Makalah Spektroskopi Fluoresensi [PDF]

Citation preview

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Sejarah mengatakan bahwa bentuk spektroskopi mengacu pada cabang ilmu sains dimana cahaya seperti radiasi sinar tampak dipisahkan dalam komponen dengan beberapa panjang gelombang dan menghasilkan spektrum, kemudian diplotkan sebagai fungsi intensitas radiasi terhadap panjang gelombang atau frekuensi. Sekarang, keberadaan spektroskopi sudah meluas tidak hanya meliputi sinar tampak, melainkan radiasi elektromagnetik lainnya. Seperti radiasi sinar x, ultra violet, inframerah, gelombang pendek (microwave), frekuensi radio. Tentu saja tidak termasuk di dalamnya teknik radiasi elektromagnetik misalnya spektroskopi akustik, spektroskopi massa, dan spektroskopi elektron (Wahab, 2014). Spektroskopi umumnya digunakan dalam kimia fisik dan kimia analisis untuk mengidentifikasi suatu substansi melalui spektrum yang dipancarkan atau yangdiserap. Alat untuk merekam spektrum disebut spektrometer. Spektroskopi jugadigunakan secara intensif dalam astronomi dan penginderaan jarak jauh. Kebanyakanteleskop-teleskop besar mempunyai spektrograf yang digunakan untuk mengukurkomposisi kimia dan atribut fisik lainnya dari suatu objek astronomi atau untuk mengukur kecepatan objek astronomi berdasarkan pergeseran  Doppler  garisgarisspektral. Salah satu jenis spektroskopi adalah spektroskopi fluoresensi atom (AFS). Spektroskopi fluoresensi merupakan metode spektroskopi yang mengamati intensitas atau spektrum fluoresensi sinar pada suatu zat yang dikenai cahaya. Spektroskopi fluoresensi yang mengunakan Kamera CCD (Charged Couples Devices) atau CMOS (Complementary Metallic Oxide Semiconductor) sering disebut Pencitraan Fluoresensi (Fluorescence Imaging) (Ekayani dan Minarni, 2015). Menurut Lemboumba, 2006, Fluoresensi merupakan salah satu proses yang terjadi ketika cahaya berinteraksi dengan suatu materi, dimana ketika atom atau partikel menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu akan memancarkan kembali cahaya dengan panjang gelombang yang lebih besar. Fluoresensi terjadi karena adanya sifat dari partikel yang akan langsung memancarkan cahaya ketika



memperoleh rangsangan cahaya dari luar, namun pancaran tersebut akan hilang ketika rangsangan cahaya dari luar dihilangkan. Spektroskopi fluoresensi dapat diaplikasikan ke berbagai jenis sampel baik dalam bentuk larutan maupun padatan (Ekayani dan Minarni, 2015). 1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang diatas adapun rumusan masalah dari makalah ini yaitu: 1. Apakah yang dimaksud dari fluorisensi ? 2. Bagaimanakah prinsip dan kegunaan fluorusensi ? 3. Apa sajakah aplikasi dari fluorisensi ? 1.3 Tujuan Penulisan Adapun tujuan dari penulisan makalah ini yaitu: 1. Mengetahui apa yang dimaksud dari fluorisensi ? 2. Mengetahui prinsip dan kegunaan fluorusensi ? 3. Mengetahui aplikasi dari fluorisensi ?



4



BAB II PEMBAHASAN



2.1 Fluoresensi Fluoresensi adalah emisi cahaya setelah penyerapan sinar ultraviolet (UV) atau cahaya tampak oleh molekul fluoresensi atau substruktur disebut fluorophore. Dengan demikian, fluorophore menyerap energi dalam bentuk cahaya pada panjang gelombang spesifik dan membebaskan energi dalam bentuk cahaya yang dipancarkan pada panjang gelombang yang lebih tinggi. Fluoresensi molekuler diukur dengan menarik sampel pada panjang gelombang serapan, juga disebut panjang gelombang eksitasi, dan mengukur emisi lebih lama panjang gelombang yang disebut panjang gelombang



emisi



atau



fluoresensi.



Misalnya



berkurang



bentuk



koenzim



nicontinamide adenine dinucleotide (NADH) menyerap radiasi pada 340 nm, dan molekul memancarkan radiasi fotoluminesen dengan maksimum emisi pada 465 nm. Biasanya emisi fotoluminesensi diukur pada sudut kanan ke sinar datang untuk menghindari mengukur radiasi datang. Emisi berumur pendek yang terjadi disebut fluoresensi, sementara luminescence yang lebih tahan lama disebut phosphorescence (Skoog Dkk, 1996). Komponen-komponen yang penting sekali dari suatu instrumen untuk pengukuran fluoresensi ditunjukkan dalam bagan. Perhatikan bahwa komponen (sumber, monokromator, dan sebagainya, yang sama terdpat juga dalam spektrofotometer. Namun, perhatikan bahwa ada dua monokromator dan bahwa pancaran sampel dimonitor oleh detektor dengan arah 90 °C terhadap berkas pengeksitasi. (Instrumen yang sebenarnya dapat memiliki bentuk luar yang agak 5



berbeda daripada bentuk bagian dalam lewat penggunaan cermin-cermin untuk mengirim berkas-berkas ke arah yang menghemat ruang, namun konfigurasi tegak lurus itu dipertahankan pada sel sampel). Alat bantu seperti lensa-lensa untuk meneruskan radiasi pengeksitasi dan radiasi terpancar agar efisien lewat sistem, tidaklah ditunjukkan dalam gambar itu dan motor penggerak monokromator penyusur juga dihilangkan (Skoog Dkk, 1996). Sumber



Monokromator atau filter



Sampel



Monokromator atau filter



Detektor



Penguat



Pembacaan



2.2 Aplikasi Spektroskopi Fluoresensi Spektroskopi fluoresensi adalah metode yang cepat dan sensitif untuk mengkarakterisasi lingkungan dan kejadian molekuler. Spektroskopi fluoresensi adalah jenis spektroskopi elektromagnetik yang menganalisa fluoresensi dari sampel. Ada sejumlah senyawa yang relatif kecil yang memiliki karakteristik fluoresensi seperti hidrokarbon aromatik. Hal ini telah memberi kontribusi pada penggunaan spektroskop dengan sukses dalam mendeteksi banyak senyawa organik, banyak zat aktif aromatik dalam obat-obatan di bidang penelitian bahan kimia, biokimia, dan analisis medis senyawa organik. Spektroskopi fluoresensi mungkin merupakan alat diagnostik dan penelitian unggulan yang sangat baik di bidang mikrobiologi medis dengan sensitivitas dan spesifisitas tinggi (Naresh, 2014). 6



Fluoresensi adalah penyerapan energi cahaya oleh molekul pada satu panjang gelombang dan beremisi langsung pada gelombang lain yang biasanya lebih panjang. Senyawa fluoresen memiliki dua spektrum karakteristik: spektrum eksitasi (panjang gelombang dan jumlah cahaya yang diserap) dan spektrum emisi (panjang gelombang dan jumlah cahaya yang dipancarkan) (Naresh, 2014). Tidak ada dua senyawa yang memiliki tanda fluoresensi yang sama. Prinsip inilah yang menjadikan fluorometri sebagai teknik analisis yang sangat spesifik. Fluorometri adalah pengukuran fluoresensi. Instrumen yang digunakan untuk mengukur fluoresensi disebut fluorometer atau fluorimeter. Sebuah fluorometer menghasilkan panjang gelombang cahaya yang dibutuhkan untuk mengeksitasi analit yang secara selektif mentransmisikan panjang gelombang cahaya yang dipancarkan, kemudian mengukur intensitas cahaya yang dipancarkan. Cahaya yang dipancarkan sebanding dengan konsentrasi analit yang diukur. Fluorometer menggunakan monokromator (spektrofluorometer), filter optik (filter fluorometer), atau sumber cahaya pita sempit seperti LED atau laser untuk memilih eksitasi dan panjang gelombang emisi. Fluorometri dipilih karena kepekaannya yang luar biasa, spesifisitasnya yang tinggi, kesederhanaan, dan biaya rendah dibandingkan dengan teknik analisis lainnya. Fluorometri biasanya lebih sensitif daripada pengukuran absorbansi. Ini adalah teknik yang diterima secara luas dan kuat yang digunakan untuk berbagai diagnostik lingkungan, industri, medis, sekuensing DNA, forensik, analisis genetika, dan aplikasi bioteknologi (Naresh, 2014).



7



Instrumentasi



Gambar 1. Diagram fluorimeter Diagram fluorimeter khas ditunjukkan pada Gambar 1. Terdiri dari lampu xenon bebas ozon yang kontinyu, menghasilkan rangkaian cahaya nampak dan ultra violet, monokromator untuk memilih panjang gelombang yang diperlukan untuk eksitasi, kompartemen sampel, dan monokromator yang dilengkapi dengan tabung photomultiplier



(PMT) untuk menganalisa



sinyal fluoresensi. Kisi dalam



monokromator eksitasi dan emisi dapat mendispersikan cahaya dari 200 sampai 900 nm. Pintu masuk dan celah keluar setiap monokromator mengendalikan intensitas dan panjang gelombang cahaya yang menyebar. Penerangan dari lampu Xenon dikumpulkan oleh cermin elips dan diarahkan ke celah pintu masuk monokromator eksitasi. Monokromator eksitasi secara selektif membawa panjang gelombang cahaya tereksitasi yang sempit yang akan mengenai sampel. Sebagian cahaya akan diserap oleh sampel, dan beberapa molekul dalam sampel akan berpendar. Cahaya emisi yang dipancarkan memasuki monokromator emisi, yang diposisikan pada sudut 90 dengan jalur cahaya eksitasi untuk meminimalkan risiko penularan atau pantulan cahaya tercermin mencapai detektor. Cahaya yang dipancarkan ditransmisikan dalam kisaran sempit yang berpusat pada panjang gelombang emisi yang ditentukan dan keluar melalui celah yang dapat disesuaikan, dan akhirnya mengenai detektor. Sinyal itu diperkuat dan menghasilkan tegangan yang proporsional dengan intensitas emisi yang terukur (Khopkar, 1990).



8



1.



Wadah nano protein Enkapsulasi Aromatik Polisiklik Hidrokarbon Hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) adalah racun, mutagenik, dan di



antara bahan kimia yang paling merusak. Senyawa yang berkaitan dengan organisme hidup. Karena ketekunan dan pemindahan distribusi yang luas dari lingkungan merupakan tantangan penting. Di sini penulis melaporkan matriks wadah Nano baru berdasarkan RHCC-Nanotube (RHCC-NT) yang berasal dari laut dalam, yang dengan cepat dan istimewa mengikat rendah PAH berat molekul. Dalam kondisi laboratorium yang terkendali dan menggunakan spektroskopi fluoresensi di kombinasi dengan kristalografi sinar-X dan simulasi MD, penulis mengukur ikatan waktu-nyata yang rendah PAH berat molekul (2-4 dering) ke substrat penulis. Koefisien pengikat berkisar antara 5,4 ± 1,6 (fluorene) hingga 32 ± 7,0 M (acenaphthylene) dan kapasitas pengikatan 85 pmol PAH per mg RHCC-NT, atau 2,12 μmol dalam sampler 25 mg standar. Tingkat penyerapan piren dihitung menjadi 1,59 nmol / jam RH mol RHCC-NT (pada 10 C). Hasil penulis jelas menunjukkan bahwa RHCC-NT secara unik cocok sebagai matriks pemantauan untuk rendah PAH berat molekul (McDougall dkk, 2018).



Gambar 2. Spektrum emisi fluoresensi (λ exc = 275 nm) dari 4 µM Naphthalene di berbagai RHCC-NT konsentrasi. Maksimal diberikan pada 350 nm untuk menghilangkan kontribusi dari fluoresensi tirosin hadir dalam RHCC-NT. Celah diatur ke 1 nm. Inset menunjukkan fraksi ikatan Naftalena yang diplot sebagai fungsi konsentrasi RHCC-NT. 9



Studi



pemantauan



fluoresensi



dan



konstanta



yang



mengikat.



Tes fluoresensi digunakan untuk memeriksa pengikatan RHCC-NT untuk PAH karena mereka memungkinkan diskriminasi antara PAH dalam solusi dan mereka yang terikat RHCC-NT, serta kemampuan untuk memantau penggunaan PAH sebagai fungsi waktu. Ini dimungkinkan karena efek polaritas ditunjukkan oleh banyak fluorofor, di mana perubahan polaritas lingkungan terdekat dari hasil fluorofor dalam perubahan intensitas atau posisi puncak dalam spektrum fluoresensi; kapasitas- Ity dari RHCC-NT untuk mengikat PAH diperiksa oleh perubahan dalam spektrum fluoresensi PAH sebagai fungsi dari meningkatkan konsentrasi nanotube. Titrasi RHCC-NT ke dalam larutan naftalena menghasilkan peningkatan hasil kuantumnya konsisten dengan pergerakan naftalena ke lingkungan polaritas yang lebih rendah. Ini flu data rescence kemudian bisa cocok dengan Persamaan ( 1 ), menghasilkan konstanta pengikatan untuk naftalena Kd = 17 ± 1,4 μM (Ara. 2 ). Harus dicatat bahwa RHCC-NT juga berfluoresensi ketika tereksitasi pada 275 nm; oleh karena itu, itu diperlukan untuk mengoreksi kontribusi ini dalam analisis yang mengikat. Untuk meminimalkan kontribusi dari tirosin fluoresensi, emisi fluoresensi pada 350 nm digunakan untuk menentukan afinitas ikatan naphthalene ke RHCC-NT. Pendekatan yang diuraikan di atas diterapkan pada analisis molekul rendah lainnya data fluoresensi PAH berat, namun, panjang gelombang eksitasi lebih dari 275 nm tersedia untuk interferensi PAH dan RHCC-NT yang tersisa diminimalkan (untuk panjang gelombang eksitasi mengacu pada Metode). Meskipun fenantrena, fluoranthene, dan benzena antrasena juga diuji, mereka tidak menunjukkan perubahan fluoresensi tergantung konsentrasi. Dimensi maksimum dari senyawa ini dan hidrofobisitas tidak berbeda secara signifikan dari PAH MW rendah lainnya yang diperiksa, namun mereka menunjukkan tingkat simetri yang lebih rendah. Secara umum, distribusi elektron dalam orbital π memiliki efek signifikan pada 10



afinitas RHCC-NT untuk PAH yang secara struktural serupa. Sedangkan acenaphthene menghasilkan nilai K d- nilai 8,9 ± 1,8 μM, acenaphthylene terikat secara signifikan lebih lemah (K d = 32 ± 7,0 M) (Tabel 1 ). Naphthalene, yang menarik perhatian sehubungan dengan toksisitas, mengikat dengan K d dari 17 ± 1,4 μM. Hasil ini menunjukkan bahwa RHCC akan sangat bermanfaat sebagai media pengambilan



sampel



pasif,



untuk



pengikatan



PAH



simetris



2–4



cincin.



Memperkenalkan gugus alkil ke struktur PAH induk akan memengaruhi simetri dan lipofilisitas 10 , yang juga dapat berdampak mengikat pada Matriks RHCC.



Gambar 3. Penyerapan skala waktu piren oleh RHCC-NT. ( a ) Spektrum emisi fluoresensi (λ exc = 334 nm) dari 2 µM pyrene diukur dengan adanya 70 µM RHCC pada awal percobaan (garis putus-putus-Waktu 0) dan setelah 75 jam (garis padat) ketika reaksi mencapai kesetimbangan penuh. Maksimal ditugaskan di 384 nm. Celah diatur ke 1 nm. ( B ) maksimum emisi fluoresensi pada 384 nm diukur selama Eksperimen diplot sebagai fungsi waktu untuk menunjukkan pengambilan pirena yang bergantung waktu oleh RHCC-NT Menggunakan teknik pemeriksaan fluoresensi, kristalografi sinar-X, dan Simulasi Dinamika Molekuler yang penulis miliki menunjukkan bahwa RHCC-NT dapat mengikat PAH MW rendah dengan waktu kesetimbangan rendah dan selektivitas tinggi. Untuk pengetahuan penulis, ini adalah studi pertama yang menunjukkan bahwa wadah Nano yang mengandung protein dapat merangkum PAH. Itu rongga RHCC-NT berbentuk ellipsoidal dengan volume ~ 380 Å 3 dan memungkinkan penyerapan PAH hingga Ukuran 4 cincin, sementara ikatan tidak



11



terdeteksi untuk sistem PAH cincin 5 atau lebih tinggi. Ini menunjukkan bahwa ecules mungkin terlalu besar untuk masuk ke dalam rongga (McDougall dkk, 2018). Sebagai kesimpulan, penulis telah berhasil mempelajari enkapsulasi unik PAH MW rendah dalam wadah Nano archaea RHCC-NT. Seperti yang ditunjukkan dalam penelitian terbaru, rongga berukuran besar dari RHCC-NT tidak hanya mampu menyimpan mahkota elemen S8 sulfur 9 , namun wadah Nano juga dapat mengurangi dan menyimpan kelompok logam metalik 23 . Selain itu, RHCC-NT dapat dilihat sebagai matriks berbasis protein baru untuk menghilangkan PAH dan logam berat (McDougall dkk, 2018). Fraksi PAH yang diikat dan konsentrasi RHCC-NT yang tidak terikat ditentukan berdasarkan pada persamaan berikut: 1



di mana F adalah sinyal fluoresensi eksperimental dari setiap sampel, F ∞ adalah fluoresensi PAH pada infinite konsentrasi protein, F0 adalah fluoresensi PAH bebas dalam larutan, Bmaks adalah konstan dan sama dengan 1. Y nilai-nilai yang diperoleh diplot sebagai fungsi konsentrasi RHCC bebas (McDougall dkk, 2018). 2.



Validasi Metode Analisis Ofloksasin dalam Plasma In Vitron secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi-Fluoresensi Mengacu pada European Medicines Agency Guideline Ofloksasin merupakan salah satu antibiotika golongan fluorokuinolon



generasi kedua. Konsentrasi ofloksasin dalam plasma kecil, sehingga diperlukan metode analisis yang selektif, akurat, dan sensitif. Pada penelitian ini, dilakukan optimasi dan validasi metode analisis ofloksasin dalam plasma in vitro menggunakan 12



kromatografi cair kinerja tinggi deteksi fluoresensi dengan siprofloksasin HCl sebagai baku dalam. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan kolom C18 (Waters, SunfireTM 5 μm; 250 x 4,6 mm) dengan fase gerak isokratik yang terdiri dari trietilamin 1% dalam air pH 3,0–asetonitril (84:16), laju alir 1,0 mL/menit, suhu kolom 40oC, dan deteksi ofloksasin dilakukan pada panjang gelombang eksitasi 300 nm dan emisi 500 nm. Proses ekstraksi plasma dilakukan dengan metode pengendapan protein menggunakan metanol melalui proses vorteks selama 2 menit dan sentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 10 menit. Validitas dan linearitas metode analisis berada pada rentang konsentrasi 21,4 ng/mL – 4280 ng/mL dengan LLOQ 21,4 ng/mL. Nilai % diff dan koefisien variasi untuk akurasi dan presisi intra hari dan antar hari tidak lebih dari + 20% untuk konsentrasi LLOQ dan + 15% untuk konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi. Ofloksasin dalam plasma dinyatakan stabil selama 3 siklus beku dan cair, stabil minimal 24 jam pada suhu kamar dan selama minimal 28 hari pada suhu -20oC. Metode analisis ofloksasin dalam plasma ini sudah memenuhi kriteria penerimaan sesuai persyaratan validasi pedoman EMEA. Beberapa metode kromatografi cair dengan spektrometri massa UV-Vis, dan fluoresensi dapat digunakan untuk analisis ofloksasin dalam plasma. Penggunaan kromatografi cair dengan spektrometri massa memerlukan peralatan yang canggih, ketelitian yang tinggi serta bahan yang cukup mahal, sedangkan kromatografi cair dengan spektrofotomer UV-Vis kurang sensitif dan selektif untuk menganalisis ofloksasin dalam konsentrasi kecil. Oleh karena itu, kromatografi cair kinerja tinggi dengan spektrofotometer fluoresensi yang lebih sensitif dan selektif digunakan pada penelitian ini (Tania dkk, 2016). Analisis ofloksasin dilakukan dengan menggunakan detektor fluoresensi pada panjang gelombang eksitasi 300 nm dan emisi 500 nm. Selanjutnya, nilai area, waktu



13



retensi (tR), resolusi (R), tailing factor (Tf), jumlah lempeng teoritis (N) dan Height Equivalent to a Theoritical Plate (HETP) dicatat (Tania dkk, 2016). Peralatan yang digunakan meliputi kromatografi cair kinerja tinggi (Shimadzu, LC-20AD VP) yang terdiri dari pompa, autosampler (Prominence, SIL20A), kolom C18 (Waters, SunfireTM 5 μm; 250 x 4,6 mm), detektor fluoresensi (Shimadzu RF-10A XL), dan pengolah data pada komputer. Bahan yang digunakan meliputi ofloksasin (USP), siprofloksasin HCl (USP), metanol HPLC grade (Merck), asetonitril HPLC grade (Merck), aquabidestilata (Ikapharmindo), asam fosfat 85% analytical grade (Merck), trietilamin (Merck), plasma darah (Palang Merah Indonesia) (Tania dkk, 2016). Analisis ofloksasin diperoleh kondisi optimum dengan menggunakan kolom C18 SunfireTM (5μm, 250 x 4,6 mm) suhu 40°C; fase gerak trietilamin 1,0% dalam air − asetonitril (86:14); pH 3,0; laju alir 1,0 mL/menit; dan dideteksi dengan detektor fluoresensi pada panjang gelombang eksitasi 300 nm dan 500 nm. Nilai statistik yang didapat mulai dari nilai area, waktu retensi (tR), resolusi (R), tailing factor (Tf), jumlah lempeng teoritis (N) dan Height Equivalent to a Theoritical Plate (HETP) pada kondisi optimum memenuhi syarat metode analisis(Tania dkk, 2016).



Gambar 4. Kromatogram uji kesesuaian sistem ofloksasin Kurva kalibrasi terdiri dari blangko plasma (plasma tanpa analit dan baku dalam), sampel zero (plasma dengan baku dalam) serta plasma non-zero (plasma 14



dengan analit dan baku dalam) sebanyak 8 konsentrasi yaitu 21,40 ng/mL, 53,50 ng/mL, 107,0 ng/mL, 214,0 ng/ mL, 535,0 ng/mL, 1070,0 ng/mL, 2140,0 ng/mL, dan 4280,0 ng/mL. Nilai % diff dari hasil konsentrasi pengukuran tidak boleh menyimpang lebih dari + 15%, kecuali untuk LLOQ tidak menyimpang lebih dari +20%. Selama proses validasi metode minimal harus didapatkan 3 kurva kalibrasi. Berdasarkan perhitungan statistik, dihasilkan persamaan regresi linear yaitu y = 0,0012x+0,0532 dengan koefisien korelasi (r) = 0,9999 dimana x berupa konsentrasi sampel dan y berupa PAR (peak area ratio) antara respon area analit dengan baku dalam. Kurva kalibrasi antar hari masih memenuhi syarat linearitas dan presisi yang baik dimana nilai r yang diperoleh mendekati 1 dan nilai KV pada konsentrasi LLOQ dan pada konsentrasi lainnya berada dalam rentang yang memenuhi syarat .



Gambar 5. Grafik kurva kalibrasi ofloksasin dalam plasma Kondisi optimum untuk analisis ofloksasin dalam plasma in vitro dengan siprofloksasin HCl sebagai baku dalam secara KCKT-fluoresensi menggunakan kolom C18 (Waters, SunfireTM 5 μm; 250 x 4,6 mm); fase gerak trietilamin 1% dalam air – asetonitril (84:16); pH 3,0; laju alir 1,0 mL/menit; suhu kolom 40ºC, dan dideteksi pada panjang gelombang eksitasi 300 nm dan emisi 500 nm. Pada proses optimasi ekstraksi ofloksasin dalam plasma, hasil ekstraksi optimum ditunjukkan dengan perbandingan antara jumlah metanol dengan plasma yaitu 1:1, waktu vorteks 15



2 menit, dan proses sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Hasil validasi menunjukkan bahwa metode bioanalisis yang digunakan sudah memenuhi kriteria akurasi, presisi, linearitas, selektivitas, carry over, integritas pengenceran, dan stabilitas sesuai dengan ketentuan yang terdapat dalam European Medicines Agency Guideline (2011), sehingga dapat digunakan untuk analisis ofloksasin dalam plasma manusia (Tania dkk, 2016). 3.



Spektroskopi Fluoresensi pada Interaksi antara Albumin Evodiamine dan Bovine Serum Interaksi evodiamine (Evo) dengan albumin serum sapi (BSA) pada dua suhu



yang berbeda (298 dan 310 K) adalah diselidiki dengan spektroskopi fluoresensi. Hasil eksperimen menunjukkan bahwa Evo berikatan dengan BSA melalui pendinginan statis prosedur dengan konstanta asosiasi dari 1,61 × 10 6 L / mol pada 298 K dan 6,78 × 10 5 L / mol pada 310 K. Jumlah evo terikat molekul per protein adalah 1,31 pada 298 K dan 1,33 pada 310 K. hasil menunjukkan bahwa Evo bereaksi dengan BSA terutama melalui hidrofobik dan interaksi elektrostatik, dan itu tidak mengubah sifat hel-heliks dari BAS (Tan dkk, 2014).. BSA terdiri dari tiga yang tersusun secara linear, secara struktural subdomain homolog. Ia memiliki dua residu triptofan itu memiliki domain intrinsik, dan setiap domain pada gilirannya adalah domain produk dari dua fluoresensi: Trp134, yang terletak di permukaan subdomain IB, dan Trp212, cari di dalam kantong pengikat hidrofobik dari subdomain IIA. Ini mengikat situs BSA untuk ligan endogen dan eksogen mungkin ada di domain-domain ini. Pendinginan fluoresensi dianggap sebagai metode untuk mengukur afinitas yang mengikat. Pendinginan fluoresensi adalah penurunan hasil kuantum fluoresensi dari fluo- rophore disebabkan oleh 16



berbagai interaksi molekul dengan molekul quencher [11, 12]. Oleh karena itu, menarik untuk digunakan pendinginan fluoresensi BSA tryptophan intrinsik. Spektrum fluoresensi sinkron menunjukkan residu Trp dari BSA hanya pada interval panjang gelombang Δ𝜆 60 nm dan Tyr residu BSA hanya pada Δ𝜆



dari 15 nm. Fluoreskronik sinkron- Spektrum cence dari BSA-Evo ditunjukkan



pada Gambar 3. Jelas bahwa intensitas residu Trp atau Tyr berkurang dalam Kehadiran Evo. Namun, posisi puncak emisi Trp atau residu Tyr tidak menunjukkan perubahan signifikan, menunjukkan hal itu polaritas di sekitar residu Trp atau Tyr tidak dapat diubah. Jadi, Evo tidak jelas mempengaruhi konformasi hel-heliks dari BSA (Tan dkk, 2014)..



Gambar 6.Spektrum emisi BSA dengan berbagai jumlah Evo pada 298 K (a) dan 310 K (b 𝐶BSA (𝜇M): 10, 𝐶Evo (𝜇𝜇M):4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, dan 36.



Gambar 7.Spektrum fluoresensi sinkron BSA dengan berbagai jumlah Evo, (a) Δ𝜆= 15nm, (b) Δ𝜆= 60nm. BSA ( M): 10 dan Evo ( M): 4, 8, 12, 16, 20, 24, dan T=298 K.



17



Tingkat transfer energi tergantung pada tingkat tumpang tindih BSA, spektrum emisi donor dengan akseptor spektrum penyerapan, orientasi relatif dari donor dan



dipol



transisi



akseptor,



dan



jarak



antara



molekul-molekul



(Tan dkk, 2014)..



Gambar 8. tumpang tindih antara spektrum emisi fluoresensi BSA (1) dan spektrum serapan UV Evo (2), 𝐶BSA = 𝐶Evo =10𝜇M, 𝑇=298 K.



Tabel 1. nilai-nilai yang dihitung dari 𝐽, 𝑟, 𝑅0, dan 𝐸 dari BSA dengan Evo, 𝑅 adalah koefisien korelasi. di mana faktor orientasi spasial dipol hasil kuantum fluoresensi donor 𝜑=0,15. bisa dievaluasi dengan tumpang tindih spektrum serapan UV akseptor dengan spektrum emisi fluoresensi donor. adalah diberikan oleh persamaan berikut:



2 Tumpang tindih antara spektrum emisi BSA dengan Spektrum serapan Evo ditunjukkan pada Gambar. Ditemukan bahwa nilai adalah 1,57 nm untuk Evo, yang kurang dari jarak rata-rata 2-8 nm antara donor dan akseptor, menunjukkan bahwa



18



transfer energi terjadi antara BSA dan Evo dengan kemungkinan besar (Tan dkk, 2014).. Kesimpulannya, mekanisme pendinginan fluoresensi dan Mode pengikatan evodiamine dengan albumin serum sapi diselidiki. Hasil percobaan menunjukkan hal itu Evo mengikat dengan BSA melalui prosedur pendinginan statis dengan asosiasiconstants dari 1,61 × 10 6 L / mol at298 K dan 6,78 × 10 5 L / mol pada 310 K. Jumlah molekul Evo terikat per protein adalah 1,31 pada 298 K dan 1,33 pada 310 K. hasil menunjukkan bahwa Evo tampaknya bereaksi dengan BSA terutama interaksi hidrofobik dan elektrostatik, dan itu tidak mengubah sifat -heliks dari BAS. Jarak (r) antara ligan (akseptor) dan BSA (donor) dalam protein adalah 1,57 nm untuk Evo, yang kurang dari jarak rata-rata 2-8 nm antara donor dan akseptor, yang menunjukkan energi transfer terjadi antara BSA dan Evo dengan kemungkinan besar. Nilai positif Δ 𝐻 dan Δ 𝑆 untuk Evo menunjukkan hal itu interaksi hidrofobik dan elektrostatis dapat dilibatkan asosiasi dan berkontribusi terhadap perubahan ini. Ini negatif Nilai ΔG menunjukkan bahwa interaksi Evo dengan BSA adalah sebuah proses spontan (Tan dkk, 2014). 4.



Studi Tentang Pengamatan Fluoresensi Berdasarkan Domain Panjang Gelombang Pada Spektroskopi Flouresensi Untuk Identifikasi Bahan Fluoresensi adalah proses pemancaran radiasi cahaya oleh suatu materi



setelah tereksitasi oleh berkas cahaya berenergi tinggi. Emisi cahaya terjadi karena proses absorbsi cahaya oleh atom yang mengakibatkan keadaan atom tereksitasi. Keadaan atom yang tereksitasi akan kembali keadaan semula dengan melepaskan energi yang berupa cahaya (deeksitasi). Fluoresensi merupakan proses perpindahan



19



tingkat energidari keadaan atom tereksitasi (S1 atau S2) menuju ke keadaan stabil (ground states) (Lubis dkk, 2016). Analisa kualitatif ,merupakan perbandingan speKtrum fluoresensi yang dapat membantu pengenalan senyawa atau bahan. Analisa kuantitatif merupakan pengukuran yang dapat dilakukan pada kadar yang sangat rendah dengan ketepatan, keterulangan, dan kepekaan tinggi. Misalnya pengukuran kadar vitamin E. Bila panjang gelombang emisi dan eksitasi telah dipilih, maka dapat dibuat hubungan antara intensitas fluoresensi dengan konsentrasi senyawa. Intensitas fluoresensi tergantung dari tingkat konsentrasi senyawa. Teknik analisis spektrofluorometri adalah termasuk salah satu tenik analisis instrumental disamping teknik kromatografi dan elektroanalisis kimia. Teknik tersebut memanfaatkan fenomena interaksi materi dengan gelombang elektromagnetik seperti sinar-x, ultraviolet, cahaya tampak dan inframerah [3]. Fenomena interaksi bersifat spesifik baik absorpsi maupun emisi. Interaksi tersebut menghasilkan signal-signal yang disadap sebagai alat analisis kualitatif dan kuantitatif. Contoh teknik spektroflourometri absorpsi adalah UV/VIS, inframerah (FT-IR) dan absorpsi atom (AAS). Sedang contoh spektrofluorometri emisi adalah spektrofluorometri nyala dan inductively coupled plasma (ICP), yang merupakan alat ampuh dalam analisis logam (Lubis dkk, 2016). Permasalahan jika menggunakan absorpticmetry adalah pengamatan untuk multi-componnent, dimana kemungkinan dua komponen yang berbeda menyerap panjang gelombang yang sama, sehingga kedua bahan tersebut tak dapat dipisahkan, sedangkan pada fluorometer sinyal fluorisensi dari kedua komponen tersebut pada proses identifikasi bahan tetap dapat dipisahkan. Melakukan studi pengamatan dan pengukuran fluoresensi berdasarkan domain panjang gelombang luminesensi dan



20



panjang gelombang eksitasi. Pada spektroscopi flouresensi untuk identifikasi bahan dengan metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah bahwa kebanyakan molekul organik dalam suatu pelarut jika disinari dengan cahaya dalam daerah uv atau visible akan berfluoresensi. Untuk pengukuran panjang gelombang luminesensi dilakukan sebanyak 1391 kali pengukuran untuk masing – masing el. Pengukuran panjang gelombang eksitasi dilakukan sebanyak 1986 kali pengukuran untuk masing – masing sampel (Lubis dkk, 2016).



Gambar 9. Spektrum Pengukuran Absorpsi Berdasarkan perhitungan energi, stokes shift, dan efisiensi quantum serta pembacaan peak intensitas terhadap panjang gelombang untuk sampel 3 ini maka diperoleh nilai yang pasti hingga dapat digunakan sebagai data acuan identifikasi bahan.Dari tiga sampel molekuler yang terdiri dari minyak zaitun, minyak cendana,dan minyak cem - ceman diperoleh hasil pengukuran sebagai berikut: Untuk minyak zaitun, diperoleh energi absorpsi ( E1 ) = 0,388.10-18 J dan energi eksitasi ( E2 ) sebesar 0,383 . 10 -18 J .panjang gelombang absorpsi ( ) = 512 nm dan panjang gelombang eksitasi ( ) = 518 nm . Intensitas absorpsi ( I1 ) =76 au dan Intensitas Fluoresensi ( I2 ) = 73 au. Stokes Shift 6 nm dan efisiensi quantum = 0,9605 au. Berdasarkan data pengukuran yang diperoleh dapat dibuat sistem eksperimen 21



percobaan untuk menetukan domain panjag gelombang untuk absorpsi dan eksitasi, dengan respon intensitas untuk spektrum absorpsi berada pada panjang gelombang antara 314,54 – 749,85. Dan respon intensitas untuk spectrum eksitasi berada pada panjang gelobang antara 451,18 – 749,85 (Lubis dkk, 2016). 5. Identifying Fluorescence Microscope Images In Online Journal Articles Using Both Image And Text Features Satu fokus khusus dari jurnal ini adalah Subselular Location Image Finder (SLIF), adalah untuk mengambil informasi tentang pola lokasi subseluler dari protein, yang utama sumbernya adalah gambar mikroskop fluoresensi (FMI). Identifikasi otomatis FMI karena itu adalah langkah penting dalam SLIF. Studi yang dibahas dalam jurnal ini adalah penggolong fusi untuk mengklasifikasikan gambar dalam literatur biologis. Pengklasifikasi dibangun di atas pengklasifikasi SVM dilatih tentang fitur gambar dan teks. Namun, FMI bukan satu dari lima kategori di Indonesia dalam menyelesaikan permasalahan ini. Titik awal untuk pekerjaan yang dijelaskan di sini adalah FMI classifier, dilatih dengan Algoritma k-Nearest Neighbor (KNN) menggunakan satu set 64-bin fitur histogram gambar. Pengklasifikasi dilatih angka dan diekstraksi dari file PDF di PubMed Central. Namun, berdasarkan pengamatan sebelumnya classifier bekerja dengan buruk ketika diterapkan pada banyak koleksi. Presisi turun menjadi sekitar 50% dan a banyak non-FMI, terutama gambar gel, yang salah diklasifikasikan. Karena itu pekerjaan yang dijelaskan di bawah ini membahas dua tugas. Pertama adalah meningkatkan klasifikasi FMI dengan extended fitur gambar dan satu set fitur teks “kata-kata". Algoritma klasifikasi yang berbeda juga diuji untuk mencapai hasil terbaik dan yang kedua adalah



menentukan



apakah



penggunaan



dari



algoritma



co-training



untuk



22



mengeksploitasi



data



yang



tidak



berlabel



dapat



meningkatkan



kinerja



(Hua dkk, 2017). Sebelumnya, histogram 64-bin dinormalisasi pada piksel gambarintensitas digunakan untuk mengidentifikasi FMI. Fitur-fitur ini membedakan FMI, yang biasanya memiliki latar belakang yang gelap dan benda-benda terang kecil, dari umum lainnya tipe gambar seperti plot atau grafik. Namun, mereka gagal katakan perbedaan antara FMI dan gambar gel, yang memiliki distribusi yang sangat mirip dalam histogram gambar. Oleh karena itu deteksi ditambahkan ke set fitur karena fakta nyata bahwa gambar gel biasanya memiliki tepi yang kuat dan tepi ini memiliki orientasi horizontal atau vertikal (Hua dkk, 2017).



Gambar 10. Perbandingan mikroskop fluoresensi dan gambar gel. Panel kiri adalah FMI dari sel CHO sementara panel kanan menunjukkan gambar gel. Dengan keempat algoritma yang kami gunakan, presisi meningkat ketika fitur gambar dan teks digunakan. Hasil terbaik adalah akurasi keseluruhan 88,6% ketika SVM digunakan untuk gambar dan teks fitur dan presisi dan daya ingat adalah 85,3% dan 85,1% masing-masing. Pertukaran antara presisi dan recall adalah ditunjukkan pada table di bawah. Ini juga menunjukkan ketepatan dan daya ingat sistem sebelumnya.



23



BAB III PENUTUP



3.1 Kesimpulan 1. Kompenen Spektroskopi Fluoresensi terdiri dari sumber cahaya (biasanya xenonatau lampu merkuri), sebuah monokromator / atau filter untuk memilih panjanggelombang eksitasi; tempat sampel; detektor, yang mengubah cahaya yangdipancarkan ke listrik sinyal, dan unit untuk pembacaan data dan analisis.  2. Manfaat dari spektroskopi fluoresensi yaitu : a. Identifikasi bahan b. Industri c. Kesehatan d. Ilmu pangan dan Kimia Pertanian



24



DAFTAR PUSTAKA



Hua, J.,Ayasli, O.N., Cohen, W.W., dan Murphy, R.F., 2017, Identifying Fluorosensi Microsope Images in Online Journal Articles Using Both Image and Text Features, Jurnal Biomedical, 42(1): 44- 49. Khopkar, S. M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta. Lubis, A.M., Perangin-angin, B., dan Nasruddin, 2016, Studi tentang Pengamatan Fluorosensi Berdasarkan Domain Panjang Gelombang pada Spektroskopi Fluorosensi untuk Identifikasi Bahan, Jurnal Agrium, 20(1): 303-308. McDougall, M., Fransisco, O., Harder-Viddal, C., Rosho,R., Heide, F., Sidhu, S., Khajehpour, M., Leslie, J., Palace, V., Tommy, G., dan Stefeld, J., 2018, Proteinaceous Nano container Encapsulate Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, Scientific Reports, 2019(9): 1-10. Naresh, K., 2014, Applications of Fluorescence Spectroscopy, Journal of Chemical and Pharmaceutical Sciences, 5(1): 18-21. Tan, M., Liang, W., Luo, X., dan Yunqiong Gu, 2014, Fluorescence Spectroscopy Study on the Interaction between Evodiamine and Bovine Serum Albumin, Journal of Chemistry, 13(1): 1-6. Tania, L., Sitepu, E.S., dan Harahap, Y., 2016, Validasi Metode Analisis Ofloksasin dalam Plasma In Vitro secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi-Fluoresensi Mengacu pada European Medicines Agency Guideline, Pharm Sci Res, 3(2): 61-71. Skoog, D.A., D.M. West, dan F.J. Holler. 1996. Fundamental of Analytical chemistry. 7th ed. Sauders College Publishing.



25