran bahan bakar dan pompa 5 kali. Kemudian kran bahan bakar dibuka, tekan starter, bersama – sama dengan dipompa beberapa kali hingga mesin hidup. d. Atur kran bahan bakar dan katup udara hingga bunyi mesin terdengar normal dan stabil. e. Angkat mesin fogging, arahkan ketempat atau sasaran yang akan difogging. Kemudian kran larutan insektisida dibuka, asap akan menyembur keluar dari moncong mesin fogging. f. Jika target pekerjaan sudah selesai, kran larutan insektisida ditutup kembali, hingga asap tidak menyembur keluar dari moncong mesin. Matikan mesin dengan cara menutup keran bahan bakar. 2. Jet Sprayer a. Hidupkan tombol on / off. b. Tariik tali untuk menghidupkan jet sprayer. c. Pasang nozzle yang diinginkan (sesuai dengan keperluan). d. Masukkan pipa pengaduk dan penyedot kedalam gentong air. e. Semprot (atur sesuai dengan jangkauan yang diinginkan). 3) Cara Kerja Mesin Fogging 1. Pendahuluan a. Sebelum menghidupkan mesin untuk pertama kali, bacalah ketentuan – ketentuan peraturan keamanan dan pelajari petunjuk pemakaian. b. Buatlah rencana kerja untuk diluar dan didalam ruangan seefisien mungkin. 84



c. Diluar ruangan pengasapan dilakukan searah dengan arah angina. Sedangkan didalam ruangan, pengasapan dimulai dari ruangan yang paling dalam kemudian pindah keruangan terakhir. d. Laruta bahan kimia yang dipakai jangan lebih dari dosis yang dibutuhkan, sisanya buanglah ditempat yang aman, supaya tidak mencemari lingkungan menurut ketentuan Undang – Undang yang berlaku. 2. Persiapan penggunaan thermal fogger (Pancaran mengaburkan ayunan yang berkenaan dengan panas) Alat ini digunakan untuk pengasapan pada tempat yang tidak terjangkau oleh sprayer misalnya : lorong – lorong, got tertutup, semak belukar, besemant, STP, dan sejenisnya. a. Peralatan : -



Mesin thermal fogger



-



Topi



-



Masker



-



Ear plug



-



Goggles



-



Sarung tangan



-



Gelas ukur



b. Bahan Kimia : -



Zeta cypermetrin



-



Permetrin



-



Malation



-



Sipermetrin



-



Solar



85



Gambar 1. Mesin Fogging 4) Beberapa hal penting untuk diperhatikan dalam mengoprasikan jet thermal foger 1. Periksa kondisi mesin fogging secara menyeluruh, yaitu busi, batere, koil, pastikan bensin murni yang digunakan 2. Untuk mesin fogging yang system pengapiannya non otomatis. System pengapiannya bisa dicek dengan menekan tombol starter, apabila terdengar bunyi deru……br….rr…rr….berarti koil pengapiannya dalam kondisi baik. 3. Isi tangka bahan bakar dengan bensin murni sampai penuh dengan menggunakan corong saringan supaya kotoran tidak masuk ketangki bensin, tutup dengan rapat. 4. Masukkan chemical / bahan kimia sesuai dosis yang dianjurkan kedalam galon kosong dan tuang solar, larutkan jadi satu tutup gallon rapat – rapat lalu kocok hingga menyatu, tuang larutan yang sudah siap pakai kedalam tangka mesin fogging dan tutup rapat – rapat tangka fogging. 5. Hidupkan mesin fogging dengan cara : 



Tutup saluran bahan kimia







Buka saluran bensin







Untuk fogging non otomatis tekan tombol pengapian sambal memompa tuas pompa







Untuk fogging otomatis langsung pompa tuas pompa dan dimulai secara perlahan – lahan







Untuk fogging otomatis langsung tombol starter 86



6. Setelah mesin hidup biarkan sesaat untuk pemanasan 7. Untuk mengatur banyak sedikitnya asap dilakukan dengan cara mengatur bukaan kran saluran bahan kimia. 8. Setelah satu menit pemanasan buka saluran larutan bahan kimia dan siap untuk melakukan treatment. 9. Untuk mematikan mesin pada saat selesai treatment dilakukan dengan cara : tutup saluran bahan kimia, tunggu sampai tidak ada lagi asap yang keluar, setelah itu tutup saluran bensin dan tunggu sampai mesinnya berhenti. 10. Pada saat selesai treatment segera buang tekanan angina yang ada ditangki bensin dan tangka kimia dengan cara membuka penutupnya, setelah itu kencangkan kembali. 5) Pencegahan Kecelakaan 1. Taatilah petunjuk – petunjuk pemakaian konsentrasi larutan bahan kimia dari distributornya 2. Pakailah alat pelindung muka bila pengasapan menggunakan bahan – bahan kimia yang berbahaya 3. Pengasapan didalam ruangan tertutup seperti gudang – gudang bahan makanan, umumnya digunakan pelindung muka lengkap, dengan saringan kombinasi untuk gas dan debu. 4. Pengasapan dengan larutan bahan kimia yang sangat pekat dan berbahaya, pakailah alat pelindung lengkap untuk muka dan pernafasan berikut pakaian pelindung dengan tutup kepala dan sarung tangan. 5. Kunci ruangan penyimpanan barang – barang yang tidak berguna yang telah diasapi. Boleh masuk bila asap telah hilang atau bila memakai alat pelindung pernafasan. 6. Sebelum masuk kedalam ruangan yang telah dilakukan pengasapan, pastikan udara didalam ruangan telah bersih dan sirkulasinya telah sempurna. 7. Dianjurkan memakai alat penutup kuping terhadap suara bising dari mesin 8. Perintahkan operator untuk mentaati ketentuan – ketentuan keamanan sebelum mereka memulai bekerja menggunakan mesin 9. Dianjurkan untuk memeriksakan mesin setiap tahun kepada teknisi yang betul – betul menguasai mesin tersebut 10. Mesin tidak boleh dijalankan tanpa ada pengawasan



87



11. Jangan memperbaiki mesin yang sedang hidup, matikan dahulu, kemudian tunggu sampai mesinnya menjadi dingin 12. Setelah mesin diperbaiki, yakinkan bahwa peralatan mesin seperti pelindung panas telah terpasang kembali 13. Bila menggunakan larutan bahan kimia yang mudah terbakar didalam ruangan, harus dihindari, jangan sampai menimbulka nyala api pada waktu pengasapan B. PENGABUTAN (ULV) Space spraying system dingin dikenal juga sebagai system ULV, Cold aerosols and mists. Ultra Low volume (ULV) dimaksudkan sebagai space spraying dengan menggunakan racun serangga yang seefisien mungkin, untuk area yang luas dan tetap efektif terhadap vector. Oleh sebab itu pada ULV dipergunakan insektisida dalam konsentrasi yang biasanya cukup tinggi (lebih dari 20%)dengan jangkauan semburan fog yang cukup luas, idealnya 80-100 meter. Vmd dropet size untuk ULV cold aerosolt dan mists adalah: Vmd aerosols : 15-50u dan Vmd mists : 50-100u 1) Bahan Insektisida Sesuai dengan perkembangan teknologi dibidang pembuatan insektisida kimia dan mesin sprayer, untuk ULV cold spraying digunakan insektisida golongan organophosphate, carbamat atau syntetic pyrethroid dalam formulasi konsentrasi yang lebih tinggi dibanding untuk pemakaian pada thermal fogging. Dibawah ini beberapa jenis insektisida yang dipergunakan dalam ULV space spraying dan thermal fogging yang biasa digunakan oleh program pengendalian dan tidak tertutup penggunaan insektisida lain dimasa yang akan datang, yang efektif dan efisien. Out put fog: 5,3 – 7,6 liter/jam atau 10 – 15 ha/jam. Sasaran fogging adalah serangga yang sedang terbang, sehingga fogging harus meliputi seluruh target area yang terdiri dari indoor dan outdoor. Fogging dilakukan dari luar/pinggir jalan semua pintu dan jendela rumah/bangunan harus dibuka lebar. Waktu operasi pada pagi atau sore hari dalam keadaan udara tidak terlalu panas/kurang dari 28o C dan angin cukup tenang, maximum kecepatan angin 20km/jam. Kecepatan jalan kendaraan pengangkut ULV sprayer adalah 5-8 km/jam Beberapa tes menunjukkan bahwa jarak sembur yang paling baik adalah 80-100 meter dangan kecepatan angin 10-15 km/jam. Pada kecepatan angin lebih dari 20 km/jam fogging supaya dihentikan saja. Arah nozzle head; untuk mendekati jarak sembur yang ideal, selain nozzle head harus searah dengan arah angin, juga harus membentuk sudut 88



dengan permukaan tanah yang besarnya tergantung dengan kecepatan angin pada saat operasional berjalan. Pada kecepatan angin 0-10 km/jam, besar sudut nozzle head adalah 15o , pada kecepatan angin 10-15 km/jam besar sudut nozzle head adalah 5 o dan pada kecepatan angin 15-20 km/ jam, besar sudut nozzle head adalah 0 o (sejajar permukaan tanah). Tabel 1: INSEKTISIDA YANG COCOK UNTUK PENGASAPAN



Jumlah petugas yang melayani 1 unti ULV ground sprayer mounted adalah 3 orang, terdiri dari 1 petugas penunjuk arah, 1 petugas operasional dan 1 orang pengemudi. 2) Out put petugas Dengan out put area 10-15 ha/jam, apabila fogging berjalan selama 3 jam (pk 07.00 s/d 10.00) maka dapat mencakup daerah seluas 30-40 ha. Hal ini jauh lebih efisien dibanding dengan menggunakan portable thermal machine yang hanya mampu menyelesaikan daerah seluas 1 ha perpetugas. 3) Efek kabut ULV cold aerosol terhadap organisme non target: Dengan dosis maksimum 500ml malathion 96% atau penitrition 95% per ha, kabut ULV cold aerosols dalam udara bebas selama 15-30 menit tidak berbahaya bagi manusia, mamalia lain dan burung, kecuali pada ikan yang berumur muda (benih ikan) Beberapa keuntungan ULV ground spraying application dibanding thermal fogging yaitu: 1. Polusi udara lebih kecil. Untuk target area dan efektifitas yang sama penggunaan insektisida (dosis) dapat lebih kecil dibanding operasional thermal foging (dapat sampai 50%nya). 89



2. Mengurangi bahaya terhadap organisme bukan target. 3. Tidak ada bahaya kebakaran, karena ULV tidak memerlukan dorongan gas yang panas 4. Tidak memberi dampak gangguan pada kesibukan kota dan keramaian lalu lintas, karena fog ULV tidak mengganggu pengelihatan bila dibanding dengan thermal fog 5. Biaya operasional dan penggunaan bahan-bahan lebih sedikit (efisien), namun memberi dampak bila langsung mengenai cat minyak pada kayu dan cat mobil pada jarak 3 meter, maka yang disemprot hanya setinggi 3 meter. c. Pindu dan jendela yang membuka ke dalam kedua permukaan harus disemprot. Bila membukanya keluar, yang disemprot hanya bagian dalammnya saja. d. Perabot dalam rumah seperti meja, tempat tidur dan kursi harus disemprot bagian bawahnya. Sedangkan lemari disemprot bagian belakang dan bawahnya. e. Rumah panggung yang tingginya dari permukaan tanah lebih dari 1 meter dan ada ruang di bawahnya maka bagian bawah rumah tersebut harus disemprot. f. Ruang/ bangunan yang mempunyai teras yang biasanya digunakan untuk dudukduduk di malam hari, dinding dan langit-langitnya setinggi 3 meter harus juga disemprot. g. Bagian atap yang menonjol di kanan dan kiri rumah, kadang-kadang juga di bagian belakang yang tingginya kurang dari 3 meter harus disemprot pula. Perhatian : - Permukaan atau dinding yang terbuat dari kaca tidak perlu disemprot karena nyamuk tidak suka hinggap di sana karena licin. 3. Pemenuhan Dosis (Sufficiency) Dosis racun serangga yang dipakai harus tepat terpanuhi yakni : a. Bendiocarb (Ficam) 80 WP dosis 0,2 g/m2, atau berkisar : 0,18 – 0,22 g/ m2. b. Lamdasihalotrin (Icon) 80 WP dosis 0,025 g/m2, atau berkisar:0,0225 – 0,0275g/ m2. c. Deltametrin (K-Othrine) 5 WP 0,2 g/m2, atau berkisar : 0,18 – 0,22 g/ m2. d. Etofenproks (Vectron) 20 WP dosis 0,1 g/m2, atau berkisar : 0,9 – 0,11 g/ m2. 4. Keteraturan (Regularity) Waktu pelaksanaan penyemprotan harus tepat, sesuai dengan data hasil pengamatan vektor. Penyemprotan dilakukan 1 bulan sebelum puncak kepadatan vektor. Bila dalam satu tahun puncak kepadatan vektor dua kali, maka hendaknya penyemprotan dilakukan dua kali dalam satu tahun.



98



Bila musim kepadat vektor belum diketahui, maka waktu pelaksanaan penyemprotan adalah 2 bulan sebelum puncak median penderita positif/ klinis berdasarkan data 3 – 5 tahun terakhir di Puskesmas atau kelompok desa yang tipe epidemiologinya sama. 5) Langkah-langkah yang Perlu Dilakukan dalam Melaksanakan Penyemprotan 1. Sebelum Penyemprotan a. Membuat rencana kerja penyemprotan. b. Mengirimkan rencana penyemprotan kepada kepala desa minimal 3 hari sebelum penyemprotan. c. Memberitahuan jadwal penyemprotan kepada pemilik rumah sekaligus mengadakan penyuluhan. d. Mempersiapkan alat/ bahan yang akan digunakan dalam melaksanakan penyemprotan yang meliputi : 1) Bahan-bahan berupa racun serangga yang akan digunakan dan air sebagai pelarut. 2) Peralatan a) Peralatan penyemprotan berupa : 



Spraycan harus dalam keadaan baik dan bersih.







Ember isi 10 liter 1 buah.







Corong dengan saringan 1 buah.







Pengaduk yang salah satu ujungnya berbentuk pipih 1 buah.







Tas racun serangga







Kain pel 2 buah



b) Peralatan penyemprot : Untuk tiap penyemprot dilengkapi dengan peralatan 1 set yang terdiri dari : 



Pakaian kerja 2 stel.







Alat penutup hidung/ masker 1 set.







Topi bertepi lebar (menutup bahu) 1 buah.







Topeng plastik (face shield) 1 buah 1 buah.







Sepatu lars 1 stel.







Sabun secukupnya.



c) Alat tulis menulis termasuk formulir-formulir pelaporan. 2. Pada Hari Penyemprotan a. Minta bantuan pemilik rumah untuk menutup makanan/ minuman bila perlu supaya dikeluarkan saja. 99



b. Perabot rumah tangga seperti kasur, bantal, selimut dan pakaian-pakaian yang bergelantungan supaya dikeluarkan dulu. Demikian pula bila ada burung, aquarium dan lain-lain. c. Bila akan menyemprot kandang, terlebih dahulu binatangnya harus dikeluarkan. 3. Selama Penyemprotan a. Semprot permukaan dinding searah dengan jarum jam dimulai dari pintu masuk. b. Tutuplah pintu dan jendela ruangan yang sedang disemprot tapi bukalah jendela dan pintu lain agar penyemprot tidak bekerja di ruang tertutup. 4. Sesudah Penyemprotan a. Beritahukan kepada pemilik rumah agar racun serangga yang menempel di dinding tidak dihapus. b. Kaca-kaca dan lantai yang terkena racun serangga boleh dibersihkan dan racun serangga hasil pembersihan harus ditanam. c. Supaya diberitahukan kepada pemilik rumah agar selama enam bulan berikutnya jangan dulu mengapur dinding. d. Spray can dan peralatan lainnya supaya dibersihakan. Hati-hati membuang air bekas membersihkan spray can dan alat-alat lainnya jangan sampai mencemari kolam ikan dan sumber air penduduk. e. Penghuni rumah baru boleh masuk ke dalam rumah satu jam setelah penyemprotan selesai. f. Bila ada serangga yang mati setelah penyemprotan agar disapu dan dikumpulkan kemudian dikubur. 6) Evaluasi Penyemprotan Rumah Evaluasi atau penilaian penyemprotan dilakukan untuk mengetahui kualitas dan dampak hasil penyemprotan. 1. Evaluasi kualitas penyemprotan a. Cakupan Bangunan (Coverage). Yang dimaksud dengan cakupan bangunan adalah proporsi antara jumlah rumah yang disemprot dengan jumlah rumah yang ada. Cakupan dianggap baik bila mencapai > 80%. b. Cakupan Permukaan (Completeness).



100



Yang dimaksud dengan cakupan permukaan adalah proporsi antara luas permukaan dinding yang disemprot dengan jumlah luas permukaan dinding yang seharusnya di dinding. c. Pemenuhan dosis (Sufficiency) Yang dimaksud pemenuhan dosis adalah jumlah racun serangga (bahan aktif) yang menempel pada permukaan dinding dalam satuan gram per meter persegi. Hal ini diketahui dengan cara membagi jumlah racun serangga yang dipakai (berdasarkan laporan P-IRS) dengan hasil perkalian antara jumlah rumah yang disemprot dengan rata-rata luas rumah (dari hasil GR). Untuk Bendiocarb hasilnya dikalikan dengan 80%. Dosis dikatakan baik bila berkisar antara 0,18 – 0,22 gr/ m2. d. Keteraturan (Regularity) Yang dimaksud dengan keteraturan adalah ketepatan waktu penyemprotan dan selang waktu antara penyemprotan pertama dengan penyemprotan selanjutnya pada lokasi yang sama.



2. Evaluasi terhadap dampak hasil penyemprotan a. Dengan cara membandingkan angka kepadatan dan Parity Rate vektor sebelum dan sesudah penyemprotan. Penyemprotan dikatakan berhasil menurunkan tingkat penularan, bila terjadi penurunan angka kepadatan dan Parity Rate yang nyata sesudah penyemprotan. b. Dengan cara membandingkan angka Parasite Rate (PR) hasil SME secara serial. Penyemprotan diaktakan berhasil menekan angka Parasite Rate bila setelah penyemprotan 3 tahun beturut-turut (6 siklus) angka PR-nya menjadi kurang dari 2%.



101



3. PENUTUP A. Kesimpulan -



Teknik pengunaan alat untuk pengendalian vektor yang menggunakan insektisida terdiri dari pengendalian vektor dengan fogging, ULV (Ultra Low Volume) dan IRS (Indoor Residual Spraying)



-



Pengendalian vektor dengan fogging dimana teknik fogging ini digunakan untuk pengendalian nyamuk dewasa terutama kasus demam berdarah yang berupa asap dan menggunakan insektisida yaitu malathion



-



Pengendalian vektor dengan ULV (Ultra Low Volume) digunakan untuk pengendalian nyamuk dewasa yang berupa pengkabutan menggunakan insektisisda yaitu malathion



-



Pengendalian vektor dengan IRS (Indoor Residual Spraying) digunakan untuk pengendalian nyamuk dewasa terutama kasus malaria yang berupa penyemprotan di dinding rumah dengan menggunakan insektisida Bendiocarbd dll.



B. Saran Petugas yang melakukan pengendalian vektor yang menggunakan insektisida diharapkan dapat memperhatikan langkah – langkah pengerjaan dengan baik agar hasil yang dilakukan dapat maksimal dan juga petugas harus menggunakan APD selama melakukan kegiatan.



102



4. DAFTAR PUSTAKA



Soemirat Slamet, Juli.2009. Kesehatan Lingkungan.Yogyakarta : Gajah Mada University Press. Hestiningsih, Retno. 2018. Praktikum Pengendalian Vektor. Semarang : FKM UNDIP Press. Direktorat Jenderal Pengendalian Penyakit dan Penyehatan Lingkungan. 2012. Pedoman penggunaan insektisida (pestisida) dalam pengendalian vektor. Jakarta : Kementerian Kesehatan RI.



103



5.



DOKUMENTASI PRAKTIKUM



104