Fitokimia KCV [PDF]

Citation preview

KROMATOGRAFI KOLOM CAIR VAKUM BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Indonesia memiliki kekayaan alam yang sangat melimpah, baik kekayaan flora maupun kekayaan faunanya. Tidak salah lagi bahwa di Indonesia terdapat banyak tumbuhan yang beraneka ragam lengkap dengan ciri khasnya masing-masing. Hal ini disebabkan Indonesia Indonesia terletak di garis khatulistiwa dengan iklim tropis, sehingga tanahnya subur dan cocok untuk berbagai macam jenis tanaman. Sebagian besar senyawa kimia ditemukan di alam dalam keadaan tidak murni. Biasanya, suatu senyawa kimia berada dalam keadaan tercampur dengan senyawa lain. Karena itu, diperlukan proses pemisahan untuk mendapatkan senyawa murni atau untuk menghilangkan pengotor yang dapat mengganggu dalam proses analisis. Ada beberapa metode sederhana yang dapat dilakukan untuk mengambil komponen berkhasiat ini, diantaranya dengan melakukan isolasi komponen kimia pada suatu sampel tanaman. Isolasi adalah pemisahan komponen kimia yang terdapat dalam suatu ekstrak. Pemisahan ini didasarkan pada sifat adsorsi dan partisi dari senyawa yang dipisahkan terhadap adsorben dan cairan pengelusi yang digunakan. Proses isolasi biasanya dilakukan dengan cara kromatografi. Kromatografi adalah sebuah teknik analisis yang digunakan untuk memisahkan



sebuah



campuran



atau



persenyawaan



kimia.



Jenis



kromatografi yang digunakan pada praktikum ini adalah kromatografi cair YAYU RAHMI RAMADANI SAPATI MUH. IKBAL 150 2012 0020



KROMATOGRAFI KOLOM CAIR VAKUM vakum yang merupakan suatu metode kromatografi kolom yang digunakan untuk memisahkan senyawa dalam jumlah yang lebih banyak. Prinsipnya yaitu adsorpsi dan partisi yang dipercepat bantuan pompa vakum. B. Maksud Percobaan Maksud dari dilakukannya praktikum ini adalah untuk memahami metode cara memisahkan campuran senyawa dari tanaman daun raja dengan menggunakan metode kromatografi cair vakum (KCV). C. Tujuan Percobaan Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah untuk memperoleh senyawa



dalam



fraksi



kasar



dari



tanaman



daun



raja



dengan



menggunakan metode kromatografi cair vakum (KCV) berdasarkan perbedaan eluen. D. Prinsip Percobaan Prinsip dari kromatografi cair vakum (KCV) adalah adsorpsi atau serapan, sedangkan pemisahannya didasarkan pada senyawa-senyawa yang akan dipisahkan terdistribusi diantara fase diam dan fase gerak dalam perbandingan berbeda-beda.



BAB II TINJAUAN PUSTAKA Teori Umum Istilah kromatografi mula-mula ditemukan oleh Michael Tswett (1908), seorang ahli botani Rusia. Nama kromatografi diambil dari bahasa YAYU RAHMI RAMADANI SAPATI MUH. IKBAL 150 2012 0020



KROMATOGRAFI KOLOM CAIR VAKUM Yunani (chromato= penulisan dan grafe = warna). Kromatografi berarti penulisan dengan warna. Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan fasa bergerak (mobile). Fasa diam dapat berupa zat padat atau zat cair, sedangkan fasa bergerak dapat berupa zat cair atau gas (Yazid, 2005). Kromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui suatu kolom, perbedaan kemampuan adsorpsi terhadap zat-zat yang sangat mirip mempengaruhi resolusi zat terlarut dan menghasilkan apa yang disebut kromatogram (Khopkar, 2008). Kromatografi Suction Column and Vacuum liquid chromatography (VLC) atau kromatografi cair vakum (KCV) adalah bentuk kromatografi kolom yang khususnya berguna untuk fraksinasi kasar yang cepat terhadap



suatu



ekstrak.



Kondisi



vakum



adalah



alternatif



untuk



mempercepat aliran fase gerak dari atas ke bawah. Metode ini sering digunakan untuk fraksinasi awal dari suatu ekstrak non-polar atau ekstrak semipolar (Raymond, 2006). Suction coloumn merupakan alat kromatografi yang merupakan modifikasi kromatografi kolom serapan. Prinsip pemisahan komponen kimia berdasarkan adsorpsi dan partisi serta dipercepat dengan isapan pompa vakum. Seperti halnya kromatografi kolom serapan, senyawa yang akan dipisahkan dilarutkan dengan pelarut yang cocok kemudian dimasukkan dalam kolom isap, selanjutnya ditambahkan eluen, eluen yang mengalir turun yang disebabkan oleh isapan pompa vakum. Hasil YAYU RAHMI RAMADANI SAPATI MUH. IKBAL 150 2012 0020



KROMATOGRAFI KOLOM CAIR VAKUM pemisahan ditampung dalam setiap fraksi. Volume penampungan 25 ml/fraksi dan untuk berat sampel q 10 - 30 gram volume penampungan 50 ml/fraksi. Adsorben yang digunakan sedikit lebih berbeda yaitu 35 gram silica gel 7733 dan 10 gram silika gel 7731 (Gritter, 1991). Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom, penjerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam atau bahkan tabung plastik. Pelarut (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah, dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom. Metode ini merupakan contoh kromatografi elusi karena linarut dielusi dari kolom (Sastrohamidjojo, 1985). Manfaat dari kromatografi ini yaitu menentukan ciri senyawa aktif penyebab efek racun atau efek yang bermanfaat, yang ditunjukkan oleh ekstrak tumbuhan kasar bila diuji dengan sistem biologi. Dalam hal ini kita harus memantau cara ekstraksi dan pemisahan pada setiap tahap, yaitu untuk melacak senyawa aktif tersebut sewaktu dimurnihkan. Kadangkadang keaktifan hilang selama proses fraksinasi akibat ketidakmantapan senyawa itu, dan akhirnya mungkin saja diperoleh senyawa berupa kristal tetapi keaktifan seperti yang ditunjukkan oleh ekstrak asal (Harborne, 1987).



YAYU RAHMI RAMADANI SAPATI MUH. IKBAL 150 2012 0020



KROMATOGRAFI KOLOM CAIR VAKUM Kromatografi Vakum Cair mempunyai keuntungan yang utama dibandingkan dengan kolom konvensional yaitu (Gritter, 1991): 1. Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil disbanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100 μl/menit). 2. Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spectrometer massa. 3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis. Fase diam yang digunakan dikemas dalam kolom yang digunakan dalam KCV. Proses penyiapan fase diam dalam kolom terbagi menjadi dua macam, yaitu (Sarker, 2006):



a. Cara Basah Preparasi fase diam dengan cara basah dilakukan dengan melarutkan fase diam dalam fase gerak yang akan digunakan. Campuran kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan dibuat merata. Fase gerak dibiarkan mengalir hingga terbentuk lapisan fase diam yang tetap dan rata, kemudian aliran dihentikan. Preparasi sampel cara basah dilakukan dengan melarutkan sampel dalam pelarut yang akan digunakan sebagai fasa gerak dalam KCV. Larutan dimasukkan dalam kolom kromatografi yang telah terisi fasa diam. Bagian atas dari sampel ditutupi kembali dengan fasa diam yang sama. YAYU RAHMI RAMADANI SAPATI MUH. IKBAL 150 2012 0020



KROMATOGRAFI KOLOM CAIR VAKUM b. Cara kering Preparasi fase diam dengan cara kering dilakukan dengan cara memasukkan fase diam yang digunakan ke dalam kolom kromatografi. Fase diam tersebut selanjutnya dibasahi dengan pelarut yang akan digunakan. Preparasi cara kering dilakukan dengan mencampurkan sampel dengan sebagian kecil fase diam yang akan digunakan hingga terbentuk serbuk. Campuran tersebut diletakkan dalam kolom yang telah terisi dengan fasa diam dan ditutup kembali dengan fase diam yang sama.



BAB III METODE KERJA A. Alat dan Bahan 1. Alat Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini, yaitu batang pengaduk, botol cokelat, cawan porselin, chamber, corong kaca, gelas kimia, gelas ukur, gunting, kolom kaca, sendok tanduk besi, statif dan klem, timbangan analitik, dan vial. 2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah air suling, aluminium foil, n-heksan , eluen, etil asetat,



kapas, karet,



kertas label, kertas saring, metanol, sampel daun raja, silika gel kasar dan halus, dan tissue. YAYU RAHMI RAMADANI SAPATI MUH. IKBAL 150 2012 0020



KROMATOGRAFI KOLOM CAIR VAKUM B. Cara Kerja 1. Penyiapan Kolom a. Dibersihkan kolom dan dibilas dengan metanol b. Dipasang kolom tegak lurus pada statif c. Dikemas fase diam didalam kolom dengan keadaan vakum, agar diperoleh kerapatan yang maksimum d. Dimasukkan adsorben silika gel G 60 sebanyak 100 gram (atau sesuai kapasitas kolom yang digunakan) ke dalam kolom dan dimampatkan. e. Diratakan permukaan adsorben dengan batang pengaduk f. Dialirkan n-heksan beberapa kali dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan yang maksimal. 2. Isoalasi Sampel a. Ditimbang fraksi sebanyak 1 gram (atau sesuai jumlah fase diam berdasarkan perbandingan 1:100) b. Dimasukkan silika gel dengan perbandingan 30:10 (kasar : halus), kemudian diratakan permukaannya c. Dimasukkan kertas saring untuk mencegah pengotor dalam cairan pengelusi d. Dimasukkan n-heksan untuk memampatkan silika yang ada didalam kolom e. Dimasukkan fraksi yang telah disuspensikan dengan silika gel kedalam kolom f. Ditambahkan cairan pengelusi dari kepolaran terendah n-heksan : etil asetat (10:0) melalui dinding kolom dan pompa vakum dijalankan hingga eluen turun dan mengelusi komponen kimia. g. Dilanjutkan dengan penyari yang kepolarannya lebih tinggi secara berturut-turut (9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, dan 0:10) h. Ditampung cairan sebagai fraksi.



YAYU RAHMI RAMADANI SAPATI MUH. IKBAL 150 2012 0020



KROMATOGRAFI KOLOM CAIR VAKUM



BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Pengamatan Tabel Pengamatan Eluen (50 mL) 50 : 1 45 : 5 40 : 10 35 : 15 30 : 20 25 : 25 20 : 30 15 : 35 10 : 40 5 : 45 1 : 50



n-heksan : etil asetat 10 : 0 9:1 8:2 7:3 6:4 5:5 4:6 3:7 2:8 1:9 0 : 10



Warna Kuning Kuning muda Kuning pucat Kuning pucat Hijau Hijau Hijau Hijau Hijau pucat Hijau pucat Hijau hampir bening



B. Pembahasan kromatografi cair vakum (KCV) adalah bentuk kromatografi kolom yang khususnya berguna untuk fraksinasi kasar yang cepat terhadap suatu ekstrak. Yang mana kondisi vakum adalah alternatif untuk mempercepat aliran fase gerak dari atas ke bawah. Metode ini sering digunakan untuk fraksinasi awal dari suatu ekstrak non-polar atau ekstrak semipolar. Pada kromatografi vakum cair (KVC), fase diamnya menggunakan silika gel yang diletakkan di dalam kolom kromatografi. Ada dua cara YAYU RAHMI RAMADANI SAPATI MUH. IKBAL 150 2012 0020



KROMATOGRAFI KOLOM CAIR VAKUM melapisi kolom dengan silika gel yaitu proses basah dan proses kering. Proses basah yaitu silika gel ditambahkan dengan n-heksana hingga berbentuk seperti bubur, lalu dituangkan kedalam kolom, dan dihisap pelarutnya dengan mesin vakum, dan dihentikan sampai panjang kolom sesuai dengan yang diinginkan, maka diperoleh silika gel yang padat pada kolom. Yang kedua proses kering yaitu memasukkan silika gel yang dalam bentuk padat langsung kekolom lalu dipadatkan. Pada percobaan ini, pembuatan kolom dengan silika gel dilakukan dengan cara proses kering. Dan sebagai fase geraknya yaitu eluen yang telah dibuat dengan berbagai perbandingan dengan tingkat kepolaran tertentu. Pada percobaan kali ini akan dilakukan penyiapan sampel yaitu pertama-tama kolom dibersihkan dan dibilas dengan menggunakan metanol. Dimasukkan silika gel kasar dan halus ke dalam kolom dan dimampatkan. Setelah itu, dipasang tegak lurus pada statif. Kemudian dimasukkan n-heksan ke dalam kolom sampai tiga kali agar diperoleh kerapatan



yang



maksimal.



Dan



dimasukkan



kertas



saring



dan



ditempatkan diatas silika. Dan pada isolasi sampel yaitu ekstrak daun raja ditimbang sebanyak 1 gram. Kemudian ditambah sedikit campuran silika kasar dan halus dan dicampur hingga homogen. Setelah itu dimasukkan ke dalam kolom, dan diletakkan di atas kertas saring. Dimasukkan eluen 10:0 ke dalam kolom. Kemudian dinyalakan pompa vakum. Ditampung fraksi di dalam botol coklat. Dimasukkan lagi eluen 9:1 sampai eluen 0:10, terakhir YAYU RAHMI RAMADANI SAPATI MUH. IKBAL 150 2012 0020



KROMATOGRAFI KOLOM CAIR VAKUM dimasukkan metanol dan ditampung fraksi didalam botol coklat dan diperoleh hasil, pada eluen n-heksan : etil asetat dengan perbandingan 6 : 4 terkandung senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan (flavonoid). Adapun faktor kesalahan yang mungkin terjadi yaitu kurang bersihnya



alat



yang



digunakan,



kurangnya



ketelitian



pengambilan eluen, dan kurang teliti pada saat pengerjaan.



YAYU RAHMI RAMADANI SAPATI MUH. IKBAL 150 2012 0020



pada



saat



KROMATOGRAFI KOLOM CAIR VAKUM BAB V PENUTUP A. Kesimpulan Berdasarkan hasil percobaan yang diperoleh, dapat ditarik kesimpulan bahwa dari hasil penyemprotan DPPH diperoleh hasil bahwa pada eluen n-heksan : etil asetat dengan perbandingan 6 : 4 terkandung senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan (flavonoid). B. Saran Diharapkan bagi semua pihak untuk selalu mengikuti prosedur percobaan dengan baik, sehingga tidak terdapat kesalahan-kesalahan yang berakibat pada hasil yang diperoleh.



DAFTAR PUSTAKA YAYU RAHMI RAMADANI SAPATI MUH. IKBAL 150 2012 0020



KROMATOGRAFI KOLOM CAIR VAKUM Gritter R.J., B. James dan S. Arthur, 1991. Pengantar kromatografi II. ITB: Bandung. Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia. ITB: Bandung. Khopkar, S.M. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Erlangga Raymond G. Reid and Satyajit D. sarker. 2006. Isolation of Natural Products by Low-Pressure Column Chromatography. Humana Press Inc. Totowa, New Jersey. Sarker, SD. 2006. Natural Product Isolation. Humana Press inc . Totowa New jersey. Sastrohamidjojo, Dr.H. 1985. Kromatografi. Penerbit Liberty: Yogyakarta. Yazid, Estien. 2005. Kimia Fisika Paramedis. Yogyakarta: Andi.



LAMPIRAN YAYU RAHMI RAMADANI SAPATI MUH. IKBAL 150 2012 0020



KROMATOGRAFI KOLOM CAIR VAKUM Skema Kerja 1. Penyiapan Kolom Dibilas kolom dengan methanol



Dipasang kolom tegak lurus pada statif



Dikemas fase diam dalam kolom dengan keadaan vakum, agar diperoleh kerapatan yang maksimum



Dimasukkan silika gel sebanyak 30 gram ke dalam kolom dan dimampatkan



Diratakan perbukaan adsorben dengan batang pengaduk



Dialirkan n-heksan beberapa kali dalam keadaan vakum



2. Isolasi Sampel YAYU RAHMI RAMADANI SAPATI MUH. IKBAL 150 2012 0020



KROMATOGRAFI KOLOM CAIR VAKUM



Ditimbang fraksi sebanyak 1 gram



Dimasukkan silika gel kasar (30 gram) dan silika halus (10 gram) kemudian diratakan permukaannya



Dimasukkan kertas saring



Dimasukkan eluen n-heksan



Dimasukkan fraksi yang telah disuspensikan dengan silika gel kedalam kolom



Ditambahkan cairan pengelusi dari kepolaran terendah n-heksan : etil asetat (10:0) melalui dinding kolom



Dijalankan pompa vakum hingga eluen turun dan mengelusi komponen kimia



Dilanjutkan dengan penyari yang kepolarannya lebih tinggi secara berturut-turut (9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, dan 0:10)



Ditampung cairan sebagai fraksi



Gambar Hasil Praktikum YAYU RAHMI RAMADANI SAPATI MUH. IKBAL 150 2012 0020



KROMATOGRAFI KOLOM CAIR VAKUM



Gambar. Fraksi yang diperoleh dari berbagai perbandingan eluen Gambar. Proses isolasi dengan KCV



Gambar. Fraksi 1



Gambar. Fraksi 2



Gambar. Fraksi 4



Gambar. Fraksi 3



Gambar. Fraksi 5



YAYU RAHMI RAMADANI SAPATI MUH. IKBAL 150 2012 0020 Gambar. Fraksi 6



Gambar. Fraksi 7 Gambar. Fraksi 8



KROMATOGRAFI KOLOM CAIR VAKUM



Gambar. Fraksi 9



Gambar. Noda yang terbentuk dari fraksi dilihat dari UV 254



Gambar. Noda yang terbentuk dari fraksi dilihat dari UV 366



Gambar. Lempeng setelah disemprotkan dengan DPPH



YAYU RAHMI RAMADANI SAPATI MUH. IKBAL 150 2012 0020