Rizky Ariska Ningsih - 1801072 - Tugas Instrumen [PDF]

Citation preview

TUGAS INDIVIDU INSTRUMEN ANALISIS FARMASI



“MATERI INSTRUMEN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)”



OLEH NAMA



: RIZKY ARISKA NINGSIH



NIM



: 1801072



DOSEN PENGAMPU: Apt. RAHMA DONA, M.Si



PROGRAM STUDI S1 FARMASI



SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI RIAU



YAYASAN UNIV RIAU



2021



A. INSTRUMENTASI KCKT Komponen utama dalam KCKT adalah juga komponen dalam kromatografi lainnya yaitu wadah/kemasan fase gerak, fase gerak, pompa KCKT, kolom, fase diam, detektor, dan perangkat komponen pendukung lainnya. 1. Wadah Fase Gerak Wadah fase gerak dalam KCKT harus terbuat dari bahan yang bersih dan inert. Wadah ini dapat menampung sekurang-kurangnya 1-2 liter fase gerak, dan terlebih dahulu harus dibebasgaskan. Kehadiran gas dalam wadah fase gerak ini akan menimbulkan gelembung gas pada pompa dan detektor yang akan sangat mengacaukan hasil analisis. 2. Fase Gerak Fase gerak dalam KCKT harus berupa pelarut, buffer, ataupun reagen dengan tingkat kemurnian yang sangat tinggi, yaitu suatu cairan yang berderajat KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam fase gerak akan menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Partikel-partikel kecil yang terdapat dalam fase gerak yang kurang murni dapat mengakibatkan kekosongan kolom KCKT. Fase gerak atau dikenal juga dengan istilah eluen umumnya merupakan campuran pelarut yang berperan dalam daya elusi dan resolusi analisis. Daya elusi dan resolusi KCKT ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat-sifat komponen dalam sampel. Secara umum ada 2 tipe fase gerak: a.



Fase gerak/eluen isokratik, yaitu eluen dengan komposisi pelarut yang tidak berubah selama percobaan kromatografi.



b.



Fase gerak/eluen gradien, yaitu fase gerak dengan komposisi pelarut yang berubah selama masa kromatografi. Ada begitu banyak pilihan fase gerak yang dapat digunakan serta kemungkinan gradiennya akan menghasilkan kesempatan untuk mengoptimalkan pemisahan-pemisahan campuran kompleks dari segi resolusi maupun waktu. Secara normal elusi isokratik akan lebih mudah dikerjakan daripada elusi gradien.



Seringkali campuran pelarut merupakan fase gerak yang lebih baik daripada cairan murni, namun pekerjaan optimasi berbagai komposisi pelarut untuk fase gerak secara coba-coba tentu tidak mudah dilakukan. Berdasarkan kepolaran fase gerak dibandingkan fase diamnya, fase gerak dibedakan menjadi: a. Fase normal, yaitu fase diam lebih polar dari fase gerak. Kemampuan elusinya akan meningkat seiring peningkatan polaritas fase gerak. b. Fase terbalik, yaitu bila fase diam kurang polar dibanding fase geraknya. Kemampuan elusi akan menurun seiring peningkatan kepolaran fase geraknya. Dalam KCKT dengan fase terbalik, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran larutan buffer-metanol atau campuran air-asetonitril. Sedangkan dalam fase normal sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut terklorinasi atau menggunakan pelarut jenis-jenis alkohol. 3. Pompa Pompa KCKT harus terbuat dari bahan yag inert terhadap fase gerak. Bahan pompa dapat terbuat dari: gelas, baja tahan karat, teflon maupun batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan hingga 5000 psi dan mamp mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 3 ml/menit. Untuk keperluan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan hingga 20 ml/menit. Ada 2 tipe pompa: a. Pompa dengan tekanan konstan b. Pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Pompa tipe ini lebih umum digunakan. 4. Kolom Ada 2 jenis kolom pada KCKT, yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Untuk mengetahui perbedaan kolom konvensional dan kolom mikrobor klik disini.



Dalam beberapa hal kolom mikrobor lebih menguntungkan, diantaranya: a.



Kolom mikrobor mengkonsumsi fase gerak hanya 80% dari konsumsi kolom konvensional. Hal ini disebabkan karena kolom mikrobor mempunyai kecepatan alir yang lebih lambat (10-100 ul/menit).



b.



Aliran fase gerak pada mikrobor yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal untuk digabungkan dengan spektrometer massa.



c.



Sensitivitas kolom mikrobor lebih tinggi karena pelarut yang lebih pekat, sehingga cocok digunakan dalam analisis sampel berskala kecil, seperti sampel klinis.



5. Detektor Detektor KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu detektor yang bersifat universal, yaitu detektor yang dapat mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif. Contoh detektor yang bersifat universal adalah detektor indeks bias dan spektrometri massa. Dan jenis detektor lainnya adalah detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, fluoresensi dan elektrokimia. Detektor yang ideal akan mempunyai karakteristik berikut: 1. Mempunyai respon terhadap analit yang cepat dan reproduksible 2. Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi analit pada kadar yang sangat kecil 3. Stabil dalam pengoperasiannya 4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Untuk kolom konvensional 8 ul atau lebih kecil dan 1 ul atau lebih kecil pada kolom mikrobar. 5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada kisaran yang luas 6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak Detektor merupakan bagian integral dari peralatan analitik kromatografi cair ini. Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada persyaratan sensitivitas, jenis senyawa yang ada dalam sampel, dan faktor-faktor lain seperti biaya. Detektor yang paling umum didasarkan pada indeks bias



dari eluat kolom, karena hampir semua zat terlarut akan menghasilkan larutan dengan indeks bias yang berbeda dengan indeks bias pelarut murni. Detektor ini mampu menginderai perbedaan tersebut dan menghasilkan sinyal-sinyal listrik yang proporsional yang kemudian diperkuat dan direkam untuk menghasilkan kromatogram. Batasan utamanya adalah sensitivitas; batasan pendeteksian akan bervariasi sesuai dengan keadaan, yang umumnya sekitar satu mikrogram zat terlarut. a. Detektor Spektrofotometri Deteksi spektrofotometri umumnya hanya dalam daerah ultraviolet. Idealnya, spektrofometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik. b. Detektor fluorometri Merupakan detektor yang didasarkan atas fluoresens. c. Detektor elektrokimia Lazimnya, larutan efluen dari dalam kolom memasuki sebuah sel dimana larutan tersebut mengalir diatas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada satu harga, dimana komponen-komponen sampel mengalami reaksi transfer elektron. 6. Perangkat Pendukung Lainnya Perangkat pendukung lain yang digunakan dalam KCKT dapat berupa komputer, integrator dan rekorder.



B. KELEBIHAN KCKT Berikut merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain: 1. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi. 2. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi kerusakan bahan analisis. 3. Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi. 4. Kolom dapat digunakan kembali. 5. Waktu analisa cukup singkat.



6. HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil. 7. Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya. 8. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.



C. KEKURANGAN KCKT Kelemahan dari alat HPLC antara lain: 1. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu 2. Hanya bisa digunakan untuk asam organik 3. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi 4. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas.



D. CARA PENGOPERASIAN KCKT Persiapan Awal Sebelum Menggunakan HPLC Berikut ini tahapan awal yang perlu dilakukan, sebelum menggunakan HPLC : 1. Lakukan persiapan sampel yang yang akan dianalisa, pastikan jumlahnya sesuai dan pengguna mengerti metode apa yang perlu digunakan. 2. Lakukan pengecekan kabel ke sumber daya (listrik). Pastikan setiap kabel sudah terhubung, baik komputer ke listrik, instrumen ke listrik atau komputer ke instrumen. 3. Jika dirasa tegangan listrik tidak stabil, disarankan menggunakan stabilizer untuk memastikan sumber daya stabil. 4. Nyalakan komputer dan setiap modul pada alat HPLC. Perhatikan setiap modul dan komputer apakah menyala dengan baik. Jika terdapat modul atau komputer tidak menyala, lakukan pengecekan kabel yang terhubung ke sumber daya. 5. Saat merasa sudah menyalakan instrument sesuai prosedur, tetapi tidak menyala, jangan menekan tombol power berulang kali dan segera hubungi teknisi laboratorium. 6. Buka atau double click ikon software HPLC yang ada di komputer. Lakukan pengecekan sederhana, apakah instrumen dan komputer sudah saling terhubung dan



bisa berkomunikasi. Pada beberapa kasus, jika instrumen sudah terhubung dengan komputer ditandai dengan bunyi beep pada instrumen. Pengoperasian HPLC Dengan Sampel Berikut ini adalah tahapan cara mengguna HPLC secara global : 1. Perhatikan pipa atau selang outlet sudah terletak pada penampung yang benar. Karena ini penting untuk menampung limbah proses analisa. 2. Fokus ke software yang ada di komputer. Sebelum dan setelah menggunakan alat laboratorium ini, diharapkan pengguna melakukan flush atau purge atau pencucian kolom agar kondisi kolom selalu dalam keadaan bersih dan tidak tersumbat. Pastikan membuka katup tekanan sebelum melakukan pembersihan kolom. 3. Pastikan larutan yang digunakan untuk fase gerak tersedia dalam jumlah yang cukup. Beberapa jenis larutan yang digunakan diantaranya adalah : Asetonitril, Metanol atau Aquabidest. 4. Lakukan setting method pada software HPLC. Pada tahap ini pengguna diminta untuk melakukan setting detail mengenai aplikasi, komposisi dan waktu injeksi. Jika sebelumnya sudah memiliki method, gunakan saja yang sudah ada. 5. Operasikan instrumen untuk mendapatkan base line yang stabil. Jika belum dapat, perhatikan langkah-langkah sebelumnya. Jika diantara pengguna masih pemula, mintalah seseorang yang lebih ahli untuk membantu dalam hal ini. 6. Pastikan tidak terdapat gelembung pada cairan fase gerak. Salah satu hal yang membuat base line menjadi tidak stabil adalah adanya gelembung. Beberapa jenis HPLC biasanya dilengkapi dengan degasser. 7. Setelah base line diperoleh, pengguna bisa mulai memasukan sampel. Dengan cara injeksi manual atau auto sampler, tergantung konfigurasi dari alatnya. Kelebihan menggunakan auto sampler yaitu lebih otomatis dan presisi. 8. Detektor akan menangkap data dari sampel dan menampilkannya di software. Pada beberapa kasus mungkin saja ditemukan puncak ganda, dan belum langsung menemukan puncak tunggal pada kromatogram. Lakukan optimasi jika diperlukan. 9. Simpan atau cetak hasil pengukuran.



Tahapan Setelah Penggunaan HPLC Beberapa hal yang perlu diperhatikan setelah menggunakan alat laboratoriu ini adalah : 1.



Keluarkan vial dari auto sampler.



2.



Lakukan flush atau membersihkan kolom.



3.



Matikan instrumen sesuai dengan alur yang ditetapkan. Jika perlu melakukan disconnecting instrument, lakukan itu terlebih dahulu sebelum menonaktifkan switch power.



4.



Matikan komputer dan cabut sumber daya, jika tidak digunakan dalam waktu lama.



5.



Tutup HPLC dengan cover atau case lainnya untuk mencegah debu dan kotoran menempel.



E. KESALAHAN/MASALAH DALAM PENGOPERASIAN KCKT Kesalahan 1. Alat HPLC belum terkalibrasi HPLC merupakan alat instrumen yang harus dikalibrasi dikarenakan HPLC memiliki masa dimana akan menunjukkan hasil yang tidak optimal. Kalibrasi perlu dilakukan supaya tidak didapatkan penyimpangan yang dapat menimbulkan nilai koreksi pada alat. 2. Dalam pengoperasian belum memiliki kompetensi yang cukup Kompetensi analis yang menggunakan HPLC harus diperhatikan dengan lebih baik, karena jika analis tidak mempunyai cukup pengetahuan tentang HPLC dan tidak memiliki kompetensi dalam penggunaan HPLC maka analisa menjadi tidak akurat dan alat kemungkinan menjadi cepat rusak. 3. Modifikasi data dan proses oleh analis Terkadang muncul puncak yang tidak diharapkan yang biasanya muncul dari pengotor. Hal ini terkadang membuat para analis memodifikasi hasil analisa supaya mendapatkan hasil yang bagus. Tindakan seperti ini merupakan kesalahan yang fatal karena memodifikasi adalah yang tidak boleh dilakukan sama sekali oleh analis



4. HPLC tidak menggunakan UPS Ketidakstabilan arus listrik dapat menyebabkan instrumentasi HPLC cepat rusak dan tidak membaca hasil dengan optimal. Salah satu pencegahan agar HPLC mendapat



arus listrik yang stabil adalah dengan penggunaan UPS. UPS dapat



menyerap sumber arus listrik dan membuatnya menjadi stabil saat masuk ke dalam instrumentasi HPLC. 5. Ruangan tidak terkondisikan dengan baik HPLC merupakan alat instrumentasi yang memiliki spesifikasi penyimpanan sendiri, yakni harus disimpan dalam suhu 20 oC ± 3oC dan kelembaban 45% – 65%. Oleh karena itu, kondisi laboratorium harus di monitor secara berkala agar HPLC tetap dalam kinerja yang baik. 6. Salah dalam penggunaan reagen saat preparasi sampel Analisa HPLC membutuhkan reagen dengan spesifikasi khusus. Penggunaan reagen dengan spesifikasi dibawah HPLC Grade akan menyebabkan analisa berjalan dengan tidak optimal. 7. Tidak menggunakan CRM CRM (Certified Refference Standard) merupakan salah satu standar induk yang memiliki ketertelusuran yang tinggi. Penggunaan CRM untuk memastikan akurasi dari hasil analisa yang didapat. Masalah Masalah Solusi Tekanan tidak terbaca, tidak ada aliran Sekring putus Ganti sekring Kegagalan pengontrol Verifikasi pengaturan yang tepat, perbaiki atau ganti pengontrol Piston rusak Ganti piston Udara terperangkap di kepala pompa Keluarkan udara dari pompa dan pompa utama Degas fase gerak Fase gerak tidak mencukupi Isi ulang reservoir, ganti frit saluran masuk jika tersumbat Katup periksa rusak Ganti katup periksa Kebocoran besar Kencangkan atau ganti alat kelengkapan Tekanan terbaca, aliran normal Meter transduser rusak Ganti meter



Tekanan yang salah Ganti transduser Tekanan balik tinggi/rendah Laju pengaturan aliran terlalu Sesuaikan laju aliran tinggi/rendah Kolom frit terblok Cuci kembali jika diperbolehkan, ganti frit sesuai dengan instruksi dan jaminan kondisi atau ganti kolom Kolom fase gerak yang tidak tepat, Gunakan fase gerak yang benar, cuci kolom buffer mengendap Kolom yang tidak tepat Gunakan kolom yang tepat Injektor tersumbat Hilangkan sumbatan atau ganti injektor Suhu kolom terlalu tinggi/rendah Sesuaikan suhu Pengontrol rusak Perbaiki atau ganti pengontrol Kolom penjaga yang diblokir Hapus / ganti kolom penjaga Filter in-line yang diblokir Hapus / ganti filter in-line Kebocoran dalam sistem Perbaiki kebocoran Tekanan berputar Udara terpompa Degas Solvent dari pompa Degassing yang tidak memadai Degas solvent atau ubah metode degassing (mis. menggunakan Degasser Vakum) Menggunakan elusi gradien Perputaran tekanan normal karena perubahan viskositas Puncak berekor Frit yang diblokir Mencuci kolom kembali (jika diperbolehkan) atau mengganti frit (jika diizinkan) atau mengganti kolom Kolom kosong Isi kekosongan Interferensi puncak Gunakan kolom yang lebih panjang atau ubah fase gerak dan/atau selektivitas kolom pH fase gerak salah Sesuaikan pH. Untuk senyawa basa, pH yang lebih rendah biasanya memberikan puncak yang lebih simetris Sampel bereaksi dengan sisi aktif Tambahkan reagen pasangan ion atau tambahkan volatile basic modifier atau ubah kolom Puncak menghadap ke depan Suhu rendah Tingkatkan suhu kolom Pelarut sampel yang salah Gunakan fase gerak untuk pelarut injeksi Sampel kelebihan berat Kurangi konsentrasi sampel Kolom yang buruk Cuci ulang kolom (jika diperbolehkan) atau ganti inlet frit (jika diperbolehkan) atau ganti kolom Tekanan berfluktuasi Lihat bagian tekanan punggung tinggi Tekanan turun, tetapi tidak ke nol. Lihat bagian tekanan rendah Tekanan turun ke nol Lihat bagian yang tidak ada tekanan terbaca, tidak ada aliran dan tidak ada tekanan membaca, aliran normal



SOAL 1. Fase yang terjadi apabila bila fase diam kurang polar dibanding fase geraknya disebut…. a. Fase linier b. Fase normal c. Fase terbalik d. Stationer phase e. Mobile phase



2. Berikut keuntungan kolom mikrobor pada KCKT adalah, kecuali…. a. Kolom mikrobor cocok digunakan dalam analisis sampel berskala kecil b. Kolom mikrobor lebih ideal untuk digabungkan dengan spektrometer massa c. Kolom mikrobor lebih sedikit mengkonsumsi fase gerak d. Kolom mikrobor memiliki kecepatan aliran yang lambat e. Kolom mikrobor memiliki sensitivitas lebih tinggi karena pelarutnya tidak pekat



3. Dalam KCKT dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah…. a. Campuran air-asetonitril b. Campuran larutan buffer-metanol c. Campuran larutan etilasetat-hidrokarbon d. Campuran pelarut-pelarut hidrokarbon-pelarut terklorinasi e. Campuran pelarut-pelarut nonhidrokarbon 4. Contoh detektor yang dapat mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif adalah…. a. Detektor elektrokimia b. Detektor fluoresensi c. Detektor indeks bias d. Detektor MCT e. Detektor UV-Vis



5. Salah satu hal yang membuat base line menjadi tidak stabil adalah…. a. Adanya degasser pada beberapa jenis HPLC b. Adanya gelembung pada fase gerak c. Dilakukannya flush atau purge d. Larutan yang digunakan untuk fase gerak tidak tersedia dalam jumlah yang cukup e. Pipa atau selang outlet sudah terletak pada penampung yang benar



6. Dilakukan pencucian kolom agar kondisi kolom selalu dalam keadaan bersih dan tidak tersumbat. Pencucian kolom disebut dengan istilah…. a. Auto sampler b. Base line c. Degasser d. Flush e. Setting method



7. Kelebihan metode memasukkan sampel dengan auto sampler adalah sebagai berikut…. a. Lebih murah b. Lebih otomatis dan presisi c. Memerlukan jarum suntik d. Semua benar e. Semua salah



8. Berikut adalah kekurangan dari instrumentasi KCKT…. a. Adanya degasser pada beberapa jenis KCKT dapat menyebabkan base line tidak stabil b. Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang rendah c. Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya d. Hanya bisa digunakan untuk asam organik e. Kolom dapat digunakan berulang



9. Di bawah ini yang bukan merupakan solusi jika sampel bereaksi dengan sisi aktif adalah…. a. Tambahkan reagen pasangan ion b. Tambahkan volatile basic modifier c. Ubah kolom d. Ganti kolom e. Ganti sampel



10. Instrumentasi KCKT yang harus terbuat dari bahan yag inert terhadap fase gerak adalah…. a. Detektor b. Fase gerak c. Kolom d. Pompa e. Rekorder