Laporan Praktikum Pewarnaan Gram (30juni) [PDF]

Citation preview

1



BAB I PENDAHULUAN



1.1 Latar Belakang Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008). Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram positif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang negatif berwarna merah (Jawetz, 2005). Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram (Anonim, 2011).



1.2 Tujuan - Untuk melihat bentuk (morfologi) bakteri. - Untuk melihat reaksi atau sifat pewarnaan gram dari bakteri.



2



BAB II TINJAUAN PUSTAKA



2.1 Sejarah Pengecatan Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan dalam air dan diperlihatkan di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras dengan medium disekelilingnya. Beberapa zat yang digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Dalam pewarnaan mikroba, dapat digunakan satu jenis warna, cara ini disebut pewarnaan sederhana. Zat-zat warna yang biasa digunakan untuk pewarnaan bekteri dapat dibedakan atas beberapa golongan yaitu: pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan strukturan dan pewarnaan untuk menguji adanya komponen tertentu di dalam sel (Anonim, 2007). Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Anonim, 2011).



2.2 Pewarnaan Gram Karakteristik taksonomi penting bakteri adalah reaksi mereka terhadap pewarnaan gram. Pewarnaan gram menjadi penting karena reaksi gram berhubungan dengan sifat morfologi lain dalam bentuk hubungan filogenik. Organisme yang berpotensi gram positif mungkin hanya dapat dilihat dengan pewarnaan gram pada kondisi lingkungan yang sesuai dan pada biakan muda. Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian pewarna basa, kristal violet. Larutan iodine



3



kemudian ditambahkan semua bakteri akan diwarnai biru pada fase ini. Sel kemudian diberi alkohol. Sel gram positif akan tetap mengikat senyawa kristal violet-iodine, tetap berwarna biru sel gram negatif warnanya hilang oleh alkohol. Sebagai langkah terakhir, counterstain (misalnya Safranin pewarna merah) ditambahkan, sehingga sel gram negatif yang tidak berwarna, akan mengambil warna kontras; sedangkan sel gram positif terlihat dalam warna biru (Jawetz, 2001). Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme.



Morfologi



mikroskopik



mikroorganisme



yang



diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam yang masing-masing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda, yaitu: 1. Cat Gram A Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme



target.



Pada



saat



diberi



cat



ini,



semua



mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A (Anonim, 2011). 2. Cat Gram B Cat Gram B berwarna coklat. cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat) (Anonim, 2011). 3. Cat Gram C Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat



sebelumnya.



Akibat



pemberian



cat



C



akan



terjadi



2



kemungkinan yang pertanama mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat



4



dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif. Sedangkan bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif (Anonim, 2011). 4. Cat Gram D. Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan yang pertama bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D. Sedangkan yang kedua bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D (Anonim, 2011). Pengecatan gram mempunya kelebihan dimana pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaanyang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. Selain itu kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nanah) uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore. Disamping itu pengecatan gram juga mempunyai kekurangan dimana pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu



5



untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis (Anonim, 2011). Untuk memberi ciri pada berbagai kelompok bakteri perlu dipahami bahwa semua ciri tidak sama pentingnya bagi semua kelompok. Sebagai contoh, pereaksi pewarnaan gram penting bagi bakteri batang dan kokus tetapi bukanlah ciri pembeda bagi Spiroketa. Ada tidaknya flagella serta penataannya penting bagi beberapa kelompok sedang bagi yang lain tidak. Untuk beberapa kelompok, sifat-sifat biokimia lebih berarti daripada sifat morfologi. Karena itu, untuk mencirikan kelompok bakteri, janganlah mengharapkan adanya sifat-sifat yang sama (Peltzar,1986). Ada kalanya suatu sediaan perlu diwarnai dua kali. Setelah zat warna yang pertama (ungu) terserap, maka sediaan dicuci degnan alcohol, kemudian ditumpangi dengan zat warna yang berlainan, yaitu dengan zat warna merah. Jika sediaan itu kemudian kita cuci dengan air, lalu dengan alkohol, maka dua kemungkinan akan terjadi. Pertama, zat warna tambahan terhapus, sehingga yang menampak ialah zat warna yang asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut gram positif. Kedua, zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak nampak. Maka sediaan (bakteri) kita katakan gram negative. Adapula zat bakteri pada usia tertentu berubah dari gram positif menjadi gram negative atau sebaliknya. Bekteri



yang



demikian



itu



disebut



dengan



gram



variable



(Dwidjoseputro, 1985). Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri grampositif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan



Gram,



suatu



pewarna



penimbal



(counterstain)



ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-



6



negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Anonim, 2011). Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif



memiliki membran tunggal yang dilapisi



peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm) (Anonim, 2011). Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu: Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu : - Struktur



dinding



selnya



tipis,



sekitar



10–15mm,



berlapis



tiga/multilayer. - Dinding



selnya



mengandung



lemak



lebih



banyak



(11-22%),



peptidoglikan terdapat didalam. - lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat. - Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. - Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet. - Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. - Tidak resisten terhadap gangguan fisik. - Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat - Peka terhadap streptomisin - Toksin yang dibentuk Endotoksin (Anonim, 2011).



7



Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu: - Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. - Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat. - Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. - Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat warna seperti ungu kristal. - Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. - Lebih resisten terhadap gangguan fisik. - Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut - Tidak peka terhadap streptomisin - Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin (Anonim, 2011). Contoh bakteri gram positif



Contoh bakteri gram negatif



Sumber: “http://id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_Gram.



8



Pewarnaan gram masih merupakan salah satu prosedur yang paling banyak



digunakan untuk mencirikan banyak bakteri.



Terutama sangat berarti dari pengamatan spesimen yang diwarnai dengan pewarnaan gram dengan cepat dapat memberi petunjuk akan organisme penyebab suatu infeksi (Pelczar, 2010).



9



BAB III METODE KERJA



3.1 Alat - Objek glass - Mikroskop - Tabung reaksi - Kapas steril - Lidi kapas - Bunsen - Rak tabung - Penjepit - Pipet tetes - Rak pewarnaan



3.2 Bahan - Tissue. - NaCl steril 0,9%. - Suspensi bakteri gram positif. - Suspensi bakteri gram negatif. - Gentiant Violet. - Lugol iodine. - Aceton-alkohol. - Safranin



3.3 Cara Kerja - Dibersihkan kedua objek glass dan difiksasi di atas nyala api. - Diletakkan objek glass di atas meja, dan di beri tanda A pada objek glass pertama, dan di beri tanda B pada objek glass kedua. - Di teteskan masing-masing 1 tetes NaCl steril pada objek glass A dan objek glass B.



10



- Dipanaskan/di fiksasi jarum ose. Di tunggu hingga dingin. Lalu di ambil bakteri gram positif dengan jarum ose, dan diletakkan pada objek glass A. - Di fiksasi lagi jarum ose, di tunggu hingga kira- kira dingin, lalu diambil bakteri gram negatif dan di letakkan pada objek glass B. - Di fiksasi kedua praparat yang telah tercampur antara NaCl dengan suspensi bakteri tadidi atas nyala api bunsen hingga mengering. - Ditetesi masing-masing preparat dengan gentiant violet, ditunggu hingga 1 menit, lalu bilas dengan air mengalir. - Ditetesi lagi masing-masing preparat dengan lugol iodium, di tunggu hingga 1 menit, dan di bilas dengan air mengalir. - Kemudian di tetesi masing masing preparat dengan aceton-alkohol, di tunggu hingga 20 detik, dan di bilas dengan air mengalir. - Di tetesi lagi kedua preparat dengan safranin, di tunggu hingga 1 menit, lalu bilas kedua preparat. - Keringkan kedua preparat yang telah di bilas dengan air mengalir. - Di amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x10 dengan menambahkan oil merci.



11



BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN



4.1 Hasil Dari praktikum yang telah dilakukan, didapatkan hasil : Bakteri Staphylococcus haemoliticus



Gambar 4.1 Bakteri Gram Positif Keterangan : Warna Bakteri : Biru/unggu. Perbesaran



: 100x10 dengan menambahkan oil merci.



Bakteri



Klebsiella pneumoniae



Gambar 4.1.2 Bakteri Gram negatif. Keterangan : Warna bakteri



: merah



Perbesaran



: 100x10 dengan perbesaran oil merci.



12



4.2 Pembahasan Pewarnaan



gram



merupakan



pewarnaan



diferensial



yang



digunakan untuk membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pada pewarnaan gram ini, bakteri yang digunakan adalah bakteri Staphylococcus haemoloticus (bakteri



gram positif) , dan



bakteri Klebsiella pneumoniae (bakteri gram negatif) (Anonim, 2011). Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme.



Morfologi



mikroskopik



mikroorganisme



yang



diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam yang masing-masing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda, yaitu: 1. Cat Gram A Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme



target.



Pada



saat



diberi



cat



ini,



semua



mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A (Anonim, 2011). 2. Cat Gram B Cat Gram B berwarna coklat. cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat) (Anonim, 2011). 3. Cat Gram C Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat



sebelumnya.



Akibat



pemberian



cat



C



akan



terjadi



2



kemungkinan yang pertanama mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat



13



demikian disebut bakteri Gram positif. Sedangkan bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian



dikelompokkan



sebagai



bakteri



Gram



negatif



(Anonim,2011). 4. Cat Gram D. Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan yang pertama bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D. Sedangkan yang kedua bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D (Anonim, 2011). Adapun reaksi bakteri dalam pewarnaan gram ini, yaitu sebagai berikut : Reaksi Bakteri Larutan & Urutan Penggunannya



Gram (+)



Gram (-)



1.Kristal violet



Sel berwarna ungu



Sel berwarna ungu



2. Lugols iodine



Kompleks KV-Y



Kompleks KV-Y



terbentuk dalam sel,



terbentuk dalam sel,



sel tetap berwarna



sel tetap berwarna



ungu.



ungu



14



3.Aceton-alkohol



Dinding sel dehidrasi.



Lipid terekstraksi dari



Pori-pori menciut, daya dinding sel, pori-pori rembes dinding sel dan mengembang,Kompl membran KV-Y tidak eks KV-Y keluar dari dapat keluar dari sel. sel sehingga



sehingga



sel menjadi



tetap berwarna ungu.



sel tidak



berwarna (lipid larut dalam alkohol).



4.Safranin



Sel tidak terpengaruh, Sel tetap ungu.



menyerap



zat



warna tersebut, dan menjadi merah.



Dari hasil praktikum yang telah dilakukan, bakteri Staphylococcus haemolitikus bersifat gram positif yang berarti bakteri dapat mengikat dengan kuat cat utama cristal violet berwarna ungu, pada saat bakteri Gram positif ditambahkan dengan kristal violet maka gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding sel, dengan pemberian larutan lugol maka kristal violet akan masuk sampai ke inti sel, pemberian alkohol menyebabkan pori-pori dinding sel mengecil sehingga warna ungu tertahan di dalam sel disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid (Anonim, 2011). Sedangkan bakteri Klebsiella pnoumoniae bersifat gram negative karena tidak dapat mengikat kuat cat utama gentiant violet dan dapat diwarnai oleh cat lawan yakni merah dari pewarna safranin (Anonim, 2011). Adapun



kesalahan-kesalahan



yang



terjadi



dalam



praktikum



pewarnaan gram, yaitu : - Kesalahan dalam pengecatan bakteri / penecatan yang terlalu tebal sehingga bakteri sulit untuk diamati. - Pemberian zat warna tidak sesuai prosedur dll.



15



BAB V PENUTUP



5.1 Kesimpulan Berdasarkan praktikum yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa : - Pewarnaan gram merupakan teknik pewarnaan diferensial yang digunakan untuk membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna. - Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah karena tidak dapat mengikat kuat gentiant violet dan dapat diwarnai oleh cat lawan yakni merah dari pewarna safranin. - Bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu. bakteri dapat mengikat dengan kuat cat utama cristal violet berwarna ungu.



5.2 Saran - Saran



untuk



laboratorium



agar



praktikum



berikutnya



keanekaragaman bakteri yang digunakan dapat bertambah lagi sehingga hasil yang diperoleh dapat bervariasi.



16



DAFTAR PUSTAKA



Anonim, 2011. Pewarnaan gram http ://id. Wikipedia.org/wiki/ pewarnaan_gram Diakses tanggal 27 juni 2011. Dwidjoseputro, D. 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Malang Jawetz, E, J.L. Melnick, dan E.A. Adelberg. 2005. Mikrobiologi kedokteran. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta. Jimmo., 2008, http ://pembuatan preparat dan pengecatannya _ blog kita. Diakses pada tanggal 26 juni 2011, Makasar. Pelczar Michael .J. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. 2010. UI. Press. Jakarta.