Laporan PKL Chintia Nur Khasanah (1840101008) [PDF]

Citation preview

IDENTIFIKASI VIRUS WSSV (White Spot Syndrome Virus) PADA KEPITING BAKAU (Scylla serrata) MENGGUNAKAN METODE PCR DI BKIPM TARAKAN



Oleh : CHINTIA NUR KHASANAH 18.401010.08



LAPORAN PRAKTIK KERJA LAPANG



PROGRAM STUDI AKUAKULTUR FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BORNEO TARAKAN TARAKAN 2021



IDENTIFIKASI VIRUS WSSV (White Spot Syndrome Virus) PADA KEPITING BAKAU (Scylla serrata) MENGGUNAKAN METODE PCR DI BKIPM TARAKAN



Oleh : CHINTIA NUR KHASANAH 18.401010.08



LAPORAN PRAKTIK KERJA LAPANG



PROGRAM STUDI AKUAKULTUR FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BORNEO TARAKAN TARAKAN 2021 i



HALAMAN PENGESAHAN



Judul PKL



: Identifikasi Virus WSSV (White Spot Syndrome Virus) pada Kepiting Bakau (Scylla Serrata) Menggunakan Metode PCR di BKIPM Tarakan



Nama Mahasiswa



: Chintia Nur Khasanah



NPM



: 18.401010.08



Jurusan



: Akuakultur Menyetujui: Dosen Pembimbing



Pembimbing Lapangan



Awaludin, S,Pi., M.Si. NIDN. 0021089001



D. Lia Lidayana, S.St.Pi NIP. 19820624 2008012012 Mengetahui:



Dekan Fakultas Perikanan Dan Ilmu Kelautan Universitas Borneo Tarakan



Ketua Program Studi Akuakultur



Rukisah, S.Pi., MP., Ph.D NIDN. 1128087001



Jimmy Cahyadi, S. Pi., M. Si. NIDN. 1123018001



ii



KATA PENGANTAR Puji dan syukur senantiasa penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena berkat Rahmat-Nya, penulis dapat menyusun dan menyelesaikan laporan PKL yang berjudul “Identifikasi Virus WSSV (White spot syndrome virus) Pada Kepiting Bakau (Scylla serrata) Menggunakan Metode PCR di BKIPM Tarakan.” Dalam penyelesaian laporan ini, penulis banyak mengalami kesulitan. Namun berkat bimbingan dari berbagai pihak, akhirnya laporan ini dapat terselesaikan, walaupun masih banyak kekurangannya. Karena itu penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada: 1. Rukisah, S. Pi. Ph.D selaku Dekan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Borneo Tarakan. 2. Jimmy Cahyadi, S.Pi, M.Si selaku Ketua Jurusan Akuakultur Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. 3. Awaludin, S. Pi, M.Si, selaku Dosen Pembimbing yang telah menyediakan waktu, tenaga, dan pikiran untuk mengarahkan saya dalam penyusunan laporan PKL ini. 4. Umar, S.Pi., M.Si, M.M selaku Kepala BKIPM Tarakan. 5. Jonison Petrus, S.St.Pi selaku Kepala seksi Tata Pelayanan BKIPM Tarakan. 6. D. Lia Lidayana, S,St.Pi selaku pembimbing magang instansi di BKIPM Tarakan, serta selaku Penyelia Virus BKIPM Tarakan. 7. Fajar Syahputra serta pegawai lainnya di Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Tarakan yang telah membimbing saya saat melakukan pengujian. 8. Orang tua yang telah banyak memberikan dorongan dan semangat baik secara moral maupun secara spiritual kepada penulis. 9. Semua pihak yang telah membantu baik secara langsung maupun tidak langsung yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Penulis menyadari, bahwa laporan ini masih banyak memiliki kekurangan, oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan adanya kritik dan iii



saran yang positif agar laporan ini menjadi lebih baik dan berguna di masa yang akan datang. Tarakan,



2021



Chintia Nur Khasanah



iv



DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL....................................................................................... i HALAMAN PENGESAHAN........................................................................ ii KATA PENGANTAR ................................................................................... iii DAFTAR ISI................................................................................................... iv DAFTAR TABEL .......................................................................................... vii DAFTAR GAMBAR...................................................................................... viii DAFTAR LAMPIRAN................................................................................... ix I.



PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang.................................................................................... 1 1.2 Tujuan................................................................................................. 2 1.3 Manfaat............................................................................................... 2



II. GAMBARAN UMUM 2.1 Sejarah BKIPM Tarakan.................................................................... 3 2.2 Visi dan Misi BKIPM......................................................................... 5 2.3 Tugas dan Fungsi BKIPM.................................................................. 5 2.4 Sarana Laboratorium.......................................................................... 6 2.5 Struktur Organisasi BKIPM............................................................... 7 III. METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat.............................................................................. 8 3.2 Alat dan Bahan................................................................................... 8 3.3 Metode Penelitian............................................................................... 9 IV. URAIRAN KEGIATAN IV.1............................................................................................................Prepa rasi Sampel.......................................................................................... 13 IV.2............................................................................................................Ekstr aksi DNA............................................................................................. 13



v



IV.3............................................................................................................Ampl ifikasi DNA.......................................................................................... 14 IV.4............................................................................................................Elekt roforesis............................................................................................... 18 IV.5............................................................................................................Visua lisasi DNA .......................................................................................... 19 V. PENUTUP 5.1 Kesimpulan......................................................................................... 21 5.2 Saran................................................................................................... 21 DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN



vi



DAFTAR TABEL No.



Halaman



1.



Alat yang digunakan.................................................................................. 8



2.



Bahan yang digunakan............................................................................... 9



3.



Profil Mesin PCR Amplifikasi untuk First PCR....................................... 11



4.



Profil Mesin PCR Amplifikasi untuk Nested PCR.................................... 11



vii



DAFTAR GAMBAR



No.



Halaman



1.



Gedung BKIPM Tarakan........................................................................... 4



2.



Struktur organisasi..................................................................................... 7



3.



Preparasi sampel........................................................................................ 14



4.



Sampel Kepiting bakau (Sylla serata)....................................................... 13



5.



Hasil pengujian WSSV pada 5 sampel kepiting dan 2 udang segar.......... 19



viii



DAFTAR LAMPIRAN No.



Halaman



1.



Proses Ekstraksi DNA............................................................................... 24



2.



Amplifikasi DNA dan Elektroforesis........................................................ 25



3.



Jurnal Harian Kegiatan PKL...................................................................... 26



ix



1



I.



PENDAHULUAN



I.1 Latar Belakang Budidaya merupakan upaya yang dilakukan untuk meningkatkan produksi perikanan dalam rangka memenuhi kebutuhan manusia. Namun dalam kegiatan budidaya, faktor terpenting dari siklus produksi adalah menghasilkan komoditas perikanan yang unggul dan berkualitas. Komoditas Budidaya perikanan di Kota Tarakan diantaranya ikan, udang, kepiting,



dan



rumput



laut.



Untuk



tambak



udang



ditarakan,



produktivitasnya masih sangat rendah, sekitar 0,13 ton per hektar per tahun. Ini dikarenakan terbatasnya aksesibilitas dan sarana produksi. Lantaran, semua sarana produksi didatangkan dari Sulawesi Selatan maupun Jawa. Dalam hal ini perkembangan pengelolaan perikanan seperti ikan, udang, lobster dan kepiting, khususnya di wilayah Tarakan dan wilayah sekitarnya dari tahun ke tahun semakin meningkat. Sehingga memerlukan stock benih ikan, udang, dan kepiting yang baik dan berkualitas untuk



disuplai ke Kalimantan Utara. Peningkatan kualitas



kepiting di Kota Tarakan harus bebas penyakit, baik disebabkan oleh pathogen maupun non pathogen, sehingga diperlukan tindakan pencegahan penyebaran penyakit. Tindakan pencegahan penyebaran penyakit salah satunya dibentuknya karantina ikan (DKP, 2020). Karantina ikan adalah tindakan sebagai upaya pencegahan masuk dan tersebarnya hama dan penyakit atau organisme pengganggu dari luar negeri dan dari suatu area ke area lain di dalam negeri. Salah satu tindakan karantina yang dilakukan yaitu pengujian laboratorium untuk produk perikanan yang masuk ke dalam wilayah Republik Indonesia dengan mengidentifikasi penyakit bakteri, protozoa maupun virus yang menyerang ikan (DKP, 2020) Virus merupakan partikel elemen genetik yang mengandung salah satu asam nukleat yaitu asam deoksiribonukleat (DNA) atau asam ribonukleat (RNA) yang dapat berada dalam dua kondisi yang berbeda, yaitu secara intraseluler dalam tubuh inang dan ekstraseluler di luar tubuh inang. Virus dapat bereproduksi dengan membentuk molekul-molekul baru baik DNA maupun RNA.



2



Salah satu virus yang menyerang kepiting bakau adalah White Spot Syndrome Virus (WSSV). WSSV atau sindrom bintik putih merupakan salah satu virus infeksi pada udang penaeid (Supamattya, 1996). Penyakit yang disebabkan karena infeksi virus ini sangat mematikan dan menular, serta dapat membunuh udang dengan cepat. Wabah penyakit ini telah memusnahkan seluruh populasi banyak tambak udang dalam beberapa hari, di berbagai tempat di seluruh dunia. Penyakit ini disebabkan oleh keluarga virus terkait yang termasuk dalam sindrom white spot baculovirus complex dan penyakit yang disebabkan oleh virus tersebut sebagai sindrom bintik putih. Banyak krustasea seperti Kepiting (Scylla spp., Portunus spp.) lobster berduri (Panulirus spp.), lobster air tawar (Astacus spp, Cherax spp.) dan udang air tawar (Macrobrachium spp.) yang dilaporkan terinfeksi dengan berbagai tingkat keparahan tergantung



pada



gaya



hidup



inang dan adanya stresor eksternal (suhu, salinitas, penyakit bakteri, polutan) (Lightner, D. V, 1996). Oleh karena itu, pentingnya dilakukan tindakan karantina pada komoditi atau media pembawa lainnya yang keluar maupun masuk, untuk mencegah masuk dan tersebarnya WSSV yang menyerang kepiting bakau (S. serrata) di Kota Tarakan. I.2 Tujuan Tujuan PKL adalah untuk mengetahui metode pemeriksaan atau identifikasi WSSV pada kepiting bakau yang menggunakan metode PCR di BKIPM. I.3 Manfaat Manfaat dari PKL adalah untuk menambah wawasan pengujian WSSV dengan meggunakan metode PCR di BKIPM.



3



II.



GAMBARAN UMUM



II.1 Sejarah BKIPM Tarakan Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan merupakan Pos Karantina Ikan Nunukan didirikan pada tahun 2002 dan berlokasi di Nunukan dipimpin oleh Siti Faridah, S.Pi sebagai Kepala Stasiun Karantina Ikan Kelas II Juata Tarakan dengan periode (2002-2005). Berganti nama menjadi Stasiun Karantina Ikan Kelas II Juata Tarakan didirikan pada tahun 2005 dan berlokasi di Tarakan. Dipimpin oleh Darwis, S.Pi, sebagai Kepala Stasiun Karantina II Juata Tarakan dengan periode (2005-2013). Berganti nama lagi menjadi Stasiun Karantina Ikan dan Pengendalian Mutu Kelas II Tarakan yang didirikan pada tahun 2011 dipimpin oleh Darwis, S.Pi sebagai Kepala Stasiun Karantina II Juata Tarakan dengan periode (2005-2013). Setelah periode Darwis, S.Pi berakhir, kemudian digantikan oleh Sab Lestiawan, A.Pi, M.M sebagai kepala Stasiun Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas II Tarakan periode (2013-2018). Stasiun Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas II Tarakan merupakan salah satu Unit Pelaksana Teknis (UPT) yang berada dibawah Badan Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (BKIPM) yang awalnya bernama PUSKARI (Pusat Karantina Ikan) dibawah Kementrian Kelautan dan Perikanan. UPT ini sebelumnya merupakan Satker (Satuan Kerja) Tarakan dibawah pos Karantina Nunukan yang merupakan Wilker (Wilayah Kerja) dari Balai Karantina Ikan (BKI) Kelas I sepingan Balikpapan. Maka, sejak dikeluarkannya SK (Surat Keputusan) Kementrian Kelautan dan Perikanan No. KEP. 32/MEN/2004, Satker (Satuan Kerja) Tarakan resmi terbentuk menjadi Stasiun Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas II Tarakan dengan Nunukan sebagai Wilkernya (Wilayah Kerja). Pada tahun 2017 selanjutnya berganti nama menjadi Balai KIPM ( Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan) yang dipimpin oleh Umar, S.Pi, M.Si, M.M sebagai Kepala Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Tarakan dengan periode



4



(2018-Sekarang). Dengan dikeluarkan surat keterangan (SK) Kementerian Kelautan dan Perikanan No.KEP.54/MEN/2017 pada tanggal 8 Desember 2017. Balai



KIPM



Tarakan



melaksanakan



tugas



pengembangan,



pembinaan,



pemantauan, dan evaluasi perkarantinaan ikan pengendalian mutu dan keamanan hasil perikanan tanggung jawab, tugas dan fungsi Balai KIPM Tarakan adalah melindungi sumber perikanan seluruh wilayah Negara kesatuan-kesatuan RI dari serangan hama dan penyakit Ikan Karantina dan melaksanakan pengendalian mutu keamanan hasil perikanan. Pelaksanaan tugas dan tanggung jawab tersebu dilaksanakan oleh Balai KIPM Tarakan dengan didukung oleh 46 unit pelaksanaan teknis. Unit kerja Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Tarakan yang meliputi wilayah kerjanya yaitu: a. Kota Tarakan b. Kabupaten Nunukan c. Kabupaten Bulungan d. Kabupaten Malinau e. Kabupaten Tana Tidung Pada bulan Februari 2019 Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Tarakan menambahkan wilayah kerjanya yang berada di Tanjung Selor.



Gambar 1. Gedung BKIPM Tarakan



II.2 Visi dan Misi BKIPM a.



Visi



5



Adapun visi dari BKIPM Tarakan, yaitu : Terwujudnya Indonesia yang Berdaulat, Mandiri dan Berkepribadian Berlandaskan Gotong Royong. b.



Misi Adapun visi dari BKIPM Tarakan ini, yaitu : 1. Mewujudkan keamanan nasional yang mampu menjaga kedaulatan wilayah, menopang kemandirian ekonomi dengan mengamankan sumber daya maritim, dan mencerminkan kepribadian Indonesia sebagai Negara Kepulauan. 2. Mewujudkan masyarakat maju, berkeseimbangan dan domokratis berlandaskan Negara Hukum. 3. Mewujudkan politik luar negeri bebas aktif dan memperkuat jati diri sebagai Negara Maritim. 4. Mewujudkan kualitas hidup manusia Indonesia yang tinggi, maju dan sejahtera. 5. Mewujudkan bangsa yang berdaya saing. 6. Mewujudkan Indonesia menjadi Negara maritim yang mandiri, maju, kuat dan berbasiskan kepentingan nasional. 7. Mewujudkan masyarakat yang berkepribadian dalam kebudayaan.



II.3 Tugas dan Fungsi BKIPM a.



Tugas Karantina Ikan Melaksanakan perumusan kebijakan, penyusunan norma, standar, prosedur, kriteria, bimbingan teknis, monitoring, pembinaan, evaluasi, dan laporan bidang perkarantinaan ikan dan keamanan hayati ikan.



b.



Fungsi Karantina Ikan 1. Perumusan kebijakan dan penyusunan norma, standar, prosedur, kriteria,



monitoring,



evaluasi,



dan



pelaporan



perkarantinaan ikan dan keamanan hayati ikan; 2. Penerapan kebijakan operasional perkarantinaan ikan; 3. Pengelolaan instalasi karantina ikan;



dibidang



6



4. Pelaksanaan kegiatan inspeksi dalam dan luar negeri, verifikasi, dan tindak lanjut hasil inspeksi; 5. Monitoring sebaran hama dan penyakit ikan karantina; 6. Pelasanaan pengendalian pemasukan dan pengeluaran agen hayati jenis ikan dilindungi, dibatasi, dilarang, invasif, dan produk rekayasa genetik; 7. Monitoring dan mitigasi risiko dibidang keamanan hayati ikan; 8. Koordinasi



penindakan



dan



penanganan



pelanggaran



perkarantinaan ikan dan keamanan hayati ikan, serta pembinaan Penyidik Negeri Sipil Karantina Ikan; dan 9. Pelaksanaan tata usaha dan rumah tangga. c.



Tugas Pengendalian Mutu Melaksanaan perumusan kebijakan, penyusunan norma, standar, prosedur, kreteria, bimbingan teknis, monitoring, evaluasi, dan laporan dibidang sertifikasi mutu dan keamanan hasil perikanan. 1. Perumusan kebijakan penyusunan norma, standar, prosedur, dan kriteria sistem sertifikasi mutu dan keamanan hasil perikanan; 2. Pelaksanaan kegiatan monitoring, sertifikasi produk, inspeksi, verifikasi, harmonisasi, dan penanganan kasus sertifikasi mutu dan keamanan hasil perikanan; 3. Pelaksanaan monitoring, evaluasi, dan laporan penerapan sistem sertifikasi mutu dan keamanan hasil perikanan; dan 4. Pelaksanaan tata usaha dan rumah tangga pusat.



II.4 Sarana Laboratorium Sarana merupakan peralatan dan bahan yang harus tersedia dan langsung dipergunakan pada saat berlangsungnya proses pemeriksaan hingga keluar hasil uji sampel. Sarana yang tersedia di Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Tarakan ini diantaranya memiliki beberapa laboratorium sebagai tempat pemeriksaan, identifikasi sampel dan tempat pembuatan media sebagai berikut: 1.



Laboratorium parasit berfungsi sebagai ruangan pemeriksaan penyakit



7



golongan parasit. 2.



Laboratorium bakteri berfungsi sebagai ruangan identikasi penyakit golongan bakteri.



3.



Laboratorium virus berfungsi sebagai ruangan identifikasi penyakit golongan virus.



4.



Laboratorium media berfungsi sebagai ruangan tempat penyimpanan perlatan dan bahan steril, serta pembuatan media penguji.



II.5 Struktur Organisasi BKIPM Struktur Organisasi Laboratorium Penguji BKIPM Tarakan



Kepala Balai KIPM Tarakan Umar, S.Pi., M.Si., M.M



Kasubag Tata Usaha



Kasi Pengawasan, Pengendalian dan Informasi



Kurnia Catur Pratiwi, S.E



M. Roy Pahlavi., A.Md



Kasi Tata Pelayanan Jonison Petrus, S.St.,Pi



Koordinator PPS Syahrani, A.Md



Petugas Pengambil Sampel



Penyelia Bakteri



Penyelia Parasit Aep Mulyono, S.St.,Pi



Darmansyah, S.Pi



Analis Parasit



Analis Bakteri



Penyelia Virus Dr. Lia Lidayana, S.St.,Pi Petugas Pengambil Sampel Petugas Pembuatan LHU Analis Virus



Gambar 2. Struktur Organisasi Laboratorium Penguji BKIPM Tarakan



8



III. III.1



METODOLOGI



Waktu dan Tempat PKL dilaksanakan



pada tanggal



04 Februari – 15 Maret 2021 di



Laboratorium Karantina Ikan, Pengendalian Mutu, dan Keamanan Hasil Perikanan Tarakan. III.2



Alat dan Bahan



III.2.1 Alat Alat yang digunakan pada pengujian identifikasi virus WSSV dengan menggunakan metode PCR pada BKIPM dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Alat yang digunakan No Nama Alat 1. Mikrotube 2. Collection Tube 3. Mikroliter pipet 4. Mikrotip 5. PCR tube 6. Freeze 7. Thermo Block 8. Mikrowave 9. Vortex Mixer 10. Spindown 11. Thermocycler 12. Centrifuge 13. Timbangan Analitik 14. Autoclave 15. Mesin Elektroforesis 16. Gell Doc 17. Sarung Tangan Karet 18. Masker



Kegunaan Wadah larutan Wadah menyaring bahan Memindahkan larutan Memindahkan larutan Wadah larutan amplifikasi Penyimpanan sampel dan bahan Memanaskan larutan Melarutkan agarose Menghomogenkan campuran larutan Menurunkan larutan Mesin amplifikasi PCR Mengambil supernatan larutan Menimbang agarose Mensterilkan alat Running Gell Visualisasi DNA Menghindari kontaminasi Menghindari kontaminasi



III.2.2 Bahan Bahan yang digunakan pada pengujian identifikasi virus WSSV dengan menggunakan metode PCR pada BKIPM dapat dilihat pada Tabel 2.



9



Tabel 2. Bahan yang digunakan No Nama Bahan 1. Kit Ekstraksi 2. Agarose 3. TAE 4. Akuabidest 5. Ethanol 6. Go Taq Green Master Mix 7. Primer WSSV 146F1/146R1 8. Primer WSSV 146F2/146R2 9. Nuclease-Free Water 10.



DNA Marker



11.



SBR Green



III.3



Kegunaan Buffer Ekstraksi DNA Wadah Running Gell Buffer Untuk Elektroforesis Mengencerkan TAE Buffer Untuk Ekstraksi DNA Untuk proses Amplifikasi Untuk Proses Amplifikasi Untuk Proses Amplifikasi Bahan Proses Amplifikasi Ukuran untuk berat molekul pada proses Elektroforesis Mewarnai Larutan



Metode Penelitian



III.3.1 Preparasi Sampel Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel kepiting bakau (S. serrata), jumlah sampel yang di siapkan sebanyak 5 ekor kepiting yang belum mengalami gejala klinis. Selanjutnya dilakukan nekropsi pada sampel berupa pengambilan organ target sampel yaitu hepatopankreas yang akan diekstraksi DNA dan ditempatkan di tabung microtube (Gambar 3).



Gambar 3. Preparasi sampel III.3.2 Pengujian WSSV Menggunakan Metode PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode perbanyakan template DNA atau complementary DNA (cDNA) dengan menggunakan



10



enzim Taq polymerase secara in vitro (Vierstraete, 1999). 1.



Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA merupakan proses pemisahan DNA dari komponen sel lainnya seperti protein, karbohidrat, lemak dan lain-lain. Langkahlangkah dalam kegiatan ekstraksi DNA, meliputi ; a.



Potong jaringan menjadi potongan kecil menggunakan gunting atau digerus didalam tabung mikrosentrifuge ukuran 1,5 ml. Tambahkan 180 mikro buffer ATI.



b. Tambahkan 20 mikro protein K. Vortex hingga benar-benar tercampur dan inkubasi pada suhu 56oC sampai jaringan lysis sempurna (± 1-3 jam ), vortex sesekali selama inkubasi sampel atau letakkan pada termomixer, shaker water bath, atau plat goyang. c.



Vortex 15 detik, tambahkan 200µ buffer AL kedalam sampel, dan vortex hingga benar-benar tercampur , kemudian tambahkan 200 µ ethanol absolut (96-100%) dan vortex hingga benar-benar tercampur.



d. Pipet campuran dari langkah 3 (termasuk endapan ) kedalam deneasy mini spin column, letakkan pada collection tube 2 ml. Centrifuge pada 8000 rpm selama 1 menit, Buang sisa larutan dan tabung collection. e.



Letakkan deneasy mini spin column pada collection tube ukuran 2 ml yang baru, tambahkan 500µ buffer AW1 centrifuge 8000 rpm selama 1 menit. Buang sisa larutan dan tabung collection.



f.



Letakkan deneasy mini spin column pada collection tube ukuran 2 ml yang baru, tambahkan 500µ buffer AW2 centrifuge 14000 rpm selama 3 menit hingga deneasy membrane kering. Buang sisa larutan dan tabung collection.



g.



Letakkan deneasy mini spin column pada tabung mikrocentrifuge (1,5-2 ml) yang bersih dan tambahkan 200 µ buffer AE kedalam membrane. Inkubasi pada suhu ruang selama 1 menit . Centrifuge pada 8000 rpm selama 1 menit.



h. Untuk mendapatkan hasil DNA yang maksimal, ulangi langkah 7.



11



2.



Amplifikasi DNA a. First PCR a) Go Taq Green Mater Mix : 12,5 µl x 9 sampel = 112,5 µl b) Primer WSSV F1 (10µM) : 1 µl x 9 sampel = 9 µl c) Primer WSSV R1 (10µM) : 1 µl x 9 sampel = 9 µl



No 1. 2. 3. 4. 5. 6. b.



d) Nuclease-Free Water



: 6,5 µl x 9 sampel = 58,5 µl



e) DNA Template Sampel



: 4 µl x 9 sampel = 36 µl



Tabel 3. Profil mesin PCR amplifikasi untuk first PCR Temperature (oC) Waktu ( men: det) 94 4:00 94 1:00 55 1:00 72 2:00 72 2:00 4 hold Nested PCR a) Go Tag Green Master Mix : 12,5 µl x 9 sampel = 112,5 µl b) Primer WSSV F2 (10µM)



: 1 µl x 9 sampel = 9 µl



c) Primer WSSV R2 (10µM)



: 1 µl x 9 sampel = 9 µl



d) Nuclease-Free Water



: 8,5 µl x 9 sampel = 76,5 µl



e) Amplicon Sampel Step 1



: 2 µl x 9 sampel = 18 µl



Tabel 4. Profil mesin PCR amplifikasi untuk Nested PCR Temperature (oC) 94 94 55 72 72 4



No 1. 2. 3. 4. 5. 6. 1.



Waktu (Min:Det ) 4:00 1:00 1:00 2:00 2:00 Hold



Elektroforesis a. Pembuatan agarose a) Larutkan 1,2 gr Agarose dengan 10 ml TAE. b) Panaskan pada microwave sampai larut.



12



c) Tuangkan kedalam cetakan yang sudah dilengkapi dengan sisir, diamkan sampai agarose mengeras. b. Running Gell a) Pindahkan agarose kedalam tangka alat b) Tuangkan TAE Buffer hingga menutupi permukaan agar , dan usahakan tidak terdapat gelembung pada bagian bawah gagar. c) Masukkan bahan pada sumur yang sudah terbentuk, tidak boleh keluar dari sumur d) Setelah selesai masukkan bahan , tutup alat dengan pentutup yang sudah disediakan e) Masukkan konektor tangkai alat ke mesin sesuai dengan posisinya, lalu sambungkan dengan power supplay



dengan



listrik f) Atur pada angka 100 V dana tur timer 45-60 menit , lalu tekan tombol “RUN”. g) Buka penutup alat tangkai, kemudian lepaskan tangkai dari mesin. c.



Visualisasi DNA a) Letakkan Gell yang telah dielektroforesis tersebut pada UV Transmilator, kemudian atur pembesaran dan focus kamera untuk akurasi foto. b) Dokumentasi gambar Gell. Cetak gambar menggunakan print c) Berat molekul DNA target WSSV akan terlihat dengan jelas pada 1447 bp pada step 1 dan 941 bp pada step 2 serta berpendar berupa band. d) Bandingkan berat molekul target dengan marker yang digunakan



13



IV.



URAIAN KEGIATAN



Proses pengujian virus WSSV pada kepiting bakau dengan metode PCR di lakukan melalui beberapa tahap yaitu tahap preparasi sampel, ekstraksi DNA, amplifikasi DNA, elektroforesis dan visualisasi DNA. IV.1



Preparasi Sampel Sampel yang digunakan yaitu kepiting bakau (S. serrata) (Gambar 4) jumlah sampel yang di siapkan sebanyak 5 ekor kepiting yang belum mengalami gejala klinis. Selanjutnya dilakukan nekropsi pada sampel berupa pengambilan organ target sampel yaitu hepatopankreas yang akan di ekstraksi DNA dan ditempatkan di tabung microsentrifuge.



Gambar 4. Sampel Kepiting Bakau (S. serrata) IV.2



Ektraksi DNA Ekstraksi DNA merupakan proses pemisahan DNA dari komponen sel lainnya seperti protein, karbohidrat, lemak dan lain-lain. Ekstraksi DNA terdiri dari tiga tahap utama yakni perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari komponen lainnya serta pemurnian DNA (Corkill dan Rapley 2008). Pemecahan sel atau lisis pada proses ekstraksi sel bertujuan untuk menghancurkan membran dan dinding sel sehingga bagian dalam sel dapat keluar (Holme dan Peck, 1998). Selanjutnya tahap pemisahan DNA dari makromolekul lain seperti protein, sebagian kecil



14



RNA, lipid dan polisakarida (Muladno, 2010). Tahap terakhir ialah pemurnian DNA. Tahap ini bertujuan untuk menghilangkan residu dari zat yang digunakan pada tahap lisis dan pemisahan DNA. Metode konvensional dalam ekstraksi DNA diantaranya adalah metode ekstraksi menggunakan phenolchloroform. Metode ini memerlukan sejumlah tahapan penambahan bahan- bahan kimia dan membutuhan waktu pengerjaan yang cukup lama (±18 jam) (Sambrook et al., 1989). Seiring dengan berkembangnya teknologi, proses ekstraksi DNA telah mengalami pengembangan dan modifikasi sehingga lebih efisien. Salah satu bentuk modifikasi proses ekstraksi DNA ialah penggunaan kit ekstraksi komersial yang telah berisi campuran bahan yang dibutuhkan untuk proses ekstraksi dengan waktu pengerjaan yang cukup singkat (±2 jam). Buffer-buffer yang digunakan dalam proses ekstraksi DNA di laboratorium virus balai KIPM Tarakan beserta fungsinya adalah sebagai berikut : 1. Buffer ATL mengandung SDS, natrium dodesil sulfat. Surfaktan anionik ini bertindak sebagai deterjen dan membantu lisis sel. Ini merusak ikatan non-kovalen dalam protein untuk mengubah sifat dan membukanya. Buffer AL mengandung agen chaotropic guanidinium chloride. 2. Buffer



AL



mengandung



agen



chaotropic



guanidinium



chloride. Ini meningkatkan proses lisis sel, denaturasi protein, DNA dan makromolekul lainnya dan juga menonaktifkan nuklease dan membantu asam nukleat yang mengikat bahan silika murni. 3. Buffer AW1 dan AW2 digunakan sebagai buffer pengikat dalam kit DNeasy Plant,



2



volume



etanol



harus



ditambahkan



ke



dalamnya. Buffer AW1 digunakan sebagai penyangga pencucian di kit lain. 4. Buffer AE melumasi DNA dari membran spin column ke dalam tabung pengumpul microcentrifuge dan memungkinkan penyimpanan DNA yang stabil.



15



IV.3



Amplifikasi DNA Proses ekstraksi DNA dan mendapatkan DNA template (DNA Murni), selanjutnya adalah proses amplifikasi. Metode amplifikasi atau perbanyakan DNA pada suatu daerah target tertentu yang dibatasi oleh sepasang primer (primer forward dan primer reverse). DNA template dari sampel kepiting tadi dibawa ke ruang amplifikasi untuk selanjutnya di amplifikasi. DNA template, Go Taq green master mix, primer dan nuclease free water dimasukkan ke dalam PCR tube sesuai dengan takaran yang telah ditentukan untuk satu tube. Total campuran untuk sampel dalam satu PCR tube adalah 25 µl. (Newton, et al, 1994) Pada proses amplifikasi kontrol positif dan negatif dibuat juga sebagai acuan untuk pembacaan hasil pengujian apakah positif atau negatif WSSV pada tahap visualisasi DNA. Amplifikasi DNA menggunakan teknik PCR dengan alat yang bernama thermal-cycler. Penemuan awal dari teknik PCR didasarkan pada tiga waterbaths (alat pemanas cairan atau bahan kimia) yang mempunyai temperatur yang berbeda. Thermal- cycler pertama kali dipublikasikan pada tahun 1986, akan tetapi DNA polymerase awal yang digunakan masih belum thermostable (tahan terhadap temperatur tinggi), dan harus ditambahkan disetiap siklusnya. Kelemahan lain temperature 37°C yang digunakan bias dan menyebabkan hasil produk yang tidak dikehendaki. Taq DNA diisolasi



dari



polymerase yang



bakteri Thermus aquaticus (Taq) dikembangkan pada



tahun 1988. Enzim ini tahan sampai temperature mendidih 100°C, dan aktifitas maksimal pada temperatur 92-95°C (Handoyo, et al 2001) Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi oleh enzim DNA polimerase. Sepasang primer oligonukleotida yang spesifik digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-5’ menuju ujung-3’ untai DNA target dan mengamplifikasi untuk urutan yang diinginkan. Hal ini disebut sebagai antiparalel. Kedua ujung asimetris DNA disebut sebagai 5' (lima prima) dan 3' (tiga prima). Ujung 5' memiliki gugus fosfat terminus, sedangkan ujung 3' memiliki gugus hidroksi terminus. Dasar siklus PCR ada 30-35 siklus



16



meliputi: a. Denaturation (95°C), 30 detik b. Annealing (55–60°C), 30 detik c. Extension (72°C), waktu tergantung panjang pendeknya ukuran DNA yang diinginkan sebagai produk amplifikasi.



17



Tahapan PCR adalah sebagai berikut : 1. Denaturasi untai ganda DNA Denaturasi untai ganda DNA merupakan langkah yang kritis selama proses PCR. Temperatur yang tinggi pada awal proses menyebabkan pemisahan untai ganda DNA. Temperatur pada tahap denaturasi pada kisaran 92-95ºC, suhu 94ºC merupakan pilihan standar. 2. Primer Annealing Primer Annealing merupakan tahap pengenalan (annealing) suatu primer terhadap DNA target tergantung pada panjang untai, banyaknya kandungan GC, dan konsentrasi primer itu sendiri. Optimalisasi temperatur annealing dimulai dengan menghitung Melting Temperature (Tm) dari ikatan primer dan DNA template. Sedang temperatur annealing biasanya 5ºC dibawah Tm primer yang sebenarnya. Secara praktis, Tm ini dipengaruhi oleh komponen buffer, konsentrasi primer dan DNA template. 3. DNA Polymerase extension Pada tahap extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target akan bergerak dari ujung 5’ menuju ujung 3’ dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau pembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa nukleotida yang ditargetkan, adapun temperatur extension berkisar antara 70-72°C. 4. Komponen dalam PCR (Polymerase Chain Reaction) Pada reaksi PCR diperlukan DNA template, primer spesifik, enzim DNA polimerase yang thermostabil, buffer PCR, ion Mg 2+, dan thermal cycler, sebagai komponen dalam pengujian virus dengan metode PCR a) Template DNA DNA Template yaitu DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen yang akan digandakan. DNA Template di dalam proses PCR berfungsi sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama.



18



b) Primers Primer DNA adalah sekuens DNA yang komplemen terhadap sekuens yang akan diamplifikasi, terutama dalam reaksi berantai polimerase (PCR). Batasannya, primer ini akan menempel pada kedua ujung sekuens DNA yang ingin diamplifikasi dengan arah yang berkebalikan (utas sense dan antisense). Dalam suatu reaksi berantai polimerase digunakan dua primer, yaitu primer maju dan primer mundur. Kedua primer ini harus ada dalam reaksi polimerasi agar amplifikasi DNA terjadi (Carson, et al, 2006) Molekul primer dapat berupa molekuln DNA, RNA, atau bahkan protein spesifik. Biasanya, primer yang digunakan pada PCR adalah molekul DNA. Pada akhir proses PCR akan terdapat sejumlah besar fragmen-fragmen pendek DNA hasil amplifikasi. Setelah dilakukan amplifikasi, terdapat berbagai cara untuk melihat hasilnya. Salah satu diantaranya adalah elektroforesis gel (Joshsi J, et al, 2012). c) Taq DNA polymerase DNA Polimerase yaitu enzim yang mengkatalisis polimerisasi nukleotida menjadi untaian DNA. DNA Polimerase berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik. d) PCR buffer dan konsentrasi Mg2+ Larutan Buffer yaitu bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan DNA polymerase. Buffer berfungsi untuk menjamin pH medium, membantu menstabilisasi enzim polimerase DNA, mempengaruhi kerja enzim, dan atau DNA melting temperature (Tm). Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.3) dan 1.5mM MgCl2. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin



19



tidak optimum dengan kombinasi yang lain. Produk PCR buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl2. MgC12 merupakan Ion logam yang berfungsi sebagai kofaktor DNA polymerase, tanpa ion ini DNA polymerase tidak dapat bekerja. e) Nucleotides (dNTPs) Deoxynucleoside triphosphates merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). Deoxynucleoside triphosphates berfungsi sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA template, atau sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. f) PCR Thermal Cycler PCR thermal cycler pertama kali dikembangkan oleh perusahaan bernama Perkin Elmer sebagai pemegang paten asli. Pada saat ini telah diproduksi berbagai macam tipe PCR thermal cycler ini dari berbagai perusahaan yang bergerak dalam bioteknologi. Walaupun nama dari masing-masing



alat



itu



berbeda



tetapi



prinsip



kerjanya



sama.



Thermocycler merupakan alat untuk amplifikasi. IV.4



Elektroforesis Elektroforesis



adalah teknik pemisahan komponen atau molekul



bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya yang ada di dalam sebuah medan listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA (Mousir, 2012). Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan (Yuwono T. 2005). Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul



20



tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan (Yuwono T, 2005). IV.5



Visualisasi DNA Pembacaan hasil visualisasi DNA dilakukan di Gell dok, pada saat



pembacaan hasil kontrol positif akan muncul pada ukuran base pair 941 pada nested step, kontrol positif digunakan untuk menentukan apakah pengujian sudah dilakukan dengan benar atau tidak, jangan sampai hasil visualisasi DNA uji hasilnya palsu. Sampel dapat di katakan positif apabila terdapat pita band DNA yang sama dan sesuai dengan kontrol positif yaitu pada ukuran besper ke 941.Berdasarkan hasil pengujian yang diperoleh dari 7 sampel diatas, tidak di temukan adanya sampel yang terserang WSSV (White Spot Syndrome Virus). Hal ini terlihat dari Hasil visualisasinya yang tidak menunjukkan ada pita band DNA yang sesuai dan sama dengan kontrol positif. Secara fisik semua sampel udang dan kepiting yang di analisis tidak menunjukkan gejala klinis terserang WSSV (White Spot Syndrome Virus) yaitu adanya bintik putih pada tubuh. Dari hasil visualisasi DNA diatas, hasil pengujian menunjukkan bahwa sampel kepiting bakau yang diuji negatif terinfeksi virus WSSV. Dikatakan negatif karena tidak ada pita band dari sampel kepiting yang menunjukkan garis yang sama dengan yang terdapat pada kontrol positif (Ctrl+), maka dapat dinyatakan bahwa dari ketujuh sampel tersebut hasilnya negatif WSSV (Gambar 5).



Gambar 5. Hasil pengujian WSSV pada 5 sampel kepiting dan 2 udang segar Keterangan



21



M = Marker K+ = Kontrol Positif K- = Kontrol Negatif A = Sampel Kepiting B = Sampel Kepiting C = Sampel Kepiting D = Sampel Kepiting E = Sampel Kepiting F = Sampel Kepiting G = Sampel Kepiting



22



V. PENUTUP V.1 Kesimpulan Pengujian WSSV pada laboratorium virus di Balai Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (BKIPM) Tarakan menggunakan metode PCR, tidak ditemukan kepiting yang terinfeksi virus WSSV. V.2 Saran 1. Lebih meningkatkan sosialisasi dan kerjasama antar pimpinan, pegawai dan mahasiswa serta tamu kantor para satker, sehingga dengan demikian mampu menumbuhkan hubungan kekeluargaan yang harmonis dan baik. 2. Kedisiplinan dan tata tertib yang perlu ditingkatkan agar dapat mencapai hasil dan tujuan yang sesuai dengan apa yang di harapkan. 3. Meningkatkan semangat/etos kerja, guna pencapaian kinerja lebih baik. Demikianlah saran-saran yang dapat di sampaikan setelah melaksanakan PKL di BKIPM Tarakan. Semoga dapat bermanfaat bagi kemajuan kantor dan pihak Universitas .



DAFTAR PUSTAKA



Carson, Susan and Robertson, Dominique, 2006. Manipulation and Exression of Recombinant DNA, 2nd Edition Elsivier Academic Press; USA. Corkill, G., R. Rapley. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and Techniques. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA. Dinas Kelautan dan Perikanan. 2020. Produktivitas tambak udang , Tanjung Selor Hilir, Tanjung Selor, Kabupaten Bulungan Kalimantan Utara Handoyo. D., Rudiretna, A., (2001). Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR), Pusat Studi Bioteknologi, Universitas Surabaya. Holme, D.J dan Peck, H. 1998. Analytical Biochemistry. 3rd edition. Prentice Hall, Addison Wesley Longman, Ltd. Singapore. Joshi, U.H., T.H. Ganatra, P.N. Bhalodiya, T.R. Desai, dan P.R. Tirgar. 2012. Comparative Review on Harmless Herbs with Allophathic Remedies As Anti-Hypertensive. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. hlm: 679. Lightner, D. V. 1996. A handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for diseases of Rouge, Louisiana, USA. pp. 29–34. cultured penaeid shrimp. Mousir, Kang. (2012). Biologi Sel dan Molekuler. Blog Karakteristik Virus Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor (ID): IPB Press. Newton, C.R. and A. Graham. (1994). PCR. Bios Scientific Publishers Limited, Oxford Supamattya, K. R. Hoffmn, S. Boonyaratpalin. (1996). Transmission Red And White Spot Disease (Basiliform Virus) From Black Tiger Shrimp Panaeus monodon to Portunid Crab Portunas pelagicus and Krill Acetes sp. Coference on the culture of Panaed Prawn And Shrimp. Book of abstracts, SEAFDEC/AQD. Hoilo City. Philiphines. Sambrook J, Fritsch F, Miniatis T. 1989. Molecular Cloning Laboratory Manual. 3rd edition. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory Pr.



Suyanto, dan Takarina. (2009). Panduan Budidaya Udang Windu. Penebar Swadaya: Jakarta. Suyanto. S.R dam A. Mudiman. (1999). Budidaya Udang Windu. Penebar Swadaya: Jakarta. Vierstraete, A. 1999. Principle of the PCR. 1999. Tersedia dari : http://users.ugent.be/~avierstr/principles/cr.html Diakses 21 September 2020. Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.



Lampiran 1. Proses Ekstraksi DNA



Menggerus sampel sampai halus



Pemberian protein K menggunakan mikropipet



Sampel di vortex selama 15 detik untuk menghomogenkan



Sampel di centrifuge dalam 8000 rpm dalam satu menit



Sampel dipindahkan pada collection tube yang baru.



Sampel diberikan 500µ buffer AW2



Lampiran 2. Amplifikasi DNA dan Elektroforesis



Kegiatan Amplifikasi DNA



Kegiatan Elektroforesis



Lampiran 4. Jurnal Harian Kegiatan PKL



FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS BORNEO TARAKAN Alamat: Jl. Amal Lama No.1 Kel. Pantai Amal Kecamatan Tarakan Timur, Kalimantan Utara JURNAL HARIAN KEGIATAN PKL Nama



: Chintia Nur Khasanah



Npm



: 18.401010.08



Prodi



: Akuakultur



Dosen Pembimbing



: Awaludin, S.Pi., M..Si,



Pembimbing Lapangan : D. Lia Lidayana S.St.Pi Tanggal, Waktu 04 Februari 2021 08.00 – 16.00



Nama Kegiatan Lapor dikantor BKIPM Tarakan



Rincian Kegiatan



diri Memperkenalkan diri kepada staf yang ada dikantor BKIPM Tarakan Diberitahukan kegiatan apa saja yang ada di BKIPM



Pemberian Pengarahan 1. Nekropsi/Pe mbedahan 2. Isolat Awal



Pengambilan organ hepatopankreas pada udang dan kepiting proses awal dalam pengujian bakteri dimana bakteri dari media pembawa berupa organisme sampel dibiakkan ke media tumbuh lalu selanjutnya diinkubas dengan suhu 36˚C± 1˚C selama 18-24 jam. untuk menumbuhkan bakteri tertentu.



Paraf Pembimbing Lapangan



05 Februari 2021



08.00 – 16.30 WITA



06 Februari 2021 10.00 – 13.00 WITA



Membersihkan ruang lab



Menyapu, mengepel Ruangan Laboratorium. Permurnian bakteri dilakukan dengan cara mengambil Pemurnian cawan petri yang telah Bakteri diinkubasi pada isolat awal. Untuk melihat bakteri apa saja yang tumbuh. Amati koloni bakteri yang tumbuh pada media TSA. Setelah itu bakteri dimurnikan ke media TSA dengan cara mengambil koloni bakteri menggunakan jarum ose yang sudah disterilkan dan diinokulasikan pada media TSA dengan cara menggoreskan jarum pada permukaan agar. Setelah itu diinkubasi selama ± 18-24 jam dalam suhu 36˚C. 1. Uji utama Uji Utama Bakteri adalah suatu cara atau perlakuan untuk mengidentifikasi bakteri berdasarkan sifat morfologi nya. Uji utama bakteri menggunakan berbagai macam media uji seperti TSIA, Gula-gula (Glukosa, Laktosa, Maltosa,Sukrosa dll), Urea, MIO (Motility, Indole, Omitin), OF (Oksidatif Fermentatif), dan Uji gram, uji katalase dan uji oksidase. 2. Pengecekan Mengecek apakah alat yang sterilisasi digunakan masih steril dan autoclave pada tidak tekontaminasi bakteri laboratorium dengan menggunakan stericorn



07 Februari2021



bioindikator Pembacaan hasil



10.00 – 13.00 WITA



08 februari 2021 08.00 – 16.00 WITA



09 februari 2021



08.00 – 16.00 WITA



Bersih-bersih



Silfat-sifat morfologi yang di dapatkan dari pengujian di catat di Lembar Hasil Uji Sementara (LHUS) dan kemudian dicocokkan menggunakan tabel Division Into Major Groups (Gram positive bacteria) dan (Gram negative bacteria) yang didalamnya memuat berbagai sifat bakteri yang sesuai dengan sifat bakteri hasil pengujian agar dapat diidentifikasi jenis bakteri yang tumbuh. Menyapu, ngepel Ruang lab dan lain-lain.



Nekropsi untuk uji bakteri 1. Pencarian dilakukan dengan cara sampel ikan membedah sampel dan nila mengambil organ target (oseochromis menggunakan pinset lalu niloticus) diletakkan di cawan petn 2. Nekropsi untuk selanjutnya digunakan pada ikan pada tahap isolat awal. nila 3. Pemeriksaan parasit pada ikan nila Menyapu seluruh ruangan di laboratorium. Membersihkan debu menggunakan kemoceng atuu lap kain. Bersih-bersih Membuang sampah yang ada pada masing-masing ruangan ke dalam kantong plastik untuk dibuang ke TPS. Mengepel lantai. Membersihkan peralatan



Pemusnahan bakteri



10 februari 2021 08.00 – 16.00 WITA



11 februari 2021



1.



Pemusn ahan



2.



laboratorium. Pemusnahan bakteri dengan mengautoclave selama 30 menit dengan suhu 121 oC. Alat-alat laboraturium tersebut ducuci dengan sabun cuci piring kemudian dibilas dengan desinfektan dan air bersih. Setelah itu dilakukan pengeringan dengan oven tetapi dibungkus terlebih dahulu dengan kertas hvs selama 20 menit dengan suhu 180oC. Pemusnahan, setelah di autoclave wadah seperti petridish dan tabung reaksi dicuci menggunakan sunlight dan wisol kemudian dibilas, dan dikeringkan pad arak piring, setelah itu dibungkus menggunakan kertas, dan di autoclave lagi selama 15 menit dalam suhu 121 ˚ C. Setelah itu dikeringkan menggunakan oven, dan terakhir yaitu diletakkan pada lemari alat.



Pembuat an media TSA Nacl sebanyak 200 ml. 3. Perhitun gan volume ruangan laboratorium untuk menentukan seberapa banyak penggunaan PK dan formalin yang nantinya dilakukan untuk Pengasapan laboratorium fumigasi. dengan gas fumigan untuk menghilangkan (mematikan) bakteri, virus, dan kontaminan lainnya. Fumigasi



12 februari 2021



Fumigasi



Pengasapan laboratorium dengan gas fumigan untuk menghilangkan (mematikan) bakteri, virus, dan kontaminan lainnya.



13 Februari 2021



Fumigasi



Pengasapan laboratorium dengan gas fumigan untuk menghilangkan (mematikan) bakteri, virus, dan kontaminan lainnya.



14 Februari 2021



Fumigasi



Pengasapan laboratorium dengan gas fumigan untuk menghilangkan (mematikan) bakteri, virus, dan kontaminan lainnya. Bimbingan judul dengan pembimbing lapangan



09.00 WITA



15 Februari 2021



08.00 – 16.00 WITA



Bimbingan Judul PKL Apel Pagi



Melakukan apel pagi seperti biasa pada pagi hari di hari Senin, dengan tujuan untuk memberikan informasi mengenai BKIPM, dan tugastugas serta informasi terkini. Pemusnahan Pemusnahan, setelah di media yang autoclave wadah seperti telah digunakan petridish dan tabung reaksi pada uji bakteri dicuci menggunakan sunlight dan wisol kemudian dibilas, dan dikeringkan pad arak piring, setelah itu dibungkus



16 Februari 2021 08.00 – 16.00 WITA



Bersih-bersih



menggunakan kertas, dan di autoclave lagi selama 15 menit dalam suhu 121 ˚ C. Setelah itu dikeringkan menggunakan oven, dan terakhir yaitu diletakkan pada lemari alat. Menyapu seluruh ruangan di laboratorium. Membersihkan debu menggunakan kemoceng atuu lap kain.Membuang sampah yang ada pada masing-masing ruangan ke dalam kantong plastik untuk dibuang ke TPS. Mengepel lantai. Membersihkan peralatan laboratorium. Mengikuti kegiatan di laboratorium Menyapu dan mengepel lantai ruang organoleptic, setelah itu pengisian laporan score sheet.



17 Februari 2021 08.00 - 16.00 WITA



Pembersihan ruang



18 Februari 2021 08.00 – 16.00 WITA



Kalibrasi mikropipet



Untuk mengetahui apakah mikropipet masih layak digunakan dengan mengukur berat air pertetes yang diambil menggunakan mikropipet.



19 Februari 2021



Pembuatan media TSA, TCBS, Laktosa, Sorbitol, Maltose



Media tumbuh adalah tempat bakteri berkembang biak berupa media tempat hidup yang terdiri dari nutrien yang menyediakan nutrisi berupa makanan bagi bakteri dan



08.00 – 16.30 WITA



organoleptik Pengisian lembar score sheet



20 Februari 2021 10.00 – 13.00 WITA



21 Februari 2021 22 Februari 2021 08.00 – 16.00 WITA 23 Februari 2021 08.00 – 16.00 WITA



Uji Organol



Libur piket Bersih-bersih lingkungan BKIPM Pemeriksaan akreditas BKIPM



Bersih-bersih



dimanfaatkan bakteri untuk berkembang biak / memperbanyak diri. Molekulmolekul nutrien in nantinya akan dimanfaatkan bakteri untuk membentuk komponen selnya sehingga dapat tumbuh menjadi koloni bakteri. TSA (Trypto Soy Agar/Triptikase Soya Agar) merupakan jenis media tumbuh non-selektif. TSA dibuat dengan cara menimbang bubuk TSA menggunakan timbangan analitik kemudian dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer bersih dan ditambahkan aquadest yang kemudian di-stirer dan dipanaskan menggunakan hotplate hingga homogen Pengujian terhadap kondisi fisik ikan segar pada jenis ikan dengan menggunakan penilaian score sheet ikan segar dimana pengujian tersebut bertujuan untuk mengetahui tingkat kesegaran ikandengan menggunakan indera sensori



Membersihakan bagian dalam maupun luar kawasan kantor, dengan menyapu dan mencabut rumput liar. Pemeriksaan akreditas BKIPM



Bersih-bersih



lingkungan



24 Februari 2021 08.00 – 16.00 WITA



25 Februari 2021 08.00 – 16.00 WITA



lingkungan BKIPM Bersih-bersih lingkungan BKIPM Pengambilan sampel 1. Nekropsi



BKIPM. Membersihakan bagian dalam maupun luar kawasan kantor, dengan menyapu dan mencabut rumput liar.



Pembedahan Kepiting bakau



Mencari parasit Octolasmis 2. Pemeriksaan sp yang biasanya hidup di Parasit tapis insang dan insang kepiting. Octolasmis sp berbentuk seperti kecambahdan dapat bergerak. Parasit akan tetap hidup jika organisme inangnya hidup, jika kepiting mati maka parasite ini juga akan mati. Parasite ini merupakan parasite yang umum dan sering menyerang kepiting diberbagai macam stadia dan dapat menyebabkan gangguan pernapasan pada kepiting. Isolat awal merupakan proses awal dalam pengujian bakteri 3.Isolat Awal dimana bakteri dari media pembawa berupa organisme sampel dibiakkan ke media tumbuh lalu selanjutnya diinkubasi untuk menumbuhkan bakteri tertentu yang selanjutnya akan diuji. Ekstraksi DNA merupakan proses pemisahan DNA dari 4.Ekstraksi komponen sel lainnya seperti DNA protein, karbohidrat, lemak dan lain-lain. Pembuatan TCBS yaitu



5.Pembuatan Media TCBS



26 Februari 2021 08.00 – 16.30 WITA



Pemurnian



27 Februari 2021



Uji Utama



10.00 – 13.00 WITA



28 Februari 2021 10.00 – 13.00 WITA



Pembacaan Hasil



timbang TCBS sebanyak 22 gram kemudian dimasukkan kedalam Erlenmeyer kemudian larutkan dengan aquades sebanyak 250 ml lalu masukkan magnet pengaduk lalu letakkan diatas hotplat kemudian homogenkan, setelah itu tuang media pada cawan petri lalu dinginkan menjadi agar TCBS. Pemurnian bakteri ini dilakukan untuk mendapatkan koloni bakteri yang benarbenar murni. Umumnya bakteri yang akan dimurnikan adalah bakteri yang koloninya terpisah dan tumbuh pada hasil goresan pada media tumbuh. Identifikasi bakteri ini meliputi uji biokimia antara lain: Gram (KOH), uji Katalase, uji Oksidase, uji O/F, uji Glukosa, sukrosa, laktosa, maltose, mannitol,dulcitol, sorbitol, uji MIO (motility dan ornithin), uji TSIA, uji VP, uji MR, uji Arginin, uji Lysine dekarbosilase, uji Simmon citrate Silfat-sifat morfologi yang di dapatkan dari pengujian di catat di Lembar Hasil Uji Sementara (LHUS) dan kemudian dicocokkan menggunakan tabel Division Into Major Groups (Gram positive bacteria) dan (Gram negative bacteria) yang didalamnya memuat



1 Maret 2021



Amplifikasi DNA



08.00 – 16.00 WITA



Elektroforesis



berbagai sifat bakteri yang sesuai dengan sifat bakteri hasil pengujian agar dapat diidentifikasi jenis bakteri yang tumbuh. Metode amplifikasi atau perbanyakan DNA pada suatu daerah target tertentu yang dibatasi oleh sepasang primer (primer forward dan primer reverse). DNA template dari sampel kepiting tadi dibawa ke ruang amplifikasi untuk selanjutnya di amplifikasi. DNA template, Go Taq green master mix, primer dan nuclease free water dimasukkan ke dalam PCR tube sesuai dengan takaran yang telah ditentukan untuk satu tube. Total campuran untuk sampel dalam satu PCR tube adalah 25 µl. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya yang ada di dalam sebuah medan listrik. a. Pembuatan agarose 1. Larutkan 1,2 gr Agarose dengan 10 ml TAE. 2. Panaskan pada microwave sampai larut. 3. Tuangkan kedalam cetakan yang sudah dilengkapi dengan sisir, diamkan sampai agarose mengeras. b. Running Gell



1. Pindahkan agarose kedalam tangka alat 2. Tuangkan TAE Buffer hingga menutupi permukaan agar , dan usahakan tidak terdapat gelembung pada bagian bawah gagar. 3. Masukkan bahan pada sumur yang sudah terbentuk, tidak boleh keluar dari sumur. 4. Setelah selesai masukkan bahan , tutup alat dengan pentutup yang sudah disediakan. 5. Masukkan konektor tangkai alat ke mesin sesuai dengan posisinya, lalu sambungkan dengan power supplay dengan listrik. 6. Atur pada angka 100 V dana tur timer 45-60 menit , lalu tekan tombol “RUN”. 7. Buka penutup alat tangkai, kemudian lepaskan tangkai dari mesin. c. Visualisasi DNA 1. Letakkan Gell yang telah dielektroforesis tersebut pada UV Transmilator, kemudian atur pembesaran dan focus kamera untuk akurasi foto.



2. Dokumentasi gambar Gell. Cetak gambar menggunakan print . 2 Maret 2021 08.00 – 16.00 WITA 3 Maet 2021 08.00 – 16.00 WITA



4 Maret 2021



5 Maret 2021 08.00 – 16.30 WITA



Pemberian materi organol Pemberian materi mengenai oleh pihak Oranoleptik. karantina. Bersih-bersih Menyapu seluruh ruangan di laboratorium. Membersihkan debu menggunakan kemoceng atuu lap kain. Membuang sampah yang ada pada Pengisian masing-masing ruangan ke lembar score dalam kantong plastik untuk sheet. dibuang ke TPS. Mengepel lantai. Membersihkan peralatan laboratorium. Bersih-bersih Menyapu seluruh ruangan di laboratorium. Membersihkan debu menggunakan kemoceng Mengikuti atau lap kain. Membuang Kegiatan sampah yang ada pada Laboratorium masing-masing ruangan ke dalam kantong plastik untuk dibuang ke TPS. Mengepel lantai. Senam pagi Senam Bersama staff BKIPM Bersih - bersih Menyapu dan mengepel Ruang Laboratorium.



6 Maret 2021 10.00 – 13.00 WITA



Pengujian Organoleptik



Pengujian terhadap kondisi fisik ikan segar pada jenis ikan dengan menggunakan penilaian score sheet ikan segar dimana pengujian tersebut bertujuan untuk mengetahui tingkat kesegaran ikandengan menggunakan indera sensori.



7 Maret 2021 Libur piket 8 Maret 2021 08.00 – 16.00



9 Maret 2021 08.00 – 16.00 WITA



Bersih – bersih Membersihakan bagian Lingkungan dalam maupun luar kawasan BKIPM. kantor, dengan menyapu dan mencabut rumput liar. Pembersihan ruang Menyapu, ngepel ruangan. organoleptic



Pengisian lembar score Pengisian sheet. sheet 23 Maret 2021 14.00 – 16.00 WITA



Presentasi



laporan



score



Pertanggung jawaban setelah melalukan Praktik Kerja Lapang di BKIPM Tarakan Mengetahui, Pembimbing PKL



Awaludin, S.Pi., M..Si. NIDN. 0021089001